楊盈盈，邵亞洲，石毛寧，徐 婕，梁俊玉

西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州市安寧區(qū)安寧東路967 號 730070

煙草甲（Lasioderma serricorne）屬鞘翅目竊蠹科昆蟲，是最常見的倉儲害蟲之一。煙草甲的食性復(fù)雜，在農(nóng)作物倉庫對谷物和豆類具有嚴(yán)重的為害性；在煙草倉庫中對儲藏的雪茄、卷煙和煙葉等也有很大的為害［1］。在20 世紀(jì)90 年代，我國曾對為害全國貯煙害蟲的為害程度進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)全國每年因貯煙害蟲造成的煙葉質(zhì)量損失率為1.64%［2-3］。赤擬谷盜（Tribolium castaneum）屬鞘翅目擬步甲科，對水稻、小麥、玉米等各類糧、油、肉類及其加工制品等都可造成嚴(yán)重為害［4］。其為害周期長，繁殖速度快，且成蟲身體上的臭腺會分泌物質(zhì)容易導(dǎo)致物質(zhì)結(jié)塊并使其顏色發(fā)生變化，發(fā)出腥霉味臭氣，且其分泌物中含有致癌物苯醌［5-6］。目前,防治煙草甲和赤擬谷盜的方法主要是使用化學(xué)合成殺蟲劑—磷化氫熏蒸［7］。雖然化學(xué)殺蟲劑具有很好的毒殺效果，但長期使用會危及人類健康并對環(huán)境造成污染，且會增加煙草甲和赤擬谷盜的抗藥性［8-9］。因此，尋找可代替化學(xué)殺蟲劑的新型農(nóng)藥十分重要。

近年來新型植物源殺蟲劑的研發(fā)受到了人們的高度重視。其中，植物揮發(fā)油具有抑菌消炎、抗氧化、驅(qū)蚊殺蟲等功效，有開發(fā)成天然抑菌劑、抗氧化劑以及殺蟲劑等的潛力［10］；且具有對環(huán)境無害、毒性較低、對非靶標(biāo)生物無害、對人畜安全、易于分解且對害蟲不易產(chǎn)生抗性等特點(diǎn)［11］。目前關(guān)于植物揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺和熏蒸活性已有較多研究，鞠克升［12］報(bào)道了珠光香青（Anaphalis margaritacea）揮發(fā)油對赤擬谷盜的觸殺活性（LD50為41.25 μg/頭）。吳彥等［13］研究提出了側(cè)柏（Platycladus orientalis）揮發(fā)油對赤擬谷盜和煙草甲具有觸殺活性（LD50分別為48.58 μ g/頭和50.45 μg/頭）和熏蒸活性（LC50分別為145.40 mg/L和39.25 mg/L）。張莉娟等［14］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)頭花杜鵑（Rhododendron capitatum）揮發(fā)油對赤擬谷盜（LD50為104.92 μg/頭）和煙草甲（LD50為44.40 μg/頭）有觸殺活性。Yang 等［15］研 究 表 明 山 蒼 子 果 實(shí)（Litsea cubeba）揮發(fā)油對煙草甲有熏蒸活性（LC50為22.97mg/L）。程昉等［16］報(bào)道了牛尾蒿（Artemisia dubia）、灰苞蒿（A.rocburghiana）、紅足蒿（A.rubripes）、白蓮蒿（A.sacrorum）和華北米蒿（A.giraldii）等5 種蒿屬植物揮發(fā)油對煙草甲和嗜卷書虱有驅(qū)避活性，其中紅足蒿揮發(fā)油對煙草甲的驅(qū)避活性最好，牛尾蒿揮發(fā)油對嗜卷書虱的驅(qū)避活性最顯著。

許多亞菊屬植物都具有消炎止血、清熱解毒、驅(qū)蚊殺蟲、消炎止癢等藥理作用，并且許多亞菊屬植物中含有揮發(fā)油［17］。有研究表明，細(xì)葉亞菊（Ajania tenuifolia）、川甘亞菊（Ajania potaninii）、光苞 亞 菊（Ajania nitida）和 絲 裂 亞 菊（Ajania nematoloba）等的揮發(fā)油對煙草甲（Lasioderma serricorne）和赤擬谷盜有觸殺、熏蒸和驅(qū)避活性［3,18-19］，其中光苞亞菊揮發(fā)油對煙草甲的觸殺活性最強(qiáng)。Liang 等［20］試驗(yàn)認(rèn)為灌木亞菊（Ajania fruticulosa）揮發(fā)油對赤擬谷盜和嗜卷書虱（Liposcelis bostrychophila）均有觸殺和驅(qū)避活性。王思敏等［21］提出了鋪散亞菊（Ajania khartensis）揮發(fā)油對馬鈴薯莖線蟲（Ditylenchus destructor）具有較強(qiáng)的觸殺作用。柳葉亞菊（Ajania salicifolid）可用于清熱解毒、清肺止咳和防蟲驅(qū)蚊［22-23］。目前有關(guān)柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜殺蟲活性的影響尚鮮見報(bào)道。為此，設(shè)置了柳葉亞菊揮發(fā)油的化學(xué)成分分析及其對兩種常見倉儲害蟲的毒殺作用試驗(yàn)，以期為倉儲害蟲的綠色防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料采集和揮發(fā)油提取

柳葉亞菊（Ajania salicifolia）于2018 年8 月采自甘肅省蘭州市榆中縣（經(jīng)緯度35°78′34″N，103°93′79″E，海拔3 200 m）。將柳葉亞菊植物的地上部分陰干、粉碎、稱取1 000 g 后轉(zhuǎn)移到揮發(fā)油提取器中。經(jīng)過6 h 蒸餾提取后收集揮發(fā)油，殘留水分用無水硫酸鈉去除，得到揮發(fā)油。將提取得到的柳葉亞菊揮發(fā)油裝入玻璃小瓶中，密封后放到4 ℃冰箱中保存。

1.2 供試?yán)ハx

將煙草甲和赤擬谷盜飼養(yǎng)在容積為0.5 L 的玻璃瓶中，飼以10∶1 質(zhì)量比混合的小麥粉與酵母粉。培養(yǎng)溫度為（29±1）℃，相對濕度為70%～80%。試驗(yàn)昆蟲（試蟲）為羽化后1～2 周的成蟲，不分雌雄。

1.3 儀器與試劑

6890N 氣相色譜分析儀（美國Agilent 公司），配有5973N 質(zhì)譜分析儀，氫火焰離子化檢測器（GC-FID），NIST2.0 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫；移液槍（量程范圍：0.1～2.5、0.5～10 和10～100 μL，大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；正己烷（分析純，煙臺市雙雙化工有限公司）；除蟲菊酯（純度27%，陜西米爾康生物科技有限公司）；避蚊胺（DEET，純度99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；玻璃樣品瓶、玻璃培養(yǎng)皿購于北京玻璃儀器廠。

1.4 柳葉亞菊揮發(fā)油GC/MS 分析

樣品前處理：將提取得到的柳葉亞菊揮發(fā)油經(jīng)正己烷萃取，無水硫酸鈉處理后過濾，常壓濃縮至不含溶劑，對得到的無色揮發(fā)油進(jìn)行GC/MS分析。

GC/MS 條件：色譜柱為熔融石英毛細(xì)管柱HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟龋３?5 min。用正己烷將柳葉亞菊揮發(fā)油溶解，稀釋至1%（體積分?jǐn)?shù)）注射到氣相色譜儀中。氣相色譜參數(shù)：汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣；進(jìn)樣量1 μL；流速1.0 mL/min；分流比1∶10。質(zhì)譜參數(shù)：電離方式為EI電離；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍20～550 m/z。最后采用與正構(gòu)烷烴（C8～C24）的保留時間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST 2.0 和Wiley 275 libraries）數(shù)據(jù)比較鑒定揮發(fā)油組分。采用峰面積歸一化法，根據(jù)各化學(xué)成分的分子量，計(jì)算出各化學(xué)成分在揮發(fā)油中的相對含量。

1.5 生物活性的測定

1.5.1 觸殺活性

參考文獻(xiàn)［24］的方法測定柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性。將試蟲放在培養(yǎng)皿中并置于冰袋上，用移液槍取0.5 μL 樣品的正己烷稀釋液分別滴于停止行動的2 種試蟲前胸背板上，用藥后放入直徑2.5 cm，高5.5 cm 的玻璃瓶中。正己烷為空白對照，除蟲菊酯（濃度分別為0.200 0%、0.100 0%、0.050 0%、0.025 0%和0.012 5%，體積分?jǐn)?shù)）為陽性對照，樣品設(shè)置5 個濃度梯度（15.00%、10.00%、6.67%、4.50%和2.98%，體積分?jǐn)?shù)），每個濃度重復(fù)5 次，每次重復(fù)試蟲10 頭。處理后置于溫度（29±1）℃，相對濕度為70%～80%的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h，觀察記錄試蟲死亡情況，并計(jì)算死亡率與校正死亡率，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)算半致死劑量LD50（μg /頭）。

1.5.2 熏蒸活性

參考文獻(xiàn)［25］的方法測定柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜熏蒸活性。將試蟲放入玻璃瓶中，用正己烷將柳葉亞菊揮發(fā)油配制成5 個濃度梯度（50.000%、25.000%、12.500%、6.250%和3.125%，體積分?jǐn)?shù)）的稀釋溶液。用移液槍取10μL 的稀釋溶液，滴在覆蓋于瓶蓋內(nèi)頂部直徑為2 cm 的濾紙片上,待溶劑揮發(fā)20 s 后，迅速將瓶蓋擰緊并密閉。正己烷為空白對照，甲基溴［20］和磷化氫［15］分別作為赤擬谷盜和煙草甲熏蒸活性的陽性對照。每個濃度重復(fù)5 次，每次重復(fù)試蟲10頭。處理后置于溫度（29±1）℃，相對濕度70%～80%的恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24 h，觀察記錄死亡情況，并采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析計(jì)算半數(shù)致死濃度LC50（mg/L）。

1.5.3 驅(qū)避活性

參考文獻(xiàn)［26］的方法測定柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的驅(qū)避活性。用正己烷溶解柳葉亞菊揮發(fā)油并制成5 個連續(xù)濃度（0.500 0%、0.100 0%、0.020 0%、0.004 0%和0.000 8%，體積分?jǐn)?shù)）梯度的溶液。取與培養(yǎng)皿（直徑9 cm，高1.9cm）底相同直徑的濾紙，沿著中線對半剪開，一半滴加500 μL 稀釋溶液，另一半滴加等量正己烷作為空白對照。待溶劑自然揮發(fā)后，立即用固體膠將處理過的濾紙相向緊貼在培養(yǎng)皿底部，注意粘牢不留縫隙，以防止試蟲鉆入濾紙下面，影響觀察效果。將20 頭試蟲從培養(yǎng)皿中央投入，迅速蓋上培養(yǎng)皿蓋子并密封。不同濃度的樣品用相同的方法處理5 次。避蚊胺作為陽性對照。在處理2 h和4 h 后分別統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)在不同區(qū)域內(nèi)的試蟲數(shù)量。并計(jì)算驅(qū)避率（Percentage repellency，PR）。

式中：Nc表示出現(xiàn)在陰性對照區(qū)域內(nèi)的試蟲數(shù)量，頭；Nt表示出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組區(qū)域內(nèi)的試蟲數(shù)量，頭。計(jì)算出PR 的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理

利用Abbott’s formula 軟件計(jì)算校正死亡率。采用IBM SPSS V22.0 統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算觸殺活性的半致死劑量（LD50）和熏蒸活性的半數(shù)致死濃度（LC50）。采用方差分析法，用IBM SPSS V22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 柳葉亞菊揮發(fā)油的化學(xué)成分分析

柳葉亞菊揮發(fā)油的GC/MS 分析結(jié)果見表1。從柳葉亞菊揮發(fā)油中鑒定出了23 種化合物，占揮發(fā)油總量的96.13% 。 其主要成分為樟腦（36.50%）、杜松腦(16.44%)、桉葉油醇（9.61%）和α-紅沒藥醇（4.77%）?；衔镱愋鸵韵?、醇和酮等為主。

2.2 觸殺活性

柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性見表2。柳葉亞菊揮發(fā)油對赤擬谷盜和煙草甲具有一定的觸殺作用，LD50分別為64.51 μg/頭和25.66 μg/頭。柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲的觸殺活性高于赤擬谷盜2.5 倍，因此柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲表現(xiàn)出較強(qiáng)的觸殺活性，但柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性弱于藥劑對照。柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜觸殺作用存在差異，這可能與揮發(fā)油組成成分以及兩種昆蟲體內(nèi)的某些酶有關(guān)。與鞠克升等［12］、吳彥等［13］和張莉娟等［14］對珠光香青揮發(fā)油、側(cè)柏?fù)]發(fā)油和頭花杜鵑揮發(fā)油對煙草甲與赤擬谷盜的觸殺活性研究結(jié)果相比，柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲的觸殺活性強(qiáng)于側(cè)柏?fù)]發(fā)油和頭花杜鵑揮發(fā)油。另外，本研究中只測試了柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜成蟲的殺滅活性，而對其幼蟲和卵的殺滅活性還需進(jìn)一步試驗(yàn)。

表1 柳葉亞菊揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對含量Tab.1 Chemical compositions and their relative contents in A. salicifolid essential oil

表2 柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的觸殺活性①②Tab.2 Contact toxicity of A. salicifolid essential oil against L. serricorne and T. castaneum

2.3 熏蒸活性

柳葉亞菊揮發(fā)油對赤擬谷盜和煙草甲的熏蒸活性見表3。柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜具有較強(qiáng)的熏蒸活性，LC50分別為26.60 mg/L 和24.29 mg/L。雖然柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性弱于藥劑對照，但與吳彥等［13］和Yang 等［15］對側(cè)柏?fù)]發(fā)油和山蒼子揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性研究結(jié)果相比，柳葉亞菊揮發(fā)油對赤擬谷盜的熏蒸活性優(yōu)于側(cè)柏?fù)]發(fā)油，對煙草甲的熏蒸活性也優(yōu)于側(cè)柏?fù)]發(fā)油，而與山蒼子果實(shí)揮發(fā)油的熏蒸活性相近。

表3 柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜的熏蒸活性①Tab.3 Fumigant activity of A. salicifolid essential oil against L. serricorne and T. castaneum

2.4 驅(qū)避活性

柳葉亞菊揮發(fā)油對兩種害蟲的驅(qū)避活性見表4。結(jié)果表明，柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜具有一定的驅(qū)避活性，但對赤擬谷盜的驅(qū)避活性更明顯。使用濃度0.500 0%時，其處理2 h 和4 h 后對赤擬谷盜的驅(qū)避率高于90%，且與避蚊胺的驅(qū)避活性相近。使用濃度0.100 0%和0.020 0%時，處理4 h 后揮發(fā)油對赤擬谷盜驅(qū)避活性比處理2 h 后的驅(qū)避活性略好，均與避蚊胺的驅(qū)避活性相近；處理濃度0.000 8%時，處理2 h 和4 h 后對赤擬谷盜的驅(qū)避效果與避蚊胺相當(dāng)。可見高測試濃度時柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲的驅(qū)避率在60%以上，驅(qū)避活性較強(qiáng)；低濃度下，對煙草甲的驅(qū)避活性較弱。

表4 柳葉亞菊揮發(fā)油和避蚊胺對煙草甲和赤擬谷盜的驅(qū)避活性①Tab.4 Repellent activity of A. salicifolid essential oil and DEET against L. serricorne and T. castaneum

3 結(jié)論

柳葉亞菊揮發(fā)油的主要成分為單萜和倍半萜，其中單萜類化合物占絕大多數(shù)，主要以樟腦、杜松腦和桉葉油醇為主。柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜觸殺活性LD50分別為25.66 μg/頭和64.51 μg/頭，對煙草甲的觸殺活性明顯強(qiáng)于赤擬谷盜。柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜熏蒸活性LC50分別為26.60 mg/L 和24.29 mg/L，對兩種試蟲均具有顯著的熏蒸作用效果。在高濃度（0.500 0%）條件下分別處理2 h 和4 h 后柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲的驅(qū)避率高于60%，對赤擬谷盜的驅(qū)避率高于90%。因此，柳葉亞菊揮發(fā)油對煙草甲和赤擬谷盜均具有較顯著的防治效果，具有開發(fā)為新型植物源煙草倉儲害蟲殺蟲劑的潛質(zhì)。