胡一勇 石敏 楊風(fēng)波 呂萍 蔣晴晴 袁碩龍 張悅 楊仕明 于寧

脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白1和4(fatty acid transport protein，F(xiàn)ATP1，F(xiàn)ATP 4)對長鏈脂肪酸具有高度親和力而參與各類組織和器官的脂肪酸攝取、轉(zhuǎn)運[1, 2]。既往研究發(fā)現(xiàn)豚鼠耳蝸Hensen細(xì)胞含有大量脂滴——中性脂肪酸[3]，但是其轉(zhuǎn)運體FATP1和/或FATP4是否在耳蝸內(nèi)表達(dá)并參與耳蝸脂肪酸代謝從而調(diào)節(jié)耳蝸功能目前少有研究。少量研究[4,5]發(fā)現(xiàn)噪聲暴露會導(dǎo)致豚鼠耳蝸Hensen細(xì)胞分泌脂滴以及小鼠耳蝸Hensen細(xì)胞高度降低，提示脂肪酸因噪聲等因素在耳蝸內(nèi)被轉(zhuǎn)運。據(jù)此本研究采用中高強度白噪聲長時間刺激耳蝸建立噪聲性耳聾動物模型，并使用提高FATP表達(dá)、促脂肪酸β-氧化的藥物苯扎貝特干預(yù)[6]，試圖提高耳蝸內(nèi)FATP表達(dá)，以促進(jìn)Hensen細(xì)胞分泌脂滴，然后觀察噪聲及藥物干預(yù)前后脂肪酸轉(zhuǎn)運體1和4在耳蝸的變化，從而探索耳蝸內(nèi)脂肪酸以及FATP1、FATP4與噪聲性聽力損失的關(guān)系，為進(jìn)一步探討脂肪酸代謝調(diào)節(jié)耳蝸功能的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 健康成年雄性Dunkin Hartley豚鼠21只，體重250～300 g，耳廓反射靈敏，購自北京市科宇動物養(yǎng)殖中心，動物實驗許可證號SYXK(川)2018-18。將21只聽力正常豚鼠隨機分為對照組15只(30耳)、干預(yù)組6只(12耳)。

1.2主要試劑和設(shè)備 主要試劑：苯扎貝特(sigma，B7273)、Mouse Anti-FATP1 primary antibody(Abcam，ab69458)、Rabbit Anti-FATP4 primary antibody(Invitrogen，PA5-42446)、Rabbit Anti-Myosin 7a primary antibody(Abcam，ab3481)、Goat Anti-mouse Alexa Fluor 555(Abcam， ab150114)、 Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 647(Abcam，ab150083)、特異性脂肪酸探針Nonpolar BODIPY Probes 493/503(Invitrogen，D-3922)，封閉用山羊血清(absin，abs933a)、0.01M PBS、4%組織細(xì)胞固定液(CoolabeR SL1830)、Triton X-100(sigma，9002-93-1)、10% EDTA(Coolaber SL-3070)，二甲基亞砜(Coolaber，CD4731)；Mouse Anti-Beta-actin primary antibody(Affinity，T0022)，山羊抗兔IgG(H + L) HRP(ZSGB-BIO，ZB-2301)、山羊抗鼠IgG(H + L) HRP(ZSGB-BIO，ZB-2305)、RIPA Lysis Buffer(康為世紀(jì)，CW2334)、BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒(普利萊，P1511)、Super ECL Plus 超敏發(fā)光液(普利萊，P1010)。

主要設(shè)備及耗材：解剖顯微鏡(Olympus，日本)、共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)、TDT測聽儀器(TDT III設(shè)備，美國)、電泳儀(Tanon VE-180)、轉(zhuǎn)膜儀(Tanon VE-186)、凝膠成像儀(賽智 610C)、顯微鑷、組織剪、3 ml塑料滴管等。

1.3聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 對照組及干預(yù)組分別在開始噪聲暴露前及暴露后的第6天、第12天、第24天進(jìn)行ABR檢測。用1%戊巴比妥鈉麻醉豚鼠，連接TDT電極：記錄電極從耳廓前緣連線中點進(jìn)針植入顱頂皮下，參考電極植入測試耳乳突部皮下,接地電極植入對側(cè)耳乳突部皮下。耳機置于測試耳外耳道口0.2 cm處。采用Biosig32 軟件系統(tǒng)檢測豚鼠短聲(click)、短純音(tone burst)(4、8、16 kHz)ABR反應(yīng)閾。刺激聲強度設(shè)定為90 dB SPL，按10 dB遞減，在接近反應(yīng)閾時刺激聲強度遞減間隔為5 dB，以能分辨出可重復(fù)的ABR波Ⅲ的最低刺激強度為閾值。

1.4噪聲性聾動物造模 噪聲暴露前隨機選取對照組3只(6耳)豚鼠進(jìn)行耳蝸取材作為正常對照。然后將對照組其余12只(24耳)和干預(yù)組6只(12耳)豚鼠置于50 cm×30 cm×25 cm的籠內(nèi)，每只豚鼠之間用隔板隔開，揚聲器置于籠的上方，控制豚鼠活動范圍內(nèi)的聲強相差不大于2 dB，使用110 dB白噪聲連續(xù)暴露12天、每天4小時；干預(yù)組在開始噪聲暴露同時予以苯扎貝特(5 mg·kg-1·d-1)灌胃干預(yù)。

1.5耳蝸冰凍切片制作 對照組在噪聲暴露后第12、24天進(jìn)行耳蝸取材，干預(yù)組在第24天取材。用1%戊巴比妥鈉麻醉豚鼠，待其進(jìn)入深度麻醉狀態(tài)后，立即斷頸處死；快速取出耳蝸，置于4%多聚甲醛溶液中。在體視顯微鏡下用顯微鑷挑開窩尖，撕破圓窗膜，再輕輕將鐙骨推入卵圓窗；用3 ml移液管從蝸尖挑開處緩慢灌入4%多聚甲醛，可見淡黃色淋巴液自卵圓窗及圓窗流出，重復(fù)灌流2～3次；再將灌流后耳蝸浸泡于4%多聚甲醛(4 ℃)過夜。隨后將耳蝸放入10% EDTA脫鈣液中脫鈣5～7天；脫鈣的耳蝸用15%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液梯度脫水各2 h后，置于OTC膠中浸膠2 h，最后換用新鮮OTC膠冷凍(-20 ℃，2 h)包埋。使用冰凍切片機切片，厚度選擇12 μm，組織芯片直接貼于帶正電荷的載玻片上，最后將切片置于-20 ℃冰箱保存待用。

1.6熒光染色 將耳蝸冰凍切片用PBS快速漂洗三次后，用0.25% Triton X-100處理30 min，滴加10%羊血清封閉非特異性抗原(37 ℃，2 h)，吸去血清，滴加一抗稀釋液(FATP1，1∶100；FATP4，1∶100；Anti-Myosin 7a，1∶400)，4 ℃孵育過夜，陰性對照用PBS代替一抗。吸去一抗，PBS溶液洗三次，每次5 min，滴加二抗稀釋液(Goat Anti-mouse Alexa Fluor 555，1∶400；Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 647，1∶400)及脂肪酸特異性探針(Nonpolar BODIPY Probes，0.01 mg/ml)，37 ℃避光孵育1 h，吸去二抗，PBS溶液洗三次，每次15 min，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核10 min，PBS溶液洗去DAPI，甘油封片。每張熒光染色標(biāo)本均在Leica SP8激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察FATP1、FATP4在耳蝸基底膜的表達(dá)情況以及脂肪酸的分布情況，并采集圖像。

1.7Western blot檢測 按分組與時間點隨機選取豚鼠，豚鼠麻醉后斷頭，迅速取下聽泡，用止血鉗夾掉前庭并盡量去除耳蝸周邊骨質(zhì)，以一個耳蝸作為一個樣本，碾磨耳蝸，加入裂解液提取蛋白，按BCA法檢測蛋白濃度，配制分離膠為12%、濃縮膠濃度為5%。每個樣本蛋白上樣總量約30 μg，先恒壓80 V，待蛋白樣本進(jìn)入到分離膠后，改為恒壓120 V，直到目的蛋白跑到合適位置(通過觀察預(yù)染蛋白Marker)。轉(zhuǎn)膜條件：全濕轉(zhuǎn)，恒壓為100 V，60～120 min。將PVDF膜取出浸泡于甲醇中15 s，加入5%牛奶(in 1X TBST)封閉液，室溫封閉2 h。將PVDF膜轉(zhuǎn)入用5%牛奶(in 1X TBST)溶液稀釋的一抗溶液中，4 ℃過夜孵育(FATP1，1∶500；FATP4，1∶1 000；Anti-Beta-actin，1∶3 000)。1X TBST洗三次，每次8 min。將洗好的膜放入5%牛奶(in 1X TBST)溶液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液中(山羊抗兔，1∶4 000；山羊抗鼠，1∶4 000)，室溫孵育1 h。用TBST洗三次，每次7 min。取ECL超敏發(fā)光液A、B，將A、B取相同體積混勻，孵于膜上，避光反應(yīng)1 min。將膜置于凝膠成像儀中進(jìn)行檢測。凝膠圖像分析：將所得圖片用Image J軟件分析目的條帶灰度值。最后以FATP1(FATP4)/actin表示FATP1(FATP4)的相對表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計學(xué)方法 采用Image J測量耳蝸切片熒光強度及Western blot條帶灰度值。各組計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1噪聲暴露前后各組ABR反應(yīng)閾比較 對照組、干預(yù)組豚鼠噪聲暴露前后ABR反應(yīng)閾見表1、2。噪聲暴露后6、12～24天，對照組短聲ABR反應(yīng)閾無明顯差異(F=3.04，P>0.05)，但均高于噪聲暴露前(P<0.01)，表明噪聲性聾動物模型成功建立。噪聲暴露后第6、12天，干預(yù)組短聲ABR反應(yīng)閾與對照組無明顯差異(t=-0.14，P>0.05)(t=1.00，P>0.05)，但第12天干預(yù)組4、8 kHzABR反應(yīng)閾較對照組明顯下降(t=6.46，P<0.05)(t=3.53，P<0.05)。在噪聲暴露后24天，干預(yù)組4 kHz反應(yīng)閾基本恢復(fù)到噪聲暴露前水平(t=-0.71，P>0.05)。

表1 噪聲暴露前及暴露后6、12、24天對照組豚鼠click-ABR和tb-ABR反應(yīng)閾

2.2熒光染色觀察結(jié)果

2.2.1脂滴在豚鼠耳蝸的分布 正常豚鼠耳蝸內(nèi)脂類物質(zhì)主要分布于Corit器外側(cè)的Hensen細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋(圖1)。

表2 噪聲暴露前及暴露后6、12、24天干預(yù)組豚鼠click-ABR和tb-ABR反應(yīng)閾

2.2.2噪聲暴露前、后豚鼠耳蝸內(nèi)FATP1、FATP4表達(dá)變化 噪聲暴露前FATP 1主要表達(dá)于Corti器(圖2a、c)、螺旋唇(圖2a、d)，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、螺旋韌帶、血管紋等少量表達(dá)；噪聲暴露后第12天FATP 1主要表達(dá)于Corti器、齒間細(xì)胞，略齒細(xì)胞、螺旋突、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(圖2b)。熒光定量分析結(jié)果提示，F(xiàn)ATP 1在全耳蝸表達(dá)較噪聲暴露前增加，其中在Corti器、Hensen細(xì)胞、螺旋突、螺旋韌帶表達(dá)明顯增加(P<0.01)，在螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋表達(dá)有所增加(P<0.05)，但是在螺旋唇表達(dá)降低(P<0.05)(圖3)。

噪聲暴露前FATP 4主要表達(dá)于耳蝸Corti器及螺旋韌帶(圖4a)，但Corti外側(cè)的Hensen細(xì)胞(圖4b)、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋極少表達(dá)或不表達(dá)；噪聲暴露后，干預(yù)組和對照組FATP4在耳蝸的表達(dá)分布一致，主要表達(dá)于耳蝸Corti器及其外側(cè)的Hensen細(xì)胞、螺旋韌帶、螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋唇(圖4c、d、e、f)。熒光定量分析顯示，各組FATP 4在全耳蝸(F=8.32，P<0.05)、Corti器(F=393.88，P<0.05)的表達(dá)均存在差異，其中對照組(第12天)和干預(yù)組(第24天)FATP4在Hensen細(xì)胞、螺旋唇、螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)均較噪聲暴露前明顯增加(P<0.01)；FATP4在耳蝸側(cè)壁組織表達(dá)變化存在差異，干預(yù)組(第24天)FATP4在螺旋突、螺旋韌帶的表達(dá)均較噪聲暴露前及對照組(第12天)降低(P<0.05),在血管紋的表達(dá)增加(P<0.05)，對照組(第12天)FATP4在血管紋的表達(dá)較噪聲暴露前及干預(yù)組(第24天)明顯降低(P<0.01)(圖5)。

2.3Western blot檢測結(jié)果 各組豚鼠耳蝸內(nèi)均有FATP1、FATP4表達(dá)(圖6a)，噪聲暴露前后FATP1和FATP4在耳蝸內(nèi)的表達(dá)均有一定差異(FATP1：F=8.54，P<0.01；FATP4：F=10.79，P<0.01)。在噪聲暴露后第12天FATP1(0.53±0.01，較噪聲暴露前(0.15±0.10)明顯上調(diào)(t=-5.36，P<0.01)，干預(yù)組噪聲暴露后第24天FATP1(0.69±0.10)較噪聲暴露前(0.15±0.10)明顯上調(diào)(t=-7.60，P<0.01)，但較對照組噪聲暴露后第24天(0.49±0.26)無明顯差異(t=-1.50，P>0.05)。對照組噪聲暴露后第12天FATP4(0.67±0.09)較噪聲暴露前(0.14±0.07)明顯上調(diào)(t=-9.49，P<0.01)，噪聲暴露后干預(yù)組第24天FATP4(0.73±0.15)較噪聲暴露前(0.14±0.07)明顯上調(diào)(t=-7.20，P<0.01)，但較對照組第24天(0.601±0.27)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.85，P>0.05)(圖6b)。

3 討論

聽覺感受器細(xì)胞(外毛細(xì)胞和內(nèi)毛細(xì)胞)由內(nèi)柱、外柱、Deiter、Hensen和Claudius等支持細(xì)胞支撐坐落在耳蝸內(nèi)基底膜上，其中有“耳蝸放大器”[9]之稱的外毛細(xì)胞主要感受聲音(85%的微音電位來自外毛細(xì)胞)，一方面將機械的聲波轉(zhuǎn)換為膜電位，另一方面在膜電位形成的同時使外毛細(xì)胞收縮伸展，產(chǎn)生主動放大作用，使聲音放大，具有雙向放大作用，這是大量耗能的過程[3]。同樣具有舒縮功能的心肌細(xì)胞所需的大量能量主要由脂肪酸β-氧化提供[8]，所以，外毛細(xì)胞極有可能存在與心肌細(xì)胞相同的能量代謝方式。而耳蝸內(nèi)淋巴中葡萄糖濃度僅為0.6 mmol/L，鼓階外淋巴葡萄糖濃度為3.6 mmol/L，前庭階外淋巴葡萄糖濃度為3.8 mmol/L[9,10]，提示淋巴液中的糖可能不足以給耳蝸外毛細(xì)胞舒縮及時提供足夠的能量支持。因此，早在二十世紀(jì)五十年代就有學(xué)者提出在聽覺器官受刺激的過程中，為了獲得營養(yǎng)和氧氣，毛細(xì)胞必須有一個高度發(fā)達(dá)的營養(yǎng)輔助系統(tǒng)，其中含有大量脂滴并且能提供大量脂肪酸[3]的Hensen細(xì)胞可能是主要營養(yǎng)細(xì)胞之一[11]。

既往研究[12]發(fā)現(xiàn)小鼠耳蝸有脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding prote，F(xiàn)ABP)表達(dá)，其中心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白[H(heart-type)-FABP]主要表達(dá)于耳蝸的外柱細(xì)胞、內(nèi)柱細(xì)胞、外指細(xì)胞，腦型脂肪酸結(jié)合蛋白[B(Brain-type)-FABP]主要表達(dá)于耳蝸的Hensen細(xì)胞、內(nèi)指細(xì)胞、內(nèi)柱細(xì)胞。雖然尚不清楚FABP在不同耳蝸支持細(xì)胞群中的功能，但極可能是FABP通過影響支持細(xì)胞的脂肪酸環(huán)境來調(diào)控毛細(xì)胞的功能。Suzuki等[13]通過觀察FABP3(H-FABP)基因敲除小鼠的聽力變化特點，沒有證明FABP 3在耳蝸的功能，僅發(fā)現(xiàn)耳蝸功能還受其他FABP的代償作用影響，而沒有表現(xiàn)出聽力損失；表明FABP可能是調(diào)節(jié)耳蝸功能的重要蛋白因子。而FATP是促進(jìn)長鏈和極長鏈脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞的完整跨膜蛋白[14]，同樣是決定脂肪酸能否進(jìn)出細(xì)胞參與一系列生物學(xué)反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白家族之一[15]。細(xì)胞及組織的脂肪酸代謝水平則受FATP、FABP等蛋白因子的共同影響。

本研究初步驗證了豚鼠耳蝸脂類物質(zhì)主要分布于基底膜外側(cè)的Hensen細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)、血管紋。噪聲暴露前，F(xiàn)ATP 1主要表達(dá)于Corti器、齒間細(xì)胞、略齒細(xì)胞；FATP 4主要表達(dá)于耳蝸Corti器及螺旋韌帶，但Corti器外側(cè)的Hensen細(xì)胞極少表達(dá)或不表達(dá)；提示FATP1、FATP4在正常豚鼠耳蝸內(nèi)的分布存在組織特異性。文中結(jié)果顯示噪聲暴露前后FATP 1和FATP 4在豚鼠耳蝸的表達(dá)均存在明顯差異，在噪聲暴露后第12天時，對照組FATP1、FATP4表達(dá)較正常對照的豚鼠顯著增加(P<0.05)，而之后FATP1、4均維持在一定的高水平，提示噪聲損傷可提高耳蝸內(nèi)FATP1和FATP4的表達(dá)。

從文中結(jié)果看，噪聲及苯扎貝特干預(yù)可使FATP 1和FATP 4在耳蝸內(nèi)的表達(dá)變化存在部位差異，對照組FATP1在Corti器、Hensen細(xì)胞、螺旋突、螺旋韌帶表達(dá)較噪聲暴露前明顯增加；而對照組(第12天)和干預(yù)組(第24天)FATP4在Hensen細(xì)胞、螺旋唇、螺旋神經(jīng)節(jié)的表達(dá)均較噪聲暴露前明顯增加，并且FATP4在耳蝸側(cè)壁組織表達(dá)變化存在差異，即干預(yù)組(第24天)FATP4在螺旋突、螺旋韌帶的表達(dá)均較噪聲暴露前及對照組(第12天)降低，在血管紋的表達(dá)增加，而對照組(第12天)FATP4在血管紋的表達(dá)較噪聲暴露前及干預(yù)組(第24天)明顯降低。血管紋含有豐富的血管組織，有旺盛的物質(zhì)轉(zhuǎn)運、能量轉(zhuǎn)換等功能[16]，苯扎貝特是提高脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)、促脂肪酸β-氧化的藥物[6]，在給予噪聲暴露的同時給予苯扎貝特干預(yù)，很可能通過分別提高FATP1以及FATP4在上述耳蝸局部組織的表達(dá)，并且通過FATP 1和FATP 4的相互代償、補足，共同促進(jìn)血管紋和/或Hensen細(xì)胞向毛細(xì)胞轉(zhuǎn)運脂肪酸，為毛細(xì)胞的主動運動提供能量物質(zhì)，從而防止噪聲性聽力損失。但是對照組(第12天)FATP4在血管紋的表達(dá)較噪聲暴露前明顯降低，很可能造成耳蝸內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運失代償而不能維持耳蝸毛細(xì)胞在噪聲暴露下的正常功能，從而造成聽力損失。豚鼠耳蝸內(nèi)Hensen細(xì)胞脂滴主要分布于耳蝸第三、四回基底膜(低中頻聽力)，可以提供豐富的脂肪酸，但是Hensen細(xì)胞脂滴在第一、二回基底膜(高頻聽力)分布較少[3]，這可能也是本研究中干預(yù)組在噪聲暴露后第12天聽力開始恢復(fù)并且4、8 kHz聽力損失恢復(fù)較對照組快、而對照組及干預(yù)組16 kHz聽力難以恢復(fù)的重要原因。

文中結(jié)果表明噪聲暴露可提高FATP1和FATP4在豚鼠耳蝸局部組織的表達(dá)水平，從而促進(jìn)耳蝸內(nèi)脂肪酸轉(zhuǎn)運；促脂肪酸代謝藥物(苯扎貝特)干預(yù)可進(jìn)一步改變FATP4在耳蝸的表達(dá)分布，從而在一定程度上防止噪聲性聽力損失或促進(jìn)噪聲性聽力損失恢復(fù)。本研究為進(jìn)一步探索耳蝸脂肪酸代謝調(diào)節(jié)耳蝸功能的機制提供了實驗依據(jù)，被轉(zhuǎn)運的脂肪酸具體通過何種機制改善噪聲性聽力損失還需進(jìn)一步研究。