徐 軍，楊美林，仲崇琳

(吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院·吉林 長(zhǎng)春 130012)

白楊素(chrysin)化學(xué)名稱為5,7-二羥基黃酮(結(jié)構(gòu)見圖1)，是一種在自然界中常見的黃酮類化合物，以蜂蜜和蜂膠中含量較高。白楊素具有抗菌、抗敏、抗炎、抗氧化等廣泛的藥理活性[3]，在臨床上的應(yīng)用以抗炎和抗癌活性居多，但由于其水溶性和脂溶性較差，很少在腸道內(nèi)吸收，且其5、7位羥基易被糖基化而使之活性降低[4]，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來對(duì)白楊素的結(jié)構(gòu)修飾主要集中在A環(huán)的C-6位和C-8位上，且8位的親核活性高于6位，理論上，C-8位更易發(fā)生取代或成環(huán)反應(yīng)[5-6]。Mannich堿類化合物具有抗癌、降血壓、抗炎等多種生物學(xué)活性[7]。向同一分子引入不同活性基團(tuán)可能會(huì)改變其生物活性[5]。因此，本文設(shè)想向白楊素C-8位引入Mannich堿基團(tuán)，合成多個(gè)白楊素Mannich堿衍生物，并測(cè)定其抗敏活性。

圖1 白楊素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

本實(shí)驗(yàn)以天然產(chǎn)物白楊素為起始原料，在甲醛和二甲基甲酰胺溶液條件下，與多種胺類發(fā)生Mannich反應(yīng)[8-9]，得到目標(biāo)化合物1a～1d，合成路線如圖2所示。

圖2 目標(biāo)化合物的合成路線

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡雄性Wistar大鼠130只，體質(zhì)量 170～185 g，購于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號(hào)：SCXK-(遼)2015-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 孟魯司特鈉片：購自于杭州默沙東制藥有限公司，批號(hào)：M04924；白楊素：上海優(yōu)純生物科技有限公司，批號(hào)：180724。卵白蛋白(OVA)：北京鼎國(guó)昌盛分裝，批號(hào)：080M1705V；瑞氏-姬姆薩染色液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：417031；ELISA檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20160401)、免疫球蛋白(IgE)、大鼠白三烯(LT)、組胺(His)：加拿大Biowen生物公司；所有合成相關(guān)試劑均為分析純級(jí)別。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 X-4數(shù)字顯示熔點(diǎn)儀：北京天地宇科技有限公司；Bruker Avance-400核磁共振儀：瑞士Bruker公司，以TMS為內(nèi)標(biāo)；Quattro Premier XE高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Waters公司；柱層析和薄層層析硅膠：青島海洋化工廠；680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀：美國(guó)BIO-RAD公司；顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 目標(biāo)化合物1a～1d的合成通法 將磁力攪拌子放入微波反應(yīng)專用瓶，向其中加入2.54 g(10 mmol)白楊素、加入二甲基甲酰胺50 mL使其溶解，分別加入不同體積的哌嗪反應(yīng)物1.71 mL(15 mmol)，再加入37%甲醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù))1.23 mL(15 mmol)，混合均勻。微波反應(yīng)條件為300 W、45 ℃、1 h，得反應(yīng)液；將反應(yīng)液冷卻至室溫，加50 mL水和100 mL乙酸乙酯提取，無水硫酸鈉脫水，乙酸乙酯液減壓蒸干，殘?jiān)尤氡獰崛埽覝胤胖?，沉淀物用丙酮重結(jié)晶得化合物1a-1d。

8-(4-甲基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1a)：淺黃色結(jié)晶，產(chǎn)率：55.87%，m.p.161～163；1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz):δ2.33 (s, 3H, -CH3), 2.71 (s, 8H, piperazine-H), 4.01 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.28 (d, 1H,J=3.3 Hz, -CO-CH=), 6.63 (d, 1H,J=3.3 Hz, Ar-H), 7.53-7.58 (m, 3H, Ar-H), 7.81-7.83 (m, 2H, Ar-H), 12.18 (s, 1H, -OH), 12.71 (s, 1H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz):δ45.84, 52.64, 53.69, 54.74, 98.43, 100.02, 100.17, 104.65, 105.73, 126.05, 129.17, 131.51, 131.77, 154.69, 161.56,063.04, 182.29.ESI-MS ([M+H]+): 367。

8-(4-乙基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1b)：淺黃色結(jié)晶，產(chǎn)率：70.12%，m.p.161～163；1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz):δ1.10 (t, 3H,J=5.4 Hz, -CH3), 2.46 (q, 2H,J=5.4 Hz, -CH2CH3), 2.74 (s, 8H, piperazine-H), 4.01 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.29 (s, 1H, -CO-CH=), 6.63 (s, 1H, Ar-H), 7.51-7.56 (m, 3H, Ar-H), 7.81-7.83 (m, 2H, Ar-H), 11.90 (s, 1H, -OH), 12.71 (s, 1H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz):δ12.05, 52.06, 52.42, 52.73, 53.76, 98.48, 99.99, 100.20, 104.69, 105.76, 126.05, 129.18, 131.55, 131.78, 154.70, 161.60, 163.04, 165.71, 182.34.ESI-MS ([M+H]+): 381。

8-(4-異丙基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1c)：黃色結(jié)晶，產(chǎn)率：69.41% ；m.p.163～165；yield %.1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz): δ 1.05 (s, 3H, -CH3), 1.07 (s, 3H, -CH3), 2.65-2.75 (s, 8H, piperazine-H), 3.99 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.26 (s, 1H, -CO-CH=), 6.60 (s, 1H, Ar-H), 7.52-7.54 (m, 3H, Ar-H), 7.79-7.82 (m, 2H, Ar-H), 12.63 (s, 2H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz): δ 18.53, 48.29, 53.06, 53.77, 54.34, 98.52, 100.00, 100.16, 104.65, 105.71, 126.03, 129.16, 131.53, 131.76, 154.67, 161.57, 163.00, 165.77, 182.32.ESI-MS ([M+H]+): 395。

8-(4-叔丁基哌嗪-1-甲基)-5,7-二羥基-2-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(1d)：黃色結(jié)晶，產(chǎn)率：55.01%，m.p.164～166；1H-NMR (CD3Cl, 300 MHz): δ 1.09 (s, 9H, -C(CH3)), 2.73 (s, 8H, piperazine-H), 4.00 (s, 2H, -N-CH2-Ar), 6.29 (s, 1H, -CO-CH=), 6.63 (s, 1H, Ar-H), 7.52-7.56 (m, 3H, Ar-H), 7.80-7.83 (m, 2H, Ar-H), 11.56 (s, 1H, -OH), 12.70 (s, 1H, -OH).13C-NMR (CD3Cl, 75 MHz): δ 25.93, 45.55, 53.43, 53.73, 98.54, 100.00, 100.22, 104.71, 105.78, 126.06, 129.18, 131.59, 131.78, 154.72, 161.64, 163.02, 165.82, 182.41.ESI-MS ([M+H]+): 409。

2.2 大鼠體內(nèi)抗敏活性測(cè)試

2.2.1 建模與給藥[10-13]將130只大鼠隨機(jī)分為13組(正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、孟魯司特組、白楊素及白楊素衍生物1a～1d高、低劑量組)，分別于第0天和第14天給予大鼠一次性腹腔注射含1 mg OVA和10 mg Al(OH)3的生理鹽水1 mL；第15天，開始采用1% OVA生理鹽水霧化吸入激發(fā)哮喘，每天1次，20 min/次，連續(xù)7 d，復(fù)制過敏性哮喘大鼠模型。正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。給予OVA霧化后10 min內(nèi)出現(xiàn)喘促、咳嗽等呼吸道痙攣梗阻癥狀即表示造模成功。各組于致敏前1 h至末次誘導(dǎo)哮喘前1 h每天灌胃給藥1次，正常對(duì)照組及模型對(duì)照組給予等體積5% Tween-80水溶液。

2.2.2 觀察指標(biāo)及測(cè)定

2.2.2.1 外周血IgE和LT、His檢測(cè) 大鼠末次霧化激發(fā)后24 h，腹腔注射300 mg·kg-1水合氯醛進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心10 min取上清，各組隨機(jī)選取8個(gè)樣本，按ELISA試劑盒說明書操作，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm的吸光度值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算全血IgE、His、LT含量。

2.2.2.2 全血EOS計(jì)數(shù)[14]制作全血涂片，采用瑞氏-姬姆薩染色法，鏡下對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)200個(gè)白細(xì)胞中嗜酸性粒細(xì)胞所占百分?jǐn)?shù)，按下列公式計(jì)算：嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量(EOS計(jì)數(shù))=全血白細(xì)胞數(shù)×嗜酸性粒細(xì)胞%。

2.2.2.3 BALF中EOS計(jì)數(shù)[15]大鼠腹主動(dòng)脈采血后處死，消毒后打開胸腔，左側(cè)肺支氣管插管，緩慢注入D-Hanks液5 mL，停留10 s，緩慢抽回，重復(fù)3次，合并回收液約4 mL，注入消毒試管，1 500 r/min離心15 min后取少量白細(xì)胞沉淀制作涂片，按全血方法進(jìn)行白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，剩余沉淀用4 mL生理鹽水稀釋，鏡下進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)，按全血方法計(jì)算嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量。

2.2.2.4 肺組織病理觀察 大鼠采血后處死，取其右下肺組織(未經(jīng)灌洗)甲醛固定，蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行染色，鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)過敏性哮喘大鼠血清IgE、LT、His含量的影響 模型對(duì)照組大鼠血清IgE、LT、His含量與正常對(duì)照組大鼠相比明顯增高，其它不同組分灌胃給藥的大鼠同模型組相比，有不同程度降低，其中白楊素衍生物1a～1d作用均優(yōu)于白楊素，結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清IgE、LT、His含量比較

3.2 對(duì)過敏性哮喘大鼠全血、BALF中EOS計(jì)數(shù)的影響 模型對(duì)照組大鼠全血和BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組大鼠相比明顯增高；與模型對(duì)照組相比，白楊素衍生物1a、1b、1d可明顯減少全血及BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量，而1c作用不明顯，結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠全血、BALF中EOS計(jì)數(shù)比較

3.3 對(duì)過敏性哮喘大鼠肺組織病理形態(tài)的影響 正常對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡壁薄，肺泡腔透亮，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，且肺泡支氣管黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整清晰。模型對(duì)照組可見炎性細(xì)胞的肺泡、肺泡囊、肺泡管顯著變小，肺間質(zhì)增生顯著，肺泡支氣管黏膜上皮細(xì)胞排列紊亂，成片脫落。白楊素衍生物1a～1d和白楊素組，與模型組相比肺泡壁有不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，少量肺泡擴(kuò)張，中小支氣管內(nèi)滲出物，黏膜上皮脫落及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，整體上炎癥面積明顯減小。

4 討論

IgE在過敏性哮喘的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，當(dāng)過敏原首次進(jìn)入體內(nèi)時(shí)，通過樹突細(xì)胞(dendritic cell)的呈遞從而引發(fā)一系列炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)：Th2細(xì)胞誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生大量IgE抗體及炎癥因子(如IL-4、IL-9等)，IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE高親和力受體結(jié)合形成復(fù)合物。當(dāng)過敏原再次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，即可迅速與上述復(fù)合物結(jié)合，導(dǎo)致His、LT、前列腺素等炎癥介質(zhì)大量釋放，引起黏液的分泌、氣道平滑肌收縮、血管通透性增高等反應(yīng)。特異性的IgE分子還可以與樹突狀細(xì)胞結(jié)合，加強(qiáng)其抗原呈遞作用，上調(diào)肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE高親和力受體的表達(dá)[16-17]。此外，過敏性哮喘的特征性指標(biāo)之一表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞增多，且許多研究表明哮喘的嚴(yán)重性與氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。LT在上下呼吸道的炎癥中起重要作用，在誘導(dǎo)鼻過敏性反應(yīng)方面，其強(qiáng)度比His強(qiáng)1 000多倍。在變態(tài)原誘導(dǎo)的鼻過敏反應(yīng)中，在速發(fā)型或遲發(fā)型超敏反應(yīng)階段，LT的數(shù)量均明顯增加。哮喘患者粒細(xì)胞釋放LT的數(shù)量要高于正常人，所以說LT是引起過敏性哮喘的關(guān)鍵物質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)通過向白楊素的C-8位引入Mannich堿基團(tuán)，合成4個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的白楊素衍生物，提高了部分生物活性。再以Al(OH)3和OVA和為抗原，致敏和激發(fā)大鼠過敏性哮喘模型，通過測(cè)定特異性IgE、全血及BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量以及白三烯變化情況，對(duì)白楊素及4種白楊素衍生物的抗過敏性哮喘活性進(jìn)行篩選。結(jié)果表明，模型組大鼠的血清IgE、白三烯含量明顯增高，全血及BALF中白細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量明顯增高，肺組織病理切片顯示肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥面積明顯增加。而通過一定劑量的白楊素及其衍生物給藥治療后，上述指標(biāo)表現(xiàn)出不同程度的降低，說明白楊素衍生物1a～1d和其起始產(chǎn)物白楊素可明顯降低大鼠血清IgE、His及白三烯含量，其中白楊素衍生物1a-1d作用明顯優(yōu)于天然產(chǎn)物白楊素；白楊素衍生物1a、1b、1d可明顯減少全血及BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量；肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，新化合物能夠明顯縮小肺組織炎癥面積，綜合各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)，活性強(qiáng)弱次序?yàn)椋喊讞钏匮苌?b>白楊素衍生物1c>白楊素衍生物1d>白楊素衍生物1a>白楊素。