徐超，陶勇峰，馬啟超，王紅霞，林麗萍，畢海青

（寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院，浙江 寧波 315100）

迄今為止，梅毒血清固定形成的免疫分子學(xué)機(jī)制仍然不是十分清楚，大部分研究認(rèn)為，梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）進(jìn)入人體后，首先激活機(jī)體天然免疫防御系統(tǒng)，即自然殺傷細(xì)胞（NK）清除TP，隨后T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫共同參與[1-2]，因而作為天然免疫識(shí)別受體的Toll樣受體（TLRs）自然也就成為了關(guān)鍵點(diǎn)所在，目前已經(jīng)證實(shí)，TLRs體不僅對(duì)各種病原微生物抗原能夠識(shí)別，還可以通過信號(hào)刺激傳導(dǎo)途徑來活化免疫應(yīng)答細(xì)胞，啟動(dòng)和激活獲得性細(xì)胞免疫[3]，TP脂蛋白激活單核細(xì)胞時(shí)除了需要TLRs的結(jié)合，也需要其膜上與之密切相關(guān)的CD14分子的協(xié)助作用[4]。因此筆者擬以此作為研究的深入點(diǎn)，分析梅毒血清固定患者外周血單核細(xì)胞中CD14+TLR2、CD14+TLR4及其炎性因子的表達(dá)，并探討其在形成血清固定現(xiàn)象中可能發(fā)揮的作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 梅毒患者來源于本院皮膚科性病診療中心，收集患者治療前后的血清樣本，分別統(tǒng)計(jì)血清固定、血清轉(zhuǎn)陰各35例和梅毒患者30例。對(duì)照組30例來自健康體檢中心，血清固定判定標(biāo)準(zhǔn)為：確診梅毒，血清甲苯胺紅不需加熱血清試驗(yàn)（TRUST）稀釋、梅毒螺旋體顆粒凝膠試驗(yàn)（TPPA）檢測(cè)同時(shí)陽性，并依據(jù)《性傳播疾病臨床治療與防治指南》予以正規(guī)抗梅治療，TRUST滴度下降到一定程度（≤1∶4），持續(xù)超過3個(gè)月不轉(zhuǎn)陰者，即為血清固定，跟蹤隨訪2年，需排除人類免疫缺陷病毒（HIV）感染、神經(jīng)梅毒、再感染梅毒。

1.2 方法

1.2.1 試劑 同型對(duì)照 IgG-PE（554681Ms）抗體以及鼠抗人 FITC-CD14 （553739Ms）、PE-TLR4（551964Hu）、TLR2（558319Hu）單抗，購(gòu)自 Becton Dickinso公司，RPMI 1 640培養(yǎng)液、淋巴細(xì)胞分離液、固定劑和破膜劑、LPS（HEL002）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，HET019）和白細(xì)胞介素（IL）-6 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA，PIE032）試劑盒購(gòu)自上海博谷，流式細(xì)胞儀來自Backman Coulter公司。

1.2.2 標(biāo)本制備 抗凝靜脈血3 mL搖勻，按照密度梯度離心法，在15 mL玻璃離心管中加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液，小心吸取抗凝血沿管壁加至分離液液面上，水平離心機(jī)（755VES）2 000 轉(zhuǎn)/min，20 min，自上而下出現(xiàn)4層，分別是血漿層、乳白色淋巴細(xì)胞層、透明分離液層、紅細(xì)胞層，吸管小心吸出第二層單個(gè)外周血單核細(xì)胞（PBMC），轉(zhuǎn)移至離心管中用RPMI1640按照6×106/mL濃度重新懸?。?xì)胞分離數(shù)量≥90%，存活率≥95%），PBMC中單核細(xì)胞的占比偏低，大約占10%～30%，因此需要在檢測(cè)前，加入LPS（最適濃度10 μg/mL）對(duì)分離出來的單核細(xì)胞進(jìn)行刺激培養(yǎng)，37℃、5% CO2保存，24 h（最佳時(shí)間）備用。

1.2.3 CD14+TLR2、CD14+TLR4細(xì)胞的檢測(cè) 8個(gè)檢測(cè)管中加入細(xì)胞懸液，相應(yīng)的同型對(duì)照抗體加入其中6個(gè)檢測(cè)管作為陰性對(duì)照，CD14-FITC抗體加入剩余2個(gè)檢測(cè)管，室溫孵育避光，按說明書依次固定和破膜后，分別加入PE標(biāo)記的TLR2、TLR4單抗，充分混勻，在細(xì)胞內(nèi)完成分子標(biāo)記，離心清洗去上清后，磷酸鹽緩沖液（PBS）重新懸浮，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.4 ELISA檢測(cè)TNF-α和IL-6 按照雙抗體夾心法操作說明，標(biāo)準(zhǔn)品需要倍比稀釋后加樣，置于酶標(biāo)儀上各孔中，在波長(zhǎng)450 nm處，空白對(duì)照孔歸零后，依次測(cè)定各孔的吸光度（Optical density，OD）值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出IL-6和TNF-α的數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 軟件SPSS24.0分析和處理相關(guān)數(shù)據(jù)，測(cè)得結(jié)果計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

4組患者中，固定組患者外周血中CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α、IL-6 表達(dá)的百分率最低，與其他3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），梅毒組表達(dá)的百分率最高，與轉(zhuǎn)陰組和對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而轉(zhuǎn)陰組和對(duì)照組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1?；颊逷BMC的流式細(xì)胞圖見圖1。

表1 4組患者 PBMC CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α和 IL-6的表達(dá)情況 （%，±s）

表1 4組患者 PBMC CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α和 IL-6的表達(dá)情況 （%，±s）

組別 n C D 1 4+T L R 2 C D 1 4+T L R 4 T N F-α I L-6固定組 3 5 5 6.1 4±5.1 3 2.9 4±1.3 2 3.0 4±1.1 6 1.2 4±0.4 5梅毒組 3 0 6 9.4 9±5.4 7 4.6 7±1.3 8 4.9 8±1.9 8 2.9 5±0.6 3轉(zhuǎn)陰組 3 5 6 2.2 3±5.6 6 3.8 2±1.0 2 3.8 5±1.3 6 1.5 2±0.6 7對(duì)照組 3 0 6 1.9 6±5.7 2 3.5 9±1.6 9 3.9 6±1.4 8 1.6 0±0.6 5

圖1 各檢測(cè)組CD14+TLR2、CD14+TLR4流式圖

3 討論

CD14和TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的主要在固有免疫細(xì)胞表面表達(dá)的模式識(shí)別受體，能夠通過病原體相關(guān)分子模式（AMP）對(duì)多種病原生物表面的抗原成分進(jìn)行免疫識(shí)別，在抵抗微生物入侵和引發(fā)宿主防御反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5-6]。作為L(zhǎng)PS高親和力的受體，CD14分子由于缺乏胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，需要與TLR4結(jié)合形成受體復(fù)合物，才能將識(shí)別LPS的信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞[7]，而TP膜脂蛋白作為配體也能夠被TLR2識(shí)別，并且需要CD14的協(xié)同，才能從胞膜外受體結(jié)合區(qū)域活化轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，傳導(dǎo)至胞漿TIR（Toll/IL-1R homologous region）區(qū)域[8-9]，因此在天然免疫監(jiān)視系統(tǒng)中，CD14和TLR2、TLR4是需要彼此相互間的密切組合，經(jīng)過非MyD88（Myeloid differentiation factor 88）依賴型和MyD88依賴型2種不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激活神經(jīng)因子（NF）-κB[10-11]，并使 NF-κB 活化轉(zhuǎn)移到胞核，誘導(dǎo)IL和TNF-α等相關(guān)炎性因子和趨化因子的表達(dá)、干擾誘導(dǎo)型NO合成酶的靶基因轉(zhuǎn)錄[12]，在引發(fā)天然免疫的同時(shí)，又能夠促進(jìn)DC的成熟，進(jìn)而完成抗原提呈，使獲得性免疫啟動(dòng)，有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化和凋亡[13-14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，所有受試者中，CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α和IL-6的表達(dá)比值在固定組患者中最低，在梅毒感染者中其比值最高，但與轉(zhuǎn)陰組和對(duì)照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，導(dǎo)致的原因可能是隨著梅毒病情發(fā)展和臨床治療的進(jìn)行，使得比值慢慢出現(xiàn)了改變，TP全部被藥物和機(jī)體免疫系統(tǒng)殺死的患者血清轉(zhuǎn)陰，而少部分患者TP由血液淋巴循環(huán)進(jìn)入局部隱匿部位[15]，造成膜脂蛋白刺激信號(hào)減弱或持續(xù)下降，導(dǎo)致患者體內(nèi)TLR2、TLR4的低表達(dá)，通過MyD88、NF-κB途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，向下游誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6等前炎性因子大量減少[16]，引起級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)減弱，Th1活化受到阻礙，Th1/Th2比例出現(xiàn)失衡現(xiàn)象，Th2表達(dá)相對(duì)比較活躍[17-18]，機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)不能進(jìn)入有效狀態(tài)，致使TP感染進(jìn)入慢性階段，最終導(dǎo)致了血清固定的發(fā)生。

綜上所述，TLRs家族中的TLR2、TLR4可能是通過CD14分子的協(xié)助，調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)的應(yīng)答，參與免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)TP的識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)和清除，并在其中起著相互影響的關(guān)鍵性作用。因此TLRs作為橋梁，聯(lián)系了梅毒螺旋體引發(fā)的天然免疫和獲得性免疫過程。但是不管在梅毒感染期還是固定期，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的TLRs傳導(dǎo)的信號(hào)在激活單核細(xì)胞完成免疫反應(yīng)后也能及時(shí)促使其凋亡，這種適當(dāng)控制炎性反應(yīng)強(qiáng)度來維持免疫平衡的調(diào)節(jié)作用對(duì)于影響梅毒血清固定的發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。