鄭軍狀，董靜波，陳 湛，張 堯，陳偉偉，裘 磊

(慈溪市中醫(yī)醫(yī)院·浙江 慈溪 315300)

慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis,CNP)是泌尿男科的常見病、多發(fā)病，多呈現(xiàn)慢性化，因炎癥、疼痛、精神神經(jīng)癥狀往往互為因果，形成惡性循環(huán)，致使臨床治療難以獲效[1]。中醫(yī)藥因具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，在治療慢性非細(xì)菌性前列腺炎中有較大的應(yīng)用空間[2]，從歷代古方中進(jìn)一步挖掘中醫(yī)藥治療本病的中醫(yī)內(nèi)涵是重點(diǎn)開發(fā)領(lǐng)域之一；當(dāng)歸貝母苦參丸即是其中較為有前景的方劑之一，有較好的抗炎效應(yīng)[3]。在目前對CNP尚缺乏理想的臨床藥物治療時，努力探索中醫(yī)藥治療慢性前列腺炎顯得十分迫切和可行。近年的研究表明氧化應(yīng)激在前列腺炎引起的神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮重要作用[4-5]。本文以此為切入點(diǎn)，探究加味當(dāng)歸貝母苦參丸治療CNP的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級2月齡雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量(240±20)g，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物許可證號: SCXK(滬) 2018-0008，委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心采購并飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室許可證號SYXK(浙)2018-0012。室溫控制在21～25 ℃，相對濕度為40%～70%，12 h光暗循環(huán)，嚙齒類動物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(由動物中心提供)喂飼，自由飲水、攝食，定期清潔和消毒。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 加味當(dāng)歸貝母苦參丸藥由當(dāng)歸10 g、苦參10 g、浙貝母20 g、虎杖20 g、敗醬草10 g、臺烏藥15 g、三七粉3 g等中藥組成，均購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)濱江門診部，水煎濃縮至含生藥量1.2 g/mL藥液，滅菌后置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?、中、高劑量分別臨用時配制成含生藥為0.3、0.6、1.2 g/mL。前列倍喜膠囊(由豬鬃草、王不留行、皂角刺、刺猬皮、螻蛄等組成)：貴州太和制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z20025028，生產(chǎn)批號：20060203；臨用時配制成0.16 g生藥/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 蘇木素染液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司；伊紅染液：珠海貝索生物技術(shù)有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒：南京建成生物工程研究所；8-epi PGF2a酶免試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。百白破疫苗：武漢生物制品研究所；弗氏完全佐劑(FCA乳劑)：美國 Sigma公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 光學(xué)顯微鏡：日本Olympus optical Ltd；ASP200S全自動脫水機(jī)：德國Leica公司；RM2235石蠟切片機(jī)：德國Leica公司；G1150H加熱石蠟包埋系統(tǒng)：德國Leica公司；HI120型攤片機(jī)：德國Leica公司；CMaxPlus酶標(biāo)儀：美國MolecularDevices公司；610020-9Q化學(xué)發(fā)光儀：上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；DS-U3數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)：日本NIKON(尼康)公司。

2 方法

2.1 動物分組 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只，即正常對照組，模型組，加味當(dāng)歸貝母苦參丸組低、中、高劑量組及前列倍喜膠囊陽性對照組。

2.2 動物模型建立 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按相關(guān)文獻(xiàn)及項(xiàng)目前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)制備前列腺蛋白提純液[6-7]，建立CNP大鼠模型。采取腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，用1‰新潔爾滅消毒下腹部皮毛，正常對照組除外，其他各組均采用下述方法造模。大鼠乙醚麻醉，腹腔注射百白破疫苗0.5 mL，多點(diǎn)皮內(nèi)注射大鼠前列腺蛋白提純液和FCA乳劑(比例為1:1的混懸液)1.0 mL。前列腺蛋白濃度為15 g/L。正常對照組分別行腹腔及皮內(nèi)多點(diǎn)注射同劑量生理鹽水注射液；以上各組均分別于0、30 d 2次注射，30 d后即可形成CNP模型。

2.3 給藥方法及樣本處理 造模后普通飼養(yǎng)，30 d后給藥。正常對照組和模型組均予生理鹽水灌胃；加味當(dāng)歸貝母苦參丸各組給予水煎劑，3、6、12 g/kg灌胃；陽性對照組給予前列倍喜膠囊混懸液1.6 g/kg灌胃；灌胃體積均為1 mL/100 g體重。各組均每天1次，給藥時間為4周。

2.4 觀察指標(biāo) 給藥結(jié)束后，禁食不禁水12 h，麻醉后快速取出前列腺組織及L6～S1脊髓待測，脫頸處死各組大鼠。

2.4.1 前列腺組織病理學(xué)觀察 前列腺組織樣本置入4%多聚甲醛溶液中，將樣本和對應(yīng)標(biāo)簽放于脫水盒內(nèi)，酒精梯度脫水，蠟塊包埋，切片，二甲苯脫蠟，蘇木精染色，酒精分化，沖洗，無水乙醇脫水，經(jīng)伊紅染色，二甲苯透明，中性樹脂固封，通過顯微鏡觀察拍照(200倍和400倍鏡下觀察)。

2.4.2 L6-S1脊髓組織及神經(jīng)節(jié)(DRG)氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測 將凍存的前列腺及L6-S1脊髓組織樣本于37 ℃水浴解凍，稱取一定量的組織，加9倍的生理鹽水置入勻漿機(jī)中充分勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，ELISA檢測8-epi PGF2a含量；采用黃嘌呤氧化酶法測定T-SOD活力。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠前列腺組織病理學(xué)觀察 正常對照組可見前列腺組織腺體周圍無分散淋巴細(xì)胞，細(xì)胞界限清晰，胞膜無增生；模型組前列腺組織淋巴細(xì)胞浸潤嚴(yán)重，腺體上皮組織被破壞，胞膜簇狀增生，胞漿顏色加深，細(xì)胞界限不清；給藥組前列腺組織，有不同程度的淋巴細(xì)胞增多聚集，腺體上皮組織破壞，胞膜增生，細(xì)胞形態(tài)損傷，其中前列腺組織形態(tài)完整度由高到低為，陽性對照組>高劑量組>中劑量組>低劑量組。見圖1。

圖1 各組大鼠前列腺組織病理學(xué)觀察(HE，×200)

3.2 各組大鼠DRG 8-epi PGF2a含量及T-SOD活力的檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠DRG8-epi PGF2a含量及T-SOD活力比較

3.3 各組大鼠脊髓組織8-epi PGF2a含量及T-SOD活力檢測結(jié)果 見表2。

表2 各組大鼠脊髓組織8-epi PGF2a含量及T-SOD活力比較

4 討論

慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic nonbacterial prostatitis，CNP)是以慢性盆腔疼痛及排尿異常為主，伴有或不伴有性功能障礙、精神神經(jīng)癥狀的一類綜合征。關(guān)于CNP的病因和發(fā)病機(jī)制，既往多認(rèn)為是由未知的病原微生物所引起的感染性炎癥，然而Lee等[8]2003年的一項(xiàng)研究并不支持感染致病的觀點(diǎn)，國內(nèi)也有研究認(rèn)為前列腺組織中病原體的檢出與CNP癥狀無病因?qū)W相關(guān)[9]。因此，近年來普遍認(rèn)為，本病可能是不涉及病原微生物的非感染性炎癥，包括物理因素造成的前列腺慢性長期充血、尿液返流引起的化學(xué)性炎癥、氧化應(yīng)激作用增強(qiáng)、自身免疫異常和細(xì)胞因子失調(diào)等因素，導(dǎo)致了前列腺組織淤血、缺氧、水腫、變性、纖維化等慢性炎癥改變[10]。

在NIH制訂的慢性非細(xì)菌性前列腺炎癥狀評分指數(shù)中，疼痛列為首要癥狀。CP/CPPS疼痛在神經(jīng)調(diào)控方面有兩個顯著的特點(diǎn)，即疼痛的泛化性和持續(xù)性[11]。疼痛呈現(xiàn)出典型的內(nèi)臟牽涉痛特點(diǎn)，即疼痛不僅僅限于前列腺所在部分，而且分布在整個膀胱尿道神經(jīng)支配相關(guān)的骶神經(jīng)支配區(qū)。脊髓背角是疼痛調(diào)節(jié)初級整合中樞，初級感覺傳入神經(jīng)位于脊髓背神經(jīng)節(jié)，將外周的感覺信號傳入脊髓背角的初級感覺神經(jīng)元。

目前，有研究認(rèn)為氧化應(yīng)激可能是前列腺炎(特別是Ⅲ型)發(fā)病的因素之一[4-5]，大量臨床研究發(fā)現(xiàn)患有前列腺炎患者的前列腺液或精液中甚至血漿中的8-異前列腺素(8-epi PGF2a)、一氧化氮(NO)等高于非前列腺炎組患者，而抗氧化物質(zhì)，如超氧化物歧化酶、谷光甘肽、維生素C等顯著下降或活性降低[12-14]。氧化應(yīng)激(OS)就是指體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧(ROS)或體內(nèi)抗氧化和/或ROS清除劑水平的減退，導(dǎo)致二者之間的平衡被打破，從而引起炎癥或組織損害[15]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：ROS在神經(jīng)病理性疼痛過程中發(fā)揮重要的作用，ROS清除劑如PBN、維生素E、依達(dá)拉奉等均可緩解神經(jīng)病理性疼痛動物模型的行為學(xué)表現(xiàn)[15-16]。有研究認(rèn)為前列腺內(nèi)長時間的氧化應(yīng)激可能誘發(fā)脊髓中樞發(fā)生繼發(fā)性的氧化應(yīng)激加劇，后者致敏中樞神經(jīng)，從而易化疼痛的傳導(dǎo)、維持和泛化。這可能是前列腺炎疼痛具有慢性、持續(xù)性、難治性及疼痛位置多變性等特點(diǎn)的根本原因[17]。一方面前列腺氧化應(yīng)激可以引起脊髓中樞的氧化損傷，另一方面前列腺炎癥產(chǎn)生的自由基及ROS，能激活脊髓中樞，引起痛覺神經(jīng)元興奮性提高。臨床中CP/CPPS患者的往往存在頑固的疼痛，即使在前列腺炎其他癥狀消失后，疼痛仍可持續(xù)存在，推測脊髓中樞調(diào)控異?？赡軈⑴c了CP/CPPS疼痛的發(fā)生、泛化及維持[18-20]。現(xiàn)有研究已經(jīng)證實(shí)前列腺痛的相關(guān)初級神經(jīng)中樞位于L5～S2脊髓節(jié)段[21]。

當(dāng)歸貝母苦參丸即是慢性前列腺炎中醫(yī)藥古方挖掘研究中較為有前景的方劑之一，當(dāng)歸貝母苦參丸方出自《金匱要略》“妊娠，小便難，飲食如故，當(dāng)歸貝母苦參丸主之。當(dāng)歸貝母苦參丸方：當(dāng)歸、貝母、苦參各四兩，男子加滑石半兩。上三味，末之，煉蜜丸如小豆大，飲服三丸，加至十丸”。其中，當(dāng)歸活血潤燥；浙貝母清熱散結(jié)，且能開宣肺氣，寓提壺揭蓋之意；苦參利濕熱，除熱結(jié)，與浙貝母合用，又能清肺而散膀胱瘀熱。加味當(dāng)歸貝母苦參丸，在此基礎(chǔ)上加虎杖、敗醬草清下焦?jié)駸?，臺烏藥行氣止痛，三七粉活血化瘀、通絡(luò)止痛。合而用之，契合CNP氣機(jī)不暢，濕熱瘀阻的特點(diǎn)，使?jié)駸崛?、血脈通、瘀結(jié)散。在CBP(慢性細(xì)菌性前列腺炎)大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸貝母苦參煎劑能顯著降低CBP大鼠全血黏度；顯著升高CBP大鼠前列腺組織SOD活性、降低MDA含量；顯著下調(diào)ICAM-1的表達(dá)；顯著升高IL-2含量和降低IL-8含量；能顯著減少TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)[22]。

本研究發(fā)現(xiàn)CNP模型大鼠前列腺組織炎癥明顯，加味當(dāng)歸貝母苦參丸對CNP模型大鼠前列腺組織有較好的抗炎作用；進(jìn)一步檢測脊髓組織的氧化狀態(tài)，模型組脊髓組織存在明顯氧化應(yīng)激狀態(tài)，檢測脊髓組織及DRG中8-異前列腺素(8-epiPGF2a)含量，加味當(dāng)歸貝母苦參丸組能明顯減輕其氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能是通過提高T-SOD活性而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示加味當(dāng)歸貝母苦參丸能夠減輕CNP模型大鼠前列腺組織組織形態(tài)學(xué)損傷，改善脊髓組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能是其減輕炎癥及疼痛癥狀的作用機(jī)制之一。