王旭 彭潔 朱延松 楊勝男 張曉楠 余洪 江東 梁大成

摘要 [目的]用17對SSR引物對68份柚類種質(zhì)資源進行遺傳背景研究，推演其親緣關(guān)系，為更好地利用這68份材料提供參考。[方法]17對SSR引物進行PCR擴增;用 Power Marker V3.25軟件計算觀測等位變異數(shù)（Na）、有效等位變異數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）和引物多態(tài)信息含量（PIC）;用 Ntsys2.0 計算材料間的遺傳距離并進行聚類;用Structure2.3.4推導(dǎo)群體遺傳結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]17對引物擴增出62條多態(tài)性條帶，平均為3.647 0條。計算得出這62個多態(tài)性標(biāo)記位點的平均等位變異數(shù)Na為3.470 6 ，平均有效等位變異數(shù)Ne為2.152 3 ，平均觀測雜合度Ho為0.454 2 。平均期望雜合度He和香農(nóng)多樣性指數(shù)I分別為0.481 0和0.848 2，多態(tài)信息含量（PIC）平均值為0.419 8。在遺傳距離0.36處將材料分成5個類群，結(jié)構(gòu)分析中將材料分成4個組群，聚類分析和結(jié)構(gòu)分析結(jié)果基本一致。[結(jié)論]所選材料具有豐富的遺傳多樣性，聚類和結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果能直觀地了解這68份材料的親緣關(guān)系，并對其中可能的同物異名品種進行篩選。

關(guān)鍵詞 柚;SSR分子標(biāo)記;親緣關(guān)系

中圖分類號 Q943? 文獻標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）04-0100-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.04.027

Analysis of Genetic Relationship of 68 Pummelo Germplasm Resources Based on SSR Molecular Marker

WANG Xu1，PENG Jie2，ZHU Yan-song2 et al （1.School of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025;2.Citrus Research Institute of Southwest University，Chongqing 400712）

Abstract [Objective] 17 pairs of SSR primers were used to study the genetic background of 68 pummelo germplasm resources and deduced their genetic relationship，so as to provide reference for better use of these 68 materials. [Method]17 PCR amplification was performed on SSR primers; Power Marker V3.25 software was used to calculate the observed allelic variance （Na），effective allelic variance （Ne），observed heterozygosity （Ho），expected heterozygosity （He ），Shannon diversity index （I） and primer polymorphism information content （PIC）; use Ntsys2.0 to calculate the genetic distance between materials and clustering; use Structure 2.3.4 to derive population genetic structure. [Result]The 17 pairs of primers amplified 62 polymorphic bands，with an average of 3.647 0 bands. It is calculated that the average allelic variance Na of the 62 polymorphic marker loci is 3.470 6，the average effective allelic variance Ne value is 2.152 3，and the average observed heterozygosity Ho value is 0.454 2. The average expected heterozygosity He value and Shannon diversity index I value are 0.481 0 and 0.848 2，respectively. The average PIC value of polymorphic information content is 0.419 8. The material was divided into 5 groups at the genetic distance of 0.36，and the material was divided into 4 groups in the structure analysis. The results of cluster analysis and structure analysis were basically the same. [Conclusion]The selected materials have rich genetic diversity，and the results of clustering and structural analysis can intuitively understand the genetic relationship of these 68 materials，and filter possible synonymous varieties among them.

Key words Pummelo;SSR molecular marker;Genetic relationship

基金項目 國家重點研發(fā)計劃子課題“果樹優(yōu)質(zhì)高效品種篩選及配套栽培技術(shù)研究”（2019YFD1001400）。

作者簡介 王旭（1993—），男，重慶人，碩士研究生，研究方向：作物遺傳育種。通信作者，江東，副研究員，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事果樹資源與遺傳育種研究;梁大成，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事濕地作物遠緣嫁接技術(shù)研究。

收稿日期 2020-10-14;修回日期 2020-11-02

柚是柑橘屬基本種之一，在柑橘中具有重要的生物學(xué)地位，同時在中國柑橘產(chǎn)業(yè)上也占有重要的經(jīng)濟地位[1]。中國是柚類的原產(chǎn)國和主要栽培國之一，根據(jù)《禹貢》的記載，柚在我國已有 4 000 多年的栽培歷史[2]。柚多以實生繁殖，且多為單胚，在不同的地理環(huán)境下長期的自然變異和遺傳育種產(chǎn)生了豐富的可遺傳變異品種，形成了豐富多樣的種質(zhì)資源[3]。人類的社會活動過程會導(dǎo)致不同地域之間的品種交流，但在引種栽培過程中，由于天然的雜交或者人為因素可能會造成品種混亂，同一品種在不同區(qū)域可能會有不同的名稱，這給種質(zhì)資源的保存和利用帶來不便。引種過程一般是通過枝條嫁接，但是單從葉片表型很難判斷出具體的品種，加上柑橘類果樹的童期較長，短時間內(nèi)也很難得到果實，在此期間，如果品種錯亂，將會造成人力和財力損失，因此從分子水平上對品種進行鑒定以及親緣關(guān)系的推演顯得極為重要。簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記技術(shù)，其特點是等位基因變異數(shù)多、多態(tài)性高，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，呈共顯性遺傳，是果樹上鑒定種質(zhì)資源、分析遺傳多樣性及親緣關(guān)系應(yīng)用中最為廣泛的分子標(biāo)記[4]。由于SSR分子標(biāo)記不受植物生長時期以及環(huán)境因素的影響，所以以其為基礎(chǔ)的聚類分析能更好地反映品種間的親緣關(guān)系。Ahmed等[5]用60對SSR引物篩選出26對具有多態(tài)性位點的引物對來自印度的14份柚類種質(zhì)

資源進行分析，發(fā)現(xiàn)雖然它們有很高的形態(tài)差異性，但是在分子標(biāo)記上表現(xiàn)出較低的遺傳多樣性，因為這14份資源全是來自體細胞變異的品種。Kongsri等[6]用10對SSR引物估算了泰國南部、中部和北部的商業(yè)品種和雜交品種之間的遺傳距離，共產(chǎn)生33個等位基因，預(yù)期雜合性和多態(tài)性信息含量的平均值分別為0.52和0.45，結(jié)果顯示泰國本地柚比商業(yè)品種有更高的遺傳多樣性。來自土耳其的學(xué)者用SSR分子標(biāo)記將柚和葡萄柚進行了區(qū)分[7] 。劉勇等[8]用31對引物從122份柚類材料中檢測到335個等位基因變異，用UPGMA方法將122份材料分成7個亞群，18個小的組群，其結(jié)果分布主要呈沙田柚、文旦柚以及龐大的柚雜種群這三大類型。雷天剛等[9]從105對SSR引物中篩選出5對引物，組合成2組引物構(gòu)建了沙田柚、琯溪蜜柚、晚白柚、強德勒柚、梁平柚的特征指紋圖譜。劉冬峰等[10]用23對引物對浙江地方柚的遺傳多樣性進行研究，篩選出4對引物組合構(gòu)建柚種質(zhì)鑒定圖，能對18份柚進行準(zhǔn)確鑒定。國家果樹種質(zhì)重慶柑橘圃新引種一批柚類種質(zhì)資源，尚未結(jié)果，從樹形和葉形上難以對其親緣關(guān)系準(zhǔn)確判斷。該試驗用17對SSR引物對68份柚類種質(zhì)資源進行遺傳背景研究，推演其親緣關(guān)系，以期為更好地利用這68份材料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 供試的68份材料，包括64份柚、4份葡萄柚，均采自國家果樹種質(zhì)重慶柑橘圃，供試材料名稱見表1。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取。

采集68份材料的成熟葉片，利用改良CTAB法提取樣品DNA[11]，用NanoDrop 2000分光光度計測量其DNA濃度并統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL備用，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.2.2 SSR引物合成。參試引物來自李益等[12]報道的17對柑橘品種鑒定的SSR引物，引物由北京六合華大基因有限公司合成，引物信息見表2。

1.2.3 PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×Taq PCR MasterMix（擎科生物公司）10 μL，正、反向引物（1 μmol/L）各0.5 μL，DNA樣品100 ng，用ddH2O補足。PCR反應(yīng)程序為94 ℃ 預(yù)變性4 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán);最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。

1.2.4 聚丙烯酰胺電泳。

根據(jù)王炯[13]方法進行聚丙烯酰胺電泳，略有改動。檢測合格的DNA用對應(yīng)引物進行PCR擴增，隨后用10%聚丙烯酰胺膠進行電泳，120 V電泳3 h，用0.1%硝酸銀進行染色，1.1%氫氧化鈉顯色，然后拍照記錄。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。

條帶統(tǒng)計按01格式記錄，在相同遷移率位置的記成1，無條帶的記成0，形成01矩陣。根據(jù)不同軟件使用格式對數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換。

用 Power Marker V3.25軟件分析觀測等位變異數(shù)（Na）、有效等位變異數(shù)（Ne）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)多樣性指數(shù)（I）和引物多態(tài)信息含量（PIC）。

用 Ntsys2.0 計算材料間的遺傳距離并進行聚類。

用Structure2.3.4推導(dǎo)群體遺傳結(jié)構(gòu)[14]，使用混合模式并設(shè)定群體內(nèi)等位基因頻率相關(guān)模型進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，通過馬爾可夫鏈蒙特卡洛方法對個體基因型進行反復(fù)抽樣，從而判斷個體來源。具體操作如下：首先設(shè)定亞群數(shù)目K=[1，8]，每個K運行10次，將MCMC的不作數(shù)迭代次數(shù)設(shè)為20 000次，再將迭代后的MCMC設(shè)為20 000次，利用在線Structure Harvester（http：∥taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/）計算最佳K值，即ΔK最高時的K值。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

SSR標(biāo)記片段的分子量主要集中于200～500 bp，選取引物P13電泳圖進行展示（圖1）。試驗所用17對引物共擴增出62條多態(tài)性條帶，平均多態(tài)性條帶數(shù)為3.647 0。其中引物P22擴增出多態(tài)性條帶數(shù)最多，為6條;引物P4、P100、P190、P294擴增出多態(tài)性條帶數(shù)最少，為2條。用Power Marker V3.25軟件統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，這62個多態(tài)性標(biāo)記位點的等位變異數(shù)Na為2～5，總平均值為3.470 6;有效等位變異數(shù)Ne為1.076 2～3.504 4，總平均值為2.152 3;觀測雜合度Ho為0.044 1～1，總平均值為0.454 2;期望雜合度He為0.071 4～0.764 8，總平均值為0.481 0;香農(nóng)多樣性指數(shù)I為0.157 5～1.517 3，總平均值為0.848 2;多態(tài)信息含量（PIC）為0.068 3 ～ 0.723 0，平均PIC值為0.419 8，各引物數(shù)據(jù)見表3。

2.2 聚類分析

基于遺傳距離對68份柚類種質(zhì)資源聚類（圖2）。在遺傳距離0.36處，68份材料被分成5個類群。類群 Ⅰ 由無核沙田柚（1）、麻布文旦（6）、黃肉蜜柚（26）、紅肉蜜柚（27）、曼賽龍（48）、皋泄香柚（4）、脆香甜柚（5）、早香柚（14）等8份材料組成;類群Ⅱ由處紅柚（2）、福建文旦（56）、梁平柚（35）、虎蜜柚（36）等51份材料組成;類群Ⅲ由毛南本地柚（24）、越南小甜柚（45）組成;類群Ⅳ由越南小柚（44）、建陽橘柚（59）組成;類群Ⅴ由古巴柚（3）、星路比（19）、紅馬敘（20）、奧羅布郎柯（21）、火焰（22）組成。

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

基于SSR分子標(biāo)記的數(shù)據(jù)分析群體結(jié)構(gòu)表明，樣本的等位變異頻率特征類型數(shù)K呈折線圖，當(dāng)K=4時，△K值最大，據(jù)此將68份材料分為4個組群（圖3）。

3 討論

柑橘種間甚至屬間易發(fā)生雜交，導(dǎo)致遺傳背景復(fù)雜。該研究利用17對SSR引物對68份柚進行遺傳背景研究，比較了68份樣品的遺傳親緣關(guān)系，共檢測到62條多態(tài)性條帶，平均為3.647 0條。這62個多態(tài)性標(biāo)記位點的等位變異數(shù)Na為2～5，總平均值為3.470 6;有效等位變異數(shù)Ne為1.076 2～3.504 4，總平均值為2.152 3;觀測雜合度Ho為0.044 1～1，總平均值為0.454 2;期望雜合度He為0.071 4～0.764 8，總平均值為0.481 0;香農(nóng)多樣性指數(shù)I 為0.157 5～1.517 3，總平均值為0.848 2;多態(tài)信息含量（PIC）為0.068 3～0.723 0，平均PIC值為0.419 8。表明可以較好地揭示材料的遺傳多樣性。

從聚類分析圖和結(jié)構(gòu)圖能直觀地看出各材料間的親緣關(guān)系，可以較好地對材料遺傳背景進行預(yù)判。聚類分析結(jié)果顯示無核沙田柚（1）和麻布文旦（6）親緣關(guān)系較近，結(jié)構(gòu)分析表明無核沙田柚和麻布文旦基因型也很相似，說明無核沙田柚可能不是沙田柚類型。李先信等[15] 用SRAP分子標(biāo)記表明酸柚不能單獨成為柚分類標(biāo)準(zhǔn)，此次試驗結(jié)果酸柚（8）和梅州沙田柚（16）聚在一起，再次驗證了前人的結(jié)論。在聚類分析中，泰國暹羅低酸柚（52）和泰國柚（54）遺傳距離很近，并且都是扁圓形果形，果面光滑，低酸，推測這2個品種可能為同物異名的品種。黃肉蜜柚（26）和紅肉蜜柚（27）親緣關(guān)系較近，因為它們都是琯溪蜜柚的芽變品種[16]。前人根據(jù)表型數(shù)據(jù)進行主成分分析，顯示墊江柚系列與沙田柚的親緣關(guān)系較近[17]，此次研究結(jié)果顯示墊江柚系列與長壽沙田柚具有很近的親緣關(guān)系并有相同的基因型，從分子水平上說明了墊江柚系列可能屬于沙田柚類型。經(jīng)考證，梁平柚（35）最早從福建引入，此次試驗中梁平柚和福建文旦（56）的親緣關(guān)系比較近。聚類分析中，古巴柚（3）和4份葡萄柚（19、20、21、22）遺傳距離很近，結(jié)構(gòu)分析結(jié)果和聚類分析結(jié)果基本一致，董美超等[18]在《葡萄柚品種及遺傳育種研究進展》一文中提到古巴柚是由古巴引進的葡萄柚，此次試驗結(jié)果從分子水平上提供了證據(jù)。

4 結(jié)論

所選材料具有豐富的遺傳多樣性，聚類和結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果能直觀地了解這68份材料的親緣關(guān)系，并對其中可能的同物異名品種進行篩選。

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