臧 云，紀桂霞，楊 鵬，徐蓬軍，王秀芳，鄧 寧，譚菲菲，王新偉，任廣偉*

1. 中國農業(yè)科學院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經四路11 號 266101

2 .四川省煙草公司攀枝花市公司，四川省攀枝花市東區(qū)龍珠路31 號 617026

煙草甲［Lasioderma serricorne（Fabricius）］是一種世界性的倉儲害蟲，屬鞘翅目（Coleoptera）、竊蠢科（Anobiidae）［1-2］。煙草甲食性復雜，既能取食一些倉儲糧食和中草藥，又能取食倉庫中儲藏的煙葉以及卷煙和雪茄等煙草制品。被蛀食后的煙葉因殘缺不全、蟲糞蟲尸污染等嚴重影響煙葉的可用性。據統(tǒng)計，全世界每年因煙草甲等倉儲害蟲為害造成的煙葉蟲蛀損失占煙葉總儲存量的1%［3］；我國煙葉每年因倉儲害蟲為害造成的煙葉蟲蛀損失大約為1.64%［4］。目前國內主要采取磷化氫熏蒸防治煙草甲，但磷化氫熏蒸若操作不當，會對作業(yè)人員、貨物和環(huán)境造成安全隱患［5］，我國已于2020 年限制其使用［6］。因此，急需研究與環(huán)境相容性好，且使用安全的煙草甲防治措施，以減少熏蒸次數，有效控制倉儲害蟲。近年來，利用昆蟲的趨光性進行誘殺已逐漸成為防治害蟲的重要方式之一。與其他防治方法相比，燈光誘捕防治有利于延緩害蟲抗藥性、降低防治成本、減少環(huán)境污染，符合生態(tài)治理的發(fā)展方向［7-8］。已有研究證實，煙草甲具有一定的趨光性，Kirkpatrick 等［9］、Soderstrom 等［10］試驗發(fā)現多數煙草甲成蟲會被紫光吸引；Tsuji［11］研究表明兩個紫光燈管的誘蟲燈對煙草甲的誘捕數量顯著高于1 個紫光燈管的誘蟲燈；Katsuki 等［12］試驗比較了7 種LED 燈對煙草甲的誘集率，其中紫光和藍光LED 燈比其他光源LED 燈吸引的煙草甲更多；Hironaka 等［13］發(fā)現在光強相同時，紫光LED 燈比藍光LED 燈更能吸引煙草甲?？梢姡酝难芯慷嚓P注不同顏色燈光對煙草甲的吸引作用，但對光波長的系統(tǒng)研究報道較少。

昆蟲對光的感知依賴于由視蛋白和發(fā)色團組成的視紫紅質［14］，其中視蛋白是一種具有7 個跨膜結構域和一個賴氨酸殘基的G 蛋白偶聯(lián)受體［15］，其氨基酸序列的不同影響昆蟲對敏感光的吸收［16］。由于基因復制和缺失導致的適應性進化不同，昆蟲視蛋白從類型到拷貝數均有所不同［17］。多數昆蟲具有3 種視蛋白，包括紫外敏感視蛋白（UV）、藍光敏感視蛋白（BL）和長波敏感視蛋白（LW），分別形成對紫色光（325 ～430 nm）、藍色光（430 ～500 nm）和綠色光（＞500 nm）波長最敏感的光色素［18-19］。在鞘翅目昆蟲中有一些缺失BL 視蛋白［20-21］，紅蜻蜓（Sympetrum frequens）擁有 多 個 視 蛋 白 基 因［22］，黑 腹 果 蠅（Drosophila melanogaster）則進化出1 個新的亞家族，命名為藍綠敏感蛋白［18-19］，但煙草甲視蛋白基因序列和相關特征目前尚不明確。為此，在前人研究基礎上，以7 種波長LED 燈為測試對象進行了煙草甲趨光性試驗，并克隆獲得了煙草甲視蛋白基因，旨在為將燈光誘捕技術應用于煙草倉儲害蟲的綜合治理提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蟲源煙草甲采自中國農業(yè)科學院煙草研究所煙葉樣品儲藏室，用全麥酵母粉飼料在人工培養(yǎng)箱內繼代大量繁殖后，取生長發(fā)育時期一致的成蟲備用。飼養(yǎng)條件為：溫度（28±1）℃、相對濕度75%±5%。

趨光行為測試裝置由行為反應箱和光源箱組成，參考Reisenman等［23］的方法并進行改進，見圖1。行為反應箱長600 mm、寬310 mm，分為光區(qū)和暗區(qū)兩部分，光區(qū)高500 mm、暗區(qū)高200 mm；頂部安裝光源，光源箱與光區(qū)均密閉不透光。試驗時在光區(qū)放入白色粘蟲板。

供試光源為不同波長LED 燈，由河南新鄉(xiāng)市天意新能源科技開發(fā)有限公司提供，波長分別為360 ～365、400 ～405、450 ～460、515 ～525、600 ～605、620 ～625 和640 ～665 nm，使用Hioki 3423 照度計在50 cm 處測得上述波長LED 燈光照度分別為5.2、4.6、49.4、242.0、25.4、55.0 和26.8 Lx，供試LED 燈電壓均為12 V。

實倉誘捕試驗所用風吸式殺蟲燈由浙江安吉安寧生物科技有限公司提供。根據上述波長篩選后選用包含最佳誘蟲波長的常用市售殺蟲燈（AN-D-1008）進行實倉誘蟲試驗，燈光峰值波長400 nm 左右，距離燈管0.5、1.0 和1.5 m 處光照度分別為21.5、19.8 和17.7 Lx；設置黑光燈管作為對照，峰值波長380 nm，0.5、1.0 和1.5 m 處光照度分別為32.0、28.5 和26.9 Lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同波長燈光誘集試驗

2019 年7 ～8 月在中國農業(yè)科學院煙草研究所實驗室內進行不同波長燈光誘集試驗。實驗室溫度（26 ± 2）℃，相對濕度70%～80%。挑選2 日齡煙草甲成蟲進行測試，煙草甲成蟲預先置于黑暗環(huán)境中處理1 h，再放入行為反應箱的暗區(qū)，待處理15、30 和60 min 后，分別記錄在暗區(qū)的試蟲數，并計算趨光率。每波長燈光分別處理20 頭，重復5 次。

1.2.2 實倉誘捕試驗

2019 年8～9 月在中國農業(yè)科學院煙草研究所煙葉倉庫內進行誘蟲試驗。倉庫溫度（26 ±2）℃，相對濕度70% ～80%，倉庫面積40 m2，倉庫內存放2016 ～2018 年云南、福建、山東等煙區(qū)生產的C3F、B2F 和X2F 等級初烤煙葉約500 kg，倉庫內有大量煙草甲成蟲。懸掛380 nm 和400 nm兩種波長的殺蟲燈各1 臺，放置高度為1.5 m，兩燈相距5 m，試驗中期兩臺殺蟲燈互換位置，以消除殺蟲燈位置差異產生的影響。每天18∶00 開燈，次日8∶00 關燈，每天8∶30 調查各處理誘集的煙草甲成蟲數量，連續(xù)調查16 d。

1.2.3 煙草甲轉錄組測序

采集煙草甲幼蟲、蛹和雌雄成蟲各50 頭，混合后利用Tirzol 法提取RNA，具體步驟按照日本TaKaRa 公司動物組織RNA 提取方法說明書進行。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行轉錄組測序，并對數據進行匯編和注釋。

1.2.4 基因克隆

根據轉錄組測序序列信息，獲得煙草甲視蛋白基因序列。用日本TaKaRa Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 試 劑 盒 進 行cDNA 反 轉錄。利用Primer5.0 軟件設計特異性引物，擴增LW基因的上游引物為LSlw-F：5′-TGACCACCA CCATATCCG-3′，擴增LW基因的下游引物為LSlw-R：5′-ATTTTCCGTGTCCGTTTT-3′，擴增UV 基因的上游引物為LSuv-F：5′-ATGAACCTATACCTGAACT G-3′，擴增UV基因的下游引物為LSuv-R：5′- TTAAG AAGCAGCAGCAG-3′，引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。使用日本TaKaRa 公司的TaqTM進行PCR 擴增，PCR 反應條 件：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 完成后，使用北京全式金生物技術有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit 試劑盒進行膠回收。膠回收產物連接到T3 載體上，室溫連接30 min，連接產物轉至Trans1-T1 感受態(tài)細胞，加入無添加抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于37 ℃、2 000 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，取菌液涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待菌落長出后隨機挑選單菌落，用通用引物M13F 和M13R 進行菌液PCR 檢測，選取陽性克隆菌株由上海派森諾生物科技股份有限公司測序。

1.2.5 序列生物信息學分析

將序列在NCBI 中用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具進行同源性分析，利用在線軟件ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.Html）查找序列的開放閱讀框，運用DNAMAN 軟件預測其編碼的氨基酸序列、蛋白分子量、等電點等理化指標，運用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）軟 件 分析跨膜結構。采用Mega 10 軟件用NJ 法構建系統(tǒng)進化樹。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 17.0 數據分析軟件進行單因素方差分析和獨立樣本t檢驗，通過Turkey 法檢驗各處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同波長燈光對煙草甲的誘集效果

不同波長燈光對煙草甲的誘集效果見圖2。煙草甲對不同波長光源的趨性存在一定差異。煙草甲對400～405 nm 波長的趨性顯著高于對其他波長的趨性，趨光率達74%；對600～605 nm 波長的趨性顯著高于對450～460 nm、515～525 nm 和620～625 nm 波長的趨性，趨光率為50%左右；而對450～460 nm、515～525 nm 和620～625 nm 波長的趨性最差，趨光率分別為35%、37%和35%，且三者間差異不顯著。

2.2 誘蟲燈對煙草甲的實倉誘捕效果

根據2.1 節(jié)的試驗結果，選取對煙草甲誘集作用效果最強的400 nm 波長誘蟲燈進行實倉誘捕試驗，以380 nm 波長的誘蟲燈為對照，觀察該波長在煙葉倉庫中誘殺煙草甲的效果。結果表明，400 nm 誘蟲燈對煙草甲的平均每日誘集量顯著高于380 nm 的誘蟲燈（圖3），其中400 nm 誘蟲燈平均每日誘蟲數量為632 頭，380 nm 的誘蟲燈平均每日誘蟲數量僅為286 頭。與室內趨光性試驗結果一致。實倉誘捕試驗結果進一步說明400 nm 波長的光源可高效誘集煙草甲。

2.3 煙草甲轉錄組的測序分析

煙草甲的轉錄組測序結果見表1。在煙草甲中共獲得總計6.49 Gb 的數據。組裝并去冗余后得到26 761 條Unigene，總長度、平均長度、N50 以及GC 含量分別為36 659 980 bp、1 369 bp、2 376 bp 和43.57%。將Unigene 比對到功能數據庫進行注釋，最終分別有18 947（NR：70.80%）、6 007（NT：22.45%）、15 000（SwissProt：56.05%）、14 467（KOG：54.06%）、15 336（KEGG：57.31%）、10 256（GO：38.32%）以及15 688（InterPro：58.62%）個Unigene 獲得功能注釋。使用Transdecoder 檢測出21 222 個CDS。同時還檢測出2 561 個SSR 分布于1 994 個Unigene 中，同時預測出2 915 個編碼轉錄因子的Unigene。表明測序質量較好，數據具有可靠性。

表1 煙草甲轉錄組的測序結果Tab.1 Sequencing results of transcriptome data for Lasioderma serricorne

2.4 煙草甲UV 和LW 視蛋白基因的克隆

通過功能注釋得到兩個視蛋白基因作為參考序列進行基因克?。▓D4），最終獲得了煙草甲UV視蛋白序列（登錄號為MT040761）和LW 視蛋白序列（登錄號為MT040760）。序列分析結果（圖5）顯示，煙草甲UV 視蛋白基因開放閱讀框為1 182 bp，編碼392 個氨基酸，預測分子量為43.78 kD，理論等電點為7.95；煙草甲LW 視蛋白基因開放閱讀框為1 134 bp，編碼376 個氨基酸，預測分子量為41.58 kD，理論等電點為8.43。表明煙草甲UV 和LW 視蛋白皆屬于具有7 個跨膜結構域的G 蛋白偶聯(lián)受體超家族。

2.5 煙草甲UV 和LW 視蛋白的系統(tǒng)進化分析

蛋白質序列比對結果（圖6）表明，煙草甲視蛋白序列和其他3 種昆蟲的視蛋白序列一致性均較高。用煙草甲和其他19 種昆蟲的42 個視蛋白的氨基酸序列構建NJ 樹。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結果（圖7）表明，煙草甲UV 視蛋白與鞘翅目昆蟲UV 視蛋白匯聚在一起，煙草甲UV 視蛋白的氨基酸序列與一種鞘翅目豉甲科昆蟲Gyrinus marinus的序列一致性最高，同源性約為74%；煙草甲LW 視蛋白與鞘翅目昆蟲LW 視蛋白匯聚在一起，LW 視蛋白的氨基酸序列與基刺瘤木長蠹（Xylobiops basilaris）的序列一致性最高，同源性約為86%。煙草甲缺失BL 視蛋白，從圖7 可看出，其他幾種鞘翅目昆蟲中也同樣缺失BL 視蛋白。鞘翅目G.marinus、鱗翅目棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、半翅目煙盲蝽（Nesidiocoris tenuis）、膜翅目蜜蜂（Apis mellifera）和麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）皆有兩個UV視蛋白，鱗翅目海神袖蝶（Heliconius doris）、寬紅袖蝶（Heliconius hortense）以及雙翅目黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）分別有兩個LW 視蛋白。

3 討論

利用昆蟲的趨光性是害蟲防控的有效依據，且具有環(huán)境友好的優(yōu)點。近年來，多位學者對昆蟲的趨光行為研究發(fā)現，包括光源波長、昆蟲性別、強度等對昆蟲趨光行為均有影響［24］。如谷蠹Rhizopertha dominica對530 nm 綠光和570 nm 黃光趨性最強，并且光強度越大，趨光行為越強［25］；綠盲蝽Apolygus lucorum雌成蟲在562 nm 綠光區(qū)有趨光高峰，但雄成蟲沒有［26］。光源波長作為影響昆蟲趨光行為的最主要因素，不同昆蟲種類因其生物學、生態(tài)學特性不同，對不同波長光的選擇也存在差異，多數昆蟲的敏感波長在280 ～400 nm的紫外范圍和400 ～700 nm 的可見光范圍內［27-28］。本研究中利用7 種波長LED 燈誘集煙草甲，發(fā)現煙草甲對400 ～405 nm 波長（紫光）的趨性最強，對600 ～605 nm 波長（橙光）的趨性次之。與Katsuki等［12］試驗發(fā)現的紫光和藍光效果最好的研究結果稍有不同，本試驗中450 ～460 nm（藍光）誘集效果一般，可能與Katsuki 等使用藍光LED 的光強不同有關。本研究中實倉誘捕試驗結果進一步表明，400 nm 波長的光源可高效誘集煙草甲，綜合前人研究結果來看，煙草甲對紫光趨性最強，與本試驗結果基本一致［9-13］。

昆蟲趨光行為復雜，視蛋白是接受光刺激的關鍵分子，影響多種昆蟲的光誘導行為，深入分析煙草甲視蛋白對揭示其趨光機理具有重要意義。盡管多數昆蟲存在UV、BL 和LW 3 種視蛋白，但在一些鞘翅目昆蟲中缺失BL 視蛋白，煙草甲同樣缺失BL 視蛋白，且煙草甲對450 ～460 nm（藍光）的趨性較差。已有的研究發(fā)現，鞘翅目昆蟲可通過UV 和LW 視蛋白基因復制中各位點的改變，重建其對于藍光波長的敏感性［29］，且在赤擬谷盜中得到了證實［30］。而一些學者對昆蟲視蛋白的表達研究發(fā)現，甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）敲除LW 視蛋白后綠光對其吸引力降低［31］；柑橘木虱（Diaphorina citri）的UV、BW 和LW 視蛋白在白天具有較高的表達水平，降低視蛋白的表達水平則抑制其趨光行為［32］。說明視蛋白的表達水平與昆蟲趨光行為呈正相關［14］。本研究中煙草甲對400～405 nm 和600 ～605 nm 波長的趨光行為，與UV視蛋白和LW 視蛋白對波長敏感范圍一致，煙草甲的趨光行為可能與UV 視蛋白的高表達水平有關，但煙草甲在應對不同波長光源時的視蛋白表達量變化還有待進一步深入研究。

4 結論

煙草甲有兩個與敏感光吸收相關的視蛋白，分別為UV 視蛋白和LW 視蛋白。煙草甲對不同波長光源的趨性存在差異，對400 ～405 nm 趨性最強，對600 ～605 nm 趨性次之。400 nm 波長的誘蟲燈可用于煙葉倉庫中煙草甲的誘殺防治。