劉東亮 馬秀嵐

中耳膽脂瘤是一種由過度增殖的角質(zhì)化鱗狀上皮構(gòu)成的囊性非腫瘤性病變，目前其發(fā)病機制仍存在爭議[1]，較為公認的是內(nèi)陷袋學(xué)說，該學(xué)說認為中耳腔負壓引起鼓膜內(nèi)陷并形成囊袋是膽脂瘤形成的始發(fā)因素[2～5]。負壓會造成鼓室內(nèi)重要通氣結(jié)構(gòu)(如鼓峽、咽鼓管上隱窩)狹窄而引起鼓室內(nèi)缺氧[6]，而長期的缺氧可以引起一系列的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]，其產(chǎn)物約95%為活性氧(reactive oxygen species，ROS)。

正常細胞內(nèi)的ROS保持在低水平狀態(tài)，現(xiàn)在認為低水平的ROS是維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常生理功能的關(guān)鍵因子[8]；但在某些因素剌激下，如：缺氧、炎癥刺激、紫外線或電離福射等，ROS會過量產(chǎn)生，引起細胞過度增殖或者凋亡等[9]。ROS及其相關(guān)信號傳導(dǎo)通路上的蛋白在多種疾病甚至癌癥中均呈現(xiàn)出表達異常[10]，在ROS參與的各種生物信號通路中，磷酸肌醇-3 激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)調(diào)節(jié)途徑與ROS的關(guān)系最為密切[11]，但在中耳膽脂瘤中卻鮮有相關(guān)研究。本研究擬通過免疫熒光技術(shù)及Western blot免疫印跡法檢測中耳膽脂瘤組織和正常皮膚中ROS及磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,P-AKT)的表達，并分析它們之間的相關(guān)性，探討其在中耳膽脂瘤形成機制中所起的作用，旨在為中耳膽脂瘤的診斷、治療提供參考。

1 資料與方法

1.1中耳膽脂瘤標本及正常皮膚取材 收集2019年9～12月在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院耳鼻咽喉科手術(shù)治療的中耳膽脂瘤標本25例，其中，男19例，女6例；年齡15～69歲，平均41.33±25.67歲；左耳8例，右耳17例；病程2～31年，平均16.50±11.33年，術(shù)后均經(jīng)病理診斷為中耳膽脂瘤。同時收集行耳廓腫物切除術(shù)患者安全切緣處正常皮膚或行鼓膜修補術(shù)中廢棄及不能使用的耳后正常皮膚碎塊15例作為對照組(術(shù)前已告知患者同意并簽署知情同意書)，其中，男8例，女7例；年齡21～60歲，平均35.80±20.21歲；左耳9例，右耳6例；病程1～26年，平均13.53±10.33年。

1.2研究方法

1.2.1免疫熒光技術(shù)檢測ROS表達 將中耳膽脂瘤及正常皮膚組織冰凍切片復(fù)溫，晾干水分，多聚甲醛固定10 min，待多聚甲醛完全干后于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min。組織切片置于盛滿EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH8.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)，低火10 min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min(修復(fù)液和修復(fù)強度根據(jù)組織來確定)，切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，甩干PBS，滴加BSA，封閉30 min。在切片上用ROS熒光探針-二氫乙啶(Dihydroethidium, DHE)染色，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))，玻片置于PBS(pH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。切片于熒光顯微鏡下觀察采集圖像(CY3激發(fā)波長510～560，發(fā)射波長590 nm，發(fā)紅光)并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件(Me-dia Cybernetics, Inc., 美國)進行半定量分析。

ROS冰凍切片免疫熒光實驗結(jié)果判讀：因為ROS不是基因蛋白，只需用ROS熒光探針-二氫乙啶(Dihydroethidium, DHE)染色即可，無需加二抗，直接封片即可；在熒光顯微鏡下呈紅色。

1.2.2Western blot免疫印跡法檢測P-AKT蛋白的表達 ①提取蛋白：將100 mg組織標本置于1～2 ml勻漿器中，用剪刀(無菌)將組織盡量剪碎。加400 μl單去污劑裂解液裂(含PMSF)于勻漿器中，進行勻漿；之后置于冰上。5分鐘后再次碾碎置于冰上，重復(fù)幾次使組織盡量碾碎。裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至2 ml離心管中，然后在4 ℃下12 000 rpm左右離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并在-20℃保存。用時取出，直接溶解上樣。②電泳:依據(jù)目的蛋白的分子量，配制10%SDS-PAGE膠跑垂直電泳，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，保持每孔45 μg蛋白上樣，先采用電壓90 V，1小時濃縮樣品蛋白，再采用電壓120 V、100 min電泳分離樣品蛋白。③轉(zhuǎn)膜:電泳結(jié)束后，PVDF膜先后要在純甲醇里浸泡10 min，去離子水中浸泡20 min，接著將海綿、濾紙、凝膠和PVDF膜一起放在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10 min，按照“海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿”的順序裝放好轉(zhuǎn)膜裝置(膜靠正電極一邊)，按恒壓100 V電轉(zhuǎn)移120 min到PVDF膜上。④封閉和一抗孵育:用5%脫脂奶粉(日常生活中的即可)常溫下封閉搖床1.5小時，PBS液洗膜3次，每次15 min，隨后加入按說明書要求稀釋的P-AKT和內(nèi)參GAPDH抗體，于4 ℃孵育過夜。⑤二抗孵育:TBST液洗膜3次，每次15 min，加入二抗，室溫下?lián)u床2小時。⑥顯影:TBST液洗膜3次，每次15 min，用ECL顯色液顯色，定影液終止顯色。⑦各實驗重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料比較用兩樣本t檢驗，運用Pearson檢驗進行P-AKT和ROS表達之間的相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1ROS在中耳膽脂瘤和正常皮膚中的表達 在熒光顯微鏡下，ROS在膽脂瘤和正常皮膚的細胞核著色，ROS在膽脂瘤中的熒光強度明顯強于其在正常皮膚的強度(圖1)，兩者的平均熒光值分別為112.41±14.61和15.23±1.97，可見膽脂瘤組的平均熒光值明顯高于正常皮膚組(t=3.24,P<0.01)。

2.2Western blot免疫印跡法檢測P-AKT在膽脂瘤和正常皮膚的表達 Western blot免疫印跡法顯示，P-AKT在中耳膽脂瘤組細胞中表達明顯高于正常皮膚組細胞中的表達(圖2)，兩者的相對灰度值分別為0.95±0.08和0.41±0.07，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.04,P<0.05)。

2.3ROS和P-AKT在中耳膽脂瘤中表達的相關(guān)性 應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，ROS和P-AKT在中耳膽脂瘤中的表達呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.508(P<0.01)。

3 討論

ROS廣泛存在于各種組織細胞中，當環(huán)境發(fā)生改變時，如：缺氧、炎性刺激等，細胞的線粒體便可產(chǎn)生過量的ROS[9]，而ROS過量會對組織的生物功能帶來一系列的改變。最近研究顯示，ROS具有促進調(diào)亡和促進增殖的雙重作用，在急性劇烈的氧化反應(yīng)或者急性炎癥時，ROS可導(dǎo)致細胞調(diào)亡甚至壞死[12]；但隨著應(yīng)激反應(yīng)時間的延長，慢性氧化應(yīng)激可促進細胞的生長。Isnaini等[13]通過研究乳腺癌細胞系MCF-7中的氧化劑和抗氧化劑特性及其與作用時間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，使用過氧化氨模擬氧化應(yīng)激分別干預(yù)24 h和5天，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24 h后氧化抑制劑通過ROS可抑制MCF-7細胞的生長，而5天后ROS則促進MCF-7細胞的生長。提示慢性氧化應(yīng)激或慢性炎癥反應(yīng)中，ROS逐漸趨于誘導(dǎo)細胞增殖、血管新生及腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。

在中耳炎的氧化應(yīng)激相關(guān)研究中，Gar?a等[14]發(fā)現(xiàn)通過血清氧化應(yīng)激值可以評估慢性化膿性中耳炎的氧化應(yīng)激程度；Guo等[15]通過芹菜素抑制氧化應(yīng)激的實驗發(fā)現(xiàn)兒童急性化膿性中耳炎患者中，隨著ROS表達的減少，炎癥程度和骨質(zhì)破壞的程度也隨之減輕。中耳膽脂瘤的發(fā)生發(fā)展是一個長期的過程，不屬于急性炎癥，而且其在明顯的缺氧環(huán)境中形成，加上之前ROS雙重作用的研究，結(jié)合本研究結(jié)果中ROS和P-AKT在膽脂瘤中表達均較正常皮膚高，推測ROS在中耳膽脂瘤形成過程中主要起到促進細胞增殖的作用。

磷酸化的AKT被認為是一種與細胞增殖密切相關(guān)的因子，本研究結(jié)果顯示在中耳膽脂瘤中ROS和P-AKT均過量表達，且呈顯著的正相關(guān)性，推測在中耳膽脂瘤的形成過程中，ROS通過AKT信號通路發(fā)揮了促進細胞增殖的作用。結(jié)合之前在其他組織細胞中ROS/AKT通路的研究[11]，和之前對于中耳膽脂瘤磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatese and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)的研究[16]，推測在鼓室乳突腔長期缺氧的情況下，上皮細胞產(chǎn)生了大量的ROS，這些ROS定位于細胞核，可滅活同在細胞核中的PTEN蛋白。PTEN主要作用是抑制3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(3,4,5-phosphatidyl inositol phospate，PIP3)的合成來活化PI3K，而PI3K負責磷酸化AKT[17]，這樣在中耳膽脂瘤形成過程中，細胞的PTEN明顯減少，PI3K失去抑制而增多，增多的PI3K磷酸化AKT,使P-AKT增多，這與本研究的結(jié)果一致。磷酸化的AKT才具有生物活性[18]，可以激活或抑制其下游的作用底物，達到促進細胞增殖的作用，如P-AKT可使Bad 的Ser136 發(fā)生磷酸化，使其失去抗凋亡作用，促進細胞增殖[19]；P-AKT導(dǎo)致FoxO 蛋白磷酸化，使得細胞增殖和凋亡之間的平衡被打破，促進細胞生長，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[20]等。

綜上所述，在中耳膽脂瘤的形成過程中，ROS表達明顯增多，通過減弱PTEN對PI3K/AKT通路的抑制，使細胞中P-AKT增多，從而起到促進細胞增殖的作用。