張 芳，薄越洋，樊彥彤，何 瑞，張 潔

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)信息學(xué)院，山西太谷 030800）

蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao）為豆科黃芪屬多年生草本，以根入藥，其味甘微溫，具有補氣固表、利尿、抗病毒等功效，對肢體麻木、腎炎浮腫、創(chuàng)傷不易愈合等療效顯著，被稱為“補藥之長”，是臨床常用中藥之一[1-3]。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究中，特別是在我國2020 年初出現(xiàn)的新冠肺炎治療過程中，發(fā)現(xiàn)黃芪對于緩解新冠肺炎病情和抑制病毒的擴散具有顯著的效果[4]。隨著黃芪研究和應(yīng)用的不斷擴展，野生資源多瀕臨滅絕，人工種植也由于黃芪種子萌發(fā)率低等原因而影響其大量栽培，無法滿足市場需求[5]。利用植物組織培養(yǎng)快速繁殖黃芪不僅可在短期內(nèi)培養(yǎng)大量優(yōu)質(zhì)苗，還可為開展黃芪毛狀根轉(zhuǎn)基因研究提供基礎(chǔ)材料。

組培快繁是保護植物種質(zhì)資源和擴繁種苗的有效途徑，近年來對黃芪組培快繁開展了許多研究工作。洪森榮等[6]研究表明，KT 和2，4-D 均可促進膜莢黃芪試管苗帶芽莖段根和芽的再生。張延紅等[7-8]以蒙古黃芪莖段為外植體，篩選了初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基，并研究了溫度和pH 對黃芪組織培養(yǎng)的影響。郭生虎等[9]以膜莢黃芪無菌苗為外植體，研究了不同激素種類及其濃度配比對愈傷組織誘導(dǎo)率、叢生芽誘導(dǎo)率、再生苗生根率的影響，并篩選出適宜的培養(yǎng)基配方。這些研究多以帶芽莖段、無菌苗下胚軸為外植體開展相關(guān)試驗，對不同外植體進行比較篩選的研究不多。另外，由種子萌發(fā)的無菌苗是誘導(dǎo)愈傷組織的良好外植體，但黃芪種子本身萌發(fā)率偏低[10]，消毒處理不當(dāng)則會影響無菌苗的獲得。因此，篩選適宜的消毒劑是初代培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素之一，周吉林[11]研究表明，采用98%的濃硫酸滅菌黃芪種子3 min 效果較好。升汞和次氯酸鈉也具有良好的消毒滅菌作用[12]，但目前尚未見對黃芪種子滅菌效果的相關(guān)研究。

本試驗以蒙古黃芪種子為試驗材料，以0.1%HgCl2和2%NaClO 對其進行滅菌處理，獲得無菌苗，分別以黃芪無菌苗下胚軸和葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，以篩選最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并通過繪制愈傷組織生長曲線，確定其繼代培養(yǎng)周期，旨在為黃芪組織快繁及開展轉(zhuǎn)基因相關(guān)研究提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為蒙古黃芪種子，購自山西省種子公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芪種子的滅菌和萌發(fā) 選取優(yōu)質(zhì)飽滿的黃芪種子，剝?nèi)シN皮，用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3 次；再分別用0.1%HgCl2和2%NaClO 滅菌不同時間（表1），無菌水沖洗4 次后，接種到MS 培養(yǎng)基上（瓊脂6 g/L、蔗糖25 g/L、pH 值5.8），置于（25±1）℃培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)；每個處理接種6 瓶，每瓶8 粒，每隔1 d 觀察記錄黃芪種子的發(fā)芽率（當(dāng)胚根長比種子高1/2 時，即為黃芪種子發(fā)芽）。

表1 2 種消毒劑不同處理時間

1.2.2 以下胚軸為外植體的愈傷組織誘導(dǎo) 種子萌發(fā)后，置于溫度為（25±1）℃、光周期為16 h/8 h（光/暗）、光強為2 000 lx 的溫室內(nèi)培養(yǎng)，得到無菌苗。以黃芪無菌苗的下胚軸為外植體，接種到附加不同質(zhì)量濃度NAA、2，4-D 和6-BA 的MS 培養(yǎng)基中（表2），置于溫度為（25±1）℃進行暗培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織；每個處理接種8 瓶，每瓶接種5 個。25 d 后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)個數(shù)，計算誘導(dǎo)率，并觀察其生長情況。1.2.3 以葉片為外植體的愈傷組織誘導(dǎo) 取黃芪無菌苗葉片切成大小約為2 mm×2 mm 的小塊，接種于添加不同質(zhì)量濃度的NAA、2，4-D 和6-BA 的MS 培養(yǎng)基中（表3）。培養(yǎng)條件同1.2.2。每個處理接種8 瓶，每瓶接種5 個。接種25 d 后統(tǒng)計愈傷組織的誘導(dǎo)個數(shù)，計算誘導(dǎo)率，并觀察其生長情況。

表2 誘導(dǎo)黃芪下胚軸愈傷組織的不同激素配比

表3 誘導(dǎo)黃芪葉片愈傷組織的不同激素配比

1.2.4 愈傷組織繼代周期的確定 將下胚軸和葉片誘導(dǎo)獲得的愈傷組織分別轉(zhuǎn)接入1.2.2 和1.2.3試驗篩選出的最適培養(yǎng)基中進行增質(zhì)量研究。每5 d測定一次愈傷組織鮮質(zhì)量，培養(yǎng)30 d，并繪制其生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑及處理時間對黃芪種子萌發(fā)的影響

黃芪種子接種第8 天開始出芽，第25 天黃芪種子萌發(fā)情況統(tǒng)計結(jié)果如表4 所示。

表4 2 種消毒劑不同滅菌時間對黃芪種子萌發(fā)的影響

從表4 可以看出，0.1%HgCl2處理中，A3 處理（10 min）的種子萌發(fā)率和芽體平均高度最高，分別為73%和13.7 cm；A1、A2 處理種子滅菌不完全，仍有污染現(xiàn)象；A4 處理可能對種子的毒害作用較大，抑制種子的萌發(fā)和生長。2%NaClO 處理中，B3 處理（20 min）的種子萌發(fā)率最高，為68%；B2 處理的種子萌發(fā)后芽體平均高度最高，為12.6 cm。綜上可見，0.1%HgCl2滅菌處理10 min 為蒙古黃芪種子的最適滅菌方法。

2.2 激素對黃芪無菌苗下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表5 可知，培養(yǎng)基中單獨附加2，4-D（C1～C4）時，C2（MS＋1.0 mg/L 2，4-D）的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為83%，且愈傷組織生長健壯，質(zhì)地疏松適度，褐化較輕；2，4-D 質(zhì)量濃度過高或過低時，愈傷組織誘導(dǎo)率明顯下降，且生長緩慢，組織易產(chǎn)生硬塊褐化。單獨附加不同質(zhì)量濃度6-BA（C5～C8）時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高也僅為43%，且生長情況較差，色白無光澤，褐化程度嚴(yán)重，延長培養(yǎng)時間則逐漸死亡。單獨添加不同質(zhì)量濃度NAA（C9～C12）時，愈傷組織誘導(dǎo)率隨NAA 質(zhì)量濃度增加而逐漸提高，當(dāng)質(zhì)量濃度達到3.0 mg/L 時，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為63%，愈傷組織呈淡黃色，逐漸發(fā)生褐化。故附加單一激素時，C2 為最適培養(yǎng)基。

表5 單激素對黃芪下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表6 可知，2，4-D 與6-BA 配比（C13～C17）時，C17 的愈傷組織誘導(dǎo)率最高，可達100%，但愈傷組織褐化程度較高；C16（MS＋2.0 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA）愈傷組織誘導(dǎo)率較高，為88%，且其褐化程度較低。NAA 和6-BA 配比（C18～C22）時，愈傷組織誘導(dǎo)速度較慢，但誘導(dǎo)出的愈傷組織不易發(fā)生褐化，隨著NAA 質(zhì)量濃度的增加，誘導(dǎo)出的愈傷組織由黃褐色變成黃乳白色，其質(zhì)地也由硬實變?yōu)槭杷?，其中，C21（MS＋2.0 mg/L NAA＋1.0 mg/L 6-BA）的誘導(dǎo)率最高，為80%。綜上，C16 為下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基，且誘導(dǎo)率比單獨附加2，4-D 時高。

表6 不同激素配比對黃芪下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同激素配比對黃芪無菌苗葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表7 可以看出，2，4-D 單獨作用（E1～E3）時，以E3 誘導(dǎo)率最高，為65%，但愈傷組織褐化較為嚴(yán)重，不利于芽的分化。雙激素共同作用（E4～E9）時，以E9（MS＋2.0 mg/L 6-BA＋2.0 mg/L NAA）愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為85%，且誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地緊密、堅硬，呈現(xiàn)淺綠色或綠色。此外，當(dāng)培養(yǎng)基中6-BA 與2，4-D 和NAA 配比相同時（E4 與E7、E6 與E8），含有NAA 的愈傷誘導(dǎo)率高于含有2，4-D 的培養(yǎng)基，即E7 和E8 的誘導(dǎo)率高于E4 和E6，且愈傷組織質(zhì)地較緊實。三激素共同作用（E10～E12）時，以E12（MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA＋1.0 mg/L 2，4-D）愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為93%，且生長良好，較E9 的褐化程度低，故E12 為葉片誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基。

表7 不同激素配比對黃芪葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 愈傷組織繼代周期的確定

將下胚軸和葉片誘導(dǎo)的愈傷組織分別轉(zhuǎn)接入篩選出的適宜培養(yǎng)基C16 和E12 中，每5 d 測定愈傷組織的鮮質(zhì)量一次，并繪制生長曲線如圖1 所示。由圖1 可知，下胚軸和葉片誘導(dǎo)的愈傷組織生長曲線均呈S 形，二者變化趨勢基本相同，均未出現(xiàn)明顯的直線生長期。在接種后5 d 進入對數(shù)生長期，且下胚軸誘導(dǎo)的愈傷組織增長快于葉片誘導(dǎo)愈傷組織；下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織生長15 d 后進入緩慢生長期，而葉片誘導(dǎo)的愈傷組織在生長20 d 左右才進入緩慢生長期；2 種愈傷組織均在25 d 后進入生長停滯期。因此，愈傷組織培養(yǎng)以20～25 d 為一個繼代周期，可以保持其旺盛生長。此外，下胚軸誘導(dǎo)的愈傷鮮質(zhì)量均高于葉片誘導(dǎo)的愈傷鮮質(zhì)量。

3 結(jié)論與討論

外植體滅菌是初代培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。李娜等[10]、周吉林[11]分別用濃硫酸、H2O2、砂撞和滅菌的自來水對黃芪種子進行滅菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃硫酸、H2O2腐蝕性強，處理后種子的死亡率較高，且濃硫酸操作危險；砂撞處理安全但發(fā)芽率低。本試驗分別用0.1% HgCl2和2% NaClO 滅菌不同時間以篩選適合黃芪種子滅菌的消毒劑，結(jié)果表明，0.1%HgCl2比2%NaClO 滅菌后種子萌發(fā)率高，滅菌效果好，以0.1%HgCl2滅菌10 min 為蒙古黃芪種子的適宜滅菌方法。

關(guān)于黃芪組培快繁已有不少報道，其研究一方面集中在以腋芽、莖尖或莖段為外植體直接誘導(dǎo)芽萌動叢芽[13-14]，另一方面則通過外植體誘導(dǎo)愈傷組織并分化形成再生植株[15-19]。而影響愈傷組織形成的兩大關(guān)鍵因素為外植體的選擇和培養(yǎng)基中的激素配比[20]。張強等[21]以膜莢黃芪的子葉、下胚軸、幼莖、幼葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，子葉是最佳的外植體，MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L NAA為其愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。本試驗分別以蒙古黃芪的下胚軸和葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下胚軸誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS＋2.0 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA，這與郭生虎等[9]的研究結(jié)果一致。葉片誘導(dǎo)愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為MS＋2.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L 2，4-D＋1.0 mg/L NAA。通過下胚軸愈傷組織和葉片愈傷組織分別在其最適培養(yǎng)基上的生長鮮質(zhì)量曲線可知，黃芪下胚軸愈傷組織生長略強于葉片愈傷組織生長，二者均在生長第5 天進入對數(shù)生長期，第25 天進入生長停滯期。故蒙古黃芪愈傷組織繼代培養(yǎng)以20～25 d為一個周期較為適宜，可保持其旺盛生長。

本研究通過對蒙古黃芪種子萌發(fā)前進行不同的消毒處理，確定0.1%HgCl2滅菌10 min 的發(fā)芽率最高，獲得無菌苗后，以下胚軸和葉片為外植體的愈傷組織誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，MS＋2.0 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L 6-BA 為以下胚軸為外植體愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基，MS＋2.0 mg/L6-BA＋1.0 mg/L2，4-D＋1.0 mg/L NAA 為以葉片為外植體愈傷組織誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率分別為88%和93%。由愈傷組織生長曲線可知，20～25 d 為一個繼代周期。該結(jié)果為蒙古黃芪的組培快繁提供了理論基礎(chǔ)。