朱玉華,朱 琳,劉文娟,劉緒同,魏可健
(深圳市金新農(nóng)科技股份有限公司,廣東 深圳 518107)
仔豬飼養(yǎng)是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié),斷奶后仔豬腹瀉是危害仔豬生產(chǎn)最重要的疾病之一,嚴(yán)重影響仔豬后期生長發(fā)育和養(yǎng)殖效益。在飼料中添加高劑量氧化鋅和抗生素是防止腸道感染、防治斷奶仔豬腹瀉和抗病促生長的傳統(tǒng)手段。隨著濫用抗生素帶來的細(xì)菌耐藥性增強、藥物殘留引起食品安全等問題日益突出,根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告,2020 年7 月1 日起,已全面禁止飼料中促生長類藥物飼料添加劑使用。一些欄舍條件、養(yǎng)殖技術(shù)較差的用戶可能無法適應(yīng)無抗飼料,另外替抗技術(shù)不可避免會增加一定的成本,因此研發(fā)高效低成本的抗生素替代產(chǎn)品、降低無抗飼料成本、保障養(yǎng)殖效益依然是研究的重點。益生菌、微生態(tài)制劑及抗菌肽等具有調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制有害微生物生長、促進(jìn)豬只采食和生長、提高機體免疫機能等特點,作為新型抗生素替代品具有良好的應(yīng)用前景。
腸道黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性是其發(fā)揮消化、吸收和免疫防御等生理功能的基礎(chǔ),斷奶應(yīng)激引起的腸道菌群紊亂和屏障損傷是導(dǎo)致仔豬腹瀉、生長受阻甚至死亡的重要原因。仔豬斷奶時會受到飼料改變、心理應(yīng)激和環(huán)境應(yīng)激等3 方面因素的干擾[1],進(jìn)而造成腸道生理結(jié)構(gòu)和功能、免疫功能及腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變。近年來,腸道菌群在仔豬腹瀉發(fā)生中的作用受到越來越多的關(guān)注。由于全面禁止飼料中添加抗生素,以腸道菌群為靶點尋找新的綠色生物飼料和添加劑防治仔豬腹瀉、促進(jìn)仔豬腸道健康和生長,倡導(dǎo)綠色無抗養(yǎng)殖理念對于養(yǎng)豬生產(chǎn)和人類食品安全都至關(guān)重要[2]。微生態(tài)制劑以及發(fā)酵代謝物、酶制劑、抗菌肽、有機微量礦物質(zhì)飼料添加劑等替代抗生素在添加劑預(yù)混合飼料中的應(yīng)用也越來越廣泛[3-7]。
仔豬在斷奶窗口期生長發(fā)育及生理機能尚不完善,主要包括:消化系統(tǒng)發(fā)育和功能不完善、胃容積小且消化機能不足、免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能不完善。斷奶意味著仔豬的胃腸生理、微生物及免疫發(fā)生著巨大的變化。斷奶后由于日糧形態(tài)改變造成消化道pH升高,有益菌如乳酸菌及雙歧桿菌等含量下降,有害菌如大腸桿菌等大量繁殖、釋放毒素,引發(fā)菌群平衡失調(diào)[8]。在此基礎(chǔ)上原發(fā)或繼發(fā)腸道屏障損傷、上皮細(xì)胞形態(tài)和功能改變,腸絨毛高度降低、隱窩深度增加等,致使仔豬消化吸收功能進(jìn)一步受損[9],而仔豬自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善[10],抗病力差,極易出現(xiàn)生長停滯、精神萎靡、腹瀉等斷奶應(yīng)激綜合征。腸道結(jié)構(gòu)和功能的損傷,會極大減少腸道分泌型免疫球蛋白A(Secretory immunoglobulin A,sIgA),直接黏附腸道黏膜的有害菌增加、釋放毒素,形成腸道損傷的惡性循環(huán)[11]。此外,大量研究表明,斷奶仔豬體內(nèi)磷酸化酶活性降低,糖異生能力較差,碳水化合物等能源物質(zhì)的利用受限,體脂沉積減少,對氨基酸的代謝可能存在缺陷[12-19]。斷奶仔豬的生理特點以及斷奶應(yīng)激、仔豬腹瀉對生產(chǎn)效率的影響現(xiàn)狀,決定了對飼料品質(zhì)、功能和飼喂方式等的特殊要求。
微生態(tài)制劑是指采用正常微生物活菌或促進(jìn)微生物生長的物質(zhì)制成的生物制劑,一切能促進(jìn)機體正常微生物生長或抑制致病菌生長繁殖的均可稱為微生態(tài)制劑。近年來,已研究出含菌體組分及其代謝產(chǎn)物死菌的產(chǎn)品。按照所包含的菌種類型,可將微生態(tài)制劑分為乳酸菌類、酵母菌類和芽孢桿菌類;按其所含菌種的數(shù)量和菌種組合工藝,可分為單一菌種和復(fù)合菌種微生態(tài)制劑。結(jié)合固態(tài)和液態(tài)微生物發(fā)酵工藝以及飼料營養(yǎng)等專業(yè)技術(shù),微生態(tài)制劑已形成種類繁多、應(yīng)用廣泛的一類產(chǎn)品。
微生態(tài)制劑具有促進(jìn)動物腸道有益菌定植、維持機體微生物區(qū)系平衡、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收及增強機體的免疫功能等優(yōu)點。在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中,益生菌制劑本身含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì),具有調(diào)節(jié)腸胃微生態(tài)平衡的功效,且無毒無污染,不產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性,可減緩幼齡動物斷奶應(yīng)激等而備受人們的青睞[20]。已有研究發(fā)現(xiàn),在豬日糧中添加復(fù)合微生態(tài)制劑可達(dá)到提高斷奶仔豬生長速度、防治腹瀉及母豬便秘等作用[21]。
結(jié)合微生態(tài)制劑在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應(yīng)用,其具有以下作用效果。
2.1.1 營養(yǎng)作用 通過微生物發(fā)酵及飼料營養(yǎng)等進(jìn)行合理設(shè)計,可改善飼料風(fēng)味,提高纖維、小肽等營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,提高飼料利用率;同時益生菌代謝可產(chǎn)生各類消化酶、有機酸和一些未知生長因子,例如芽孢桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶等,利于飼料營養(yǎng)物質(zhì)的進(jìn)一步降解從而更易于動物機體消化吸收;此外,菌體蛋白可被動物宿主消化吸收,如酵母菌可作為優(yōu)質(zhì)的單細(xì)胞蛋白原料,富含蛋白質(zhì)、氨基酸和多糖,可提高飼料的適口性,進(jìn)而提高動物采食量,促進(jìn)動物生長性能并能夠增強機體免疫功能[22]。微生物和宿主之間進(jìn)行的營養(yǎng)物質(zhì)、能量和基因的交換,被稱為“三流循環(huán)學(xué)說”,即宿主為機體內(nèi)微生物提供其生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)和能量,微生物再通過自身的合成、代謝和降解,對宿主體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行再加工,實現(xiàn)循環(huán)。
2.1.2 去除飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子 通過微生物發(fā)酵去除豆粕中的大豆抗原蛋白、棉粕中的游離棉酚等,有助于植物蛋白原料在幼齡動物階段的應(yīng)用。研究表明,地衣芽孢桿菌等對霉菌毒素嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等具有良好的降解作用;在當(dāng)前飼料成本居高不下、人畜爭糧等大背景下,通過微生態(tài)制劑及發(fā)酵技術(shù)提高非常規(guī)原料的消化吸收及利用、去除抗?fàn)I養(yǎng)因子,改善原料加工特性及提高適口性等方面具有很好的發(fā)展前景。
2.1.3 提高機體免疫力 大量研究表明,益生菌對動物機體具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用,可通過調(diào)節(jié)腸道菌群區(qū)系平衡、刺激免疫物質(zhì)的活性、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答等多種途徑,加強動物機體的免疫力[15],而且在抗菌、抗病毒及抗霉菌毒素方面效果顯著。此外,微生態(tài)制劑中死菌及代謝產(chǎn)物也具有一定的調(diào)節(jié)腸道微生物區(qū)系的作用,益生菌具有減少腸道細(xì)胞氧化損傷及發(fā)揮抗氧化功能等作用[23]。
2.1.4 抑制病原菌黏附 腸道菌群具有對外來病原微生物的定殖抗力,而益生菌進(jìn)入機體腸道,可與病原體競爭腸道黏膜上有限的附殖位點,達(dá)到抵御病原微生物和條件性致病菌定殖的作用,從而保證機體健康。其作用機制主要為優(yōu)勢菌群理論,即健康動物機體腸道內(nèi)的有益菌群屬于厭氧菌,具有耐酸的特性,而腸道中有害菌大部分是需氧型菌群且不耐酸[24],乳酸菌進(jìn)入動物機體腸道中可通過黏附腸黏膜進(jìn)行定殖,大量定殖的乳酸菌進(jìn)一步降低腸道環(huán)境的pH,達(dá)到抑制有害菌生長和定殖的作用,從而維持腸道菌群平衡和腸黏膜屏障功能[25]。
微生態(tài)制劑具有無毒、無殘留、無耐藥性及可有效補充消化道內(nèi)有益微生物等諸多優(yōu)點,在斷奶仔豬中應(yīng)用可有效緩解仔豬斷奶應(yīng)激和腹瀉情況[26],提高動物機體生長性能等[27]。微生態(tài)制劑不但能提高畜產(chǎn)品質(zhì)量,還能減少環(huán)境污染,但其應(yīng)用效果受多方面因素的限制。目前我國從事微生態(tài)制劑的企業(yè)有上千家,市場上微生態(tài)制劑產(chǎn)品中菌株種類和含量不同,缺乏統(tǒng)一的產(chǎn)品規(guī)范和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)且市場推廣普及率較低,是限制微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)規(guī)模的重要瓶頸。乳酸桿菌等益生菌在益生作用方面具有較好的應(yīng)用潛力,然而其抗逆性差,受生產(chǎn)工藝、儲存運輸、飼喂方式和劑量等條件的影響,導(dǎo)致益生菌的活性嚴(yán)重降低,進(jìn)入動物腸道后仍存活的益生菌種類和數(shù)量大大減少。隨著微生物研究和動物腸道健康調(diào)控觀念的普及,各類微生態(tài)制劑產(chǎn)品不斷涌出,普遍存在菌種來源不明、菌種搭配盲目組合、大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差、多菌種混合發(fā)酵代謝過程不清晰、產(chǎn)品質(zhì)量評價體系缺失等問題,極大地限制了益生菌等微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果。
了解動物腸道微生態(tài)功能,掌握微生態(tài)對動物腸道健康的調(diào)控作用及機制,是進(jìn)一步發(fā)揮微生態(tài)制劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵。在正常的生理狀態(tài)下機體腸道內(nèi)的細(xì)菌無論在菌種還是在數(shù)量上均保持著動態(tài)的平衡,稱為腸道微生態(tài)平衡[28]。腸道菌群自宿主出生后便開始定殖,環(huán)境因素、飲食習(xí)慣、生活方式均可以影響腸道菌群與宿主之間的動態(tài)平衡,這種動態(tài)平衡的維持對機體生長發(fā)育、消化吸收、免疫功能等均具有重要意義。益生菌及其共生菌在腸道黏膜形成的菌膜具有十分重要的作用,不同特性的微生物族群形成優(yōu)勢菌群和酸性厭氧環(huán)境,共同形成相對穩(wěn)定的菌膜結(jié)構(gòu)和生物屏障,形成腸道黏膜定殖抗力,可有效降低有害菌黏附、抵御有害菌及條件性致病菌等對機體的侵襲[29]。
腸道微生物參與構(gòu)成機體腸道黏膜物理屏障、化學(xué)屏障和生物屏障,是機體腸黏膜屏障重要的組成部分,同時免疫激活作用產(chǎn)生IgA 和IgM 及各種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等,有助于動物早期免疫屏障的建立[30]。腸道微生物具有促進(jìn)宿主營養(yǎng)物質(zhì)代謝,自身也可以代謝產(chǎn)生多種維生素、非必需氨基酸等,為自身提供養(yǎng)料的同時也為宿主提供了養(yǎng)分。腸道微生物可分解動物本身難以消化利用的植物性原料如纖維素、半纖維素等,產(chǎn)生短鏈脂肪酸(Short chain fatty acids,SCFAs)。SCFAs 是后腸黏膜細(xì)胞的主要能源來源,其中乙酸、丙酸和丁酸含量最為豐富,腸細(xì)胞發(fā)揮生理功能所需約60%~70%的能量來自于丁酸,對促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞的生長及生理功能的發(fā)揮具有重要作用。SCFAs作為重要的信號因子參與信號通路調(diào)節(jié)機體代謝,可通過激活SCFAs受體、釋放腸激素肽等影響腸胃蠕動,SCFAs 還可影響胃腸道黏液的分泌,維持腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整,促進(jìn)腸道健康[31]。
腸道菌群另一重要作用為調(diào)節(jié)機體代謝和免疫系統(tǒng)功能,在動物出生時機體內(nèi)是無菌的,通過正常菌群的生長逐步刺激機體免疫球蛋白的分泌和釋放,促進(jìn)免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟,逐步構(gòu)建機體正常的免疫機能。同時,腸道免疫系統(tǒng)持續(xù)性地調(diào)節(jié)宿主對病原菌的耐受性,調(diào)節(jié)腸道菌群的穩(wěn)態(tài),二者相輔相成[32]。腸道微生物被認(rèn)為是宿主主要的抗原來源物,如雙歧桿菌、干酪乳桿菌等可刺激腸黏膜細(xì)胞分泌sIgA,sIgA 是腸黏膜免疫的主要效應(yīng)因子,可有效中和黏膜上皮內(nèi)的病原體,激活腸黏膜免疫細(xì)胞因子與免疫應(yīng)答等[32]。無菌動物是研究微生物的重要工具模型,無菌小鼠的潘氏結(jié)發(fā)育程度低,僅有極少的淋巴細(xì)胞和生發(fā)中心,在給無菌小鼠喂服雙歧桿菌后,隨著雙歧桿菌在體內(nèi)定殖,小鼠潘氏結(jié)內(nèi)淋巴濾泡大量增生,產(chǎn)生sIgA數(shù)量增加,腸道黏膜屏障和免疫功能趨于成熟,表明腸道菌群的建立、定殖和成熟,對機體免疫系統(tǒng)的啟動、發(fā)育成熟有著極其重要的作用[33]。腸道菌群對機體非特異性免疫和特異性免疫均有調(diào)控作用,共同形成腸道內(nèi)第一道免疫屏障[34]。
動物腸道健康是保障動物正常生長發(fā)育的前提。隨著畜牧業(yè)實現(xiàn)現(xiàn)代化,健康養(yǎng)殖理念越來越多地受到關(guān)注,而動物腸道健康是健康養(yǎng)殖的關(guān)鍵。飼料中禁止添加抗生素后,如何維持或增強畜禽健康就成為目前研究的重點,尤其是畜禽早期的腸道健康[35]。幼齡動物腸道發(fā)育不健全,尚未建立穩(wěn)定的腸道微生物群,免疫功能發(fā)育不完全,腸道微生態(tài)平衡穩(wěn)定性非常脆弱,易受到各種因素如斷奶、環(huán)境、抗生素等的影響,導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道微生態(tài)紊亂[36]。幫助幼齡動物逐步建立腸道菌群穩(wěn)態(tài)可刺激幼齡動物腸黏膜免疫器官的發(fā)育,增強機體免疫功能,抵抗外來病原菌的侵入,進(jìn)而促進(jìn)腸道健康和動物生長發(fā)育[37]。
在養(yǎng)豬生產(chǎn)中,出生和斷奶是仔豬生長過程中最關(guān)鍵的2 個節(jié)點,初生仔豬腸道的形態(tài)結(jié)構(gòu)不完善,消化吸收機能不健全,易受外界因素的干擾;斷奶窗口期仔豬遭受內(nèi)外應(yīng)激時會引發(fā)腹瀉[38,39]。腹瀉是涉及腸道菌群、腸道免疫生理功能、食物改變、感染等多因素的綜合性問題,利用整體的調(diào)控技術(shù)才能有效改善腹瀉。早期菌群干預(yù)對新生仔豬腸道菌群快速定殖、腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育及對斷奶仔豬腸道菌群的恢復(fù)均具有重要作用。因此,通過營養(yǎng)手段調(diào)控仔豬腸道菌群健康和免疫系統(tǒng)發(fā)育,可有效促進(jìn)仔豬腸道健康。
基因工程技術(shù)是目前生物技術(shù)應(yīng)用的重要組成部分,構(gòu)建重組基因工程菌表達(dá)外源目的產(chǎn)物是獲取新生物制品的有效途徑,基因工程技術(shù)和發(fā)酵工程技術(shù)的有機結(jié)合,使許多非自然存在的外源蛋白或多肽得以規(guī)模化、低成本地生產(chǎn)。用于外源基因表達(dá)的系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞等。其中微生物表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母和芽孢桿菌系統(tǒng),因其生長周期短、培養(yǎng)密度大和蛋白質(zhì)產(chǎn)量高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用,是目前主要的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[40]。大腸桿菌(Escherichia coli)是目前最為成熟的表達(dá)系統(tǒng),具有生長速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點。但是大腸桿菌在表達(dá)外源基因時存在蛋白加工不成熟的問題,如使酶蛋白不能發(fā)生糖基化修飾而活性較低,另外表達(dá)的重組蛋白多以包涵體的形式存在難以分泌到胞外,無法行使其正常的生理功能。酵母表達(dá)系統(tǒng)主要有釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等[41]。釀酒酵母具有繁殖速度快、表達(dá)水平高及可以進(jìn)行蛋白加工和修飾等優(yōu)點,但其分泌效果差、表達(dá)的蛋白易無活性、表達(dá)菌株不穩(wěn)定及糖基化程度過高等缺點也限制了其應(yīng)用范圍。
目前基因工程菌及其表達(dá)產(chǎn)物多停留在實驗室小試階段,鮮有生產(chǎn)應(yīng)用的報道。常規(guī)發(fā)酵工藝表達(dá)效率較低、后期純化成本高,且發(fā)酵后得到的重組產(chǎn)品穩(wěn)定性評估少見報道,重組蛋白質(zhì)喪失活性或其通過消化道容易被所分泌的酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等所降解,這仍是一個急需解決的技術(shù)難題。因此,迫切需要優(yōu)化重組基因工程菌表達(dá)體系和發(fā)酵工藝。通過高密度發(fā)酵制備重組酵母菌生物制劑,大幅提高目的蛋白的產(chǎn)出率和產(chǎn)品質(zhì)量,降低生產(chǎn)成本,評定其在生產(chǎn)上的應(yīng)用效果,為其作為一種新的飼料添加劑積累資料,也為飼用抗生素的替代提供了一條新的解決途徑。此外,基因工程疫苗的佐劑等也是科學(xué)研究與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要方向。
隨著抗生素濫用,畜禽生物安全、環(huán)境污染和食品安全問題日趨嚴(yán)峻,倡導(dǎo)綠色無抗養(yǎng)殖理念對于養(yǎng)豬生產(chǎn)和人類食品安全都至關(guān)重要。斷奶仔豬腹瀉對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,其發(fā)病涉及腸道菌群、腸道生理、免疫功能、營養(yǎng)狀況及感染等多種因素,其中腸道菌群對仔豬腹瀉發(fā)揮著極其重要的作用,以腸道菌群為靶點尋找新的綠色生物飼料和添加劑防治仔豬腹瀉、促進(jìn)仔豬腸道健康和生長是目前研究的重要方向。通過研究不同益生菌、代謝產(chǎn)物及其組合物的生物學(xué)功能和作用機制,有助于開發(fā)促進(jìn)豬只生長、提高機體免疫力,調(diào)控腸道菌群、替代抗生素的高效安全的一系列新型生物制劑。了解正常菌群和動物免疫的相互關(guān)系,研制促進(jìn)菌群平衡和機體免疫機能的微生態(tài)制劑或其他添加劑產(chǎn)品,對于養(yǎng)豬生產(chǎn)中減少抗生素使用、提高豬只生長和機體免疫力、促進(jìn)綠色安全高效的健康養(yǎng)殖具有重要意義。
在非洲豬瘟疫情的常態(tài)化背景下,提高豬只免疫力、促進(jìn)豬群健康是防控非瘟的重要環(huán)節(jié)。集約化養(yǎng)殖使疾病容易交叉感染,細(xì)菌耐藥性日趨嚴(yán)重,多種病原的混合感染愈發(fā)普遍等是當(dāng)前規(guī)?;B(yǎng)殖主要存在的問題,免疫減弱和抑制是動物感染和死亡的主要原因。在飼料中增加一些功能性添加劑產(chǎn)品,不僅能促進(jìn)腸道消化吸收、增進(jìn)腸道健康、提高機體免疫功能,還具有減少抗菌保健用藥、改善養(yǎng)殖環(huán)境、降低腹瀉、降低氨氣含量等作用;飼料微生物技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)已成為解決原料緊缺、替代飼用抗生素的關(guān)鍵技術(shù),對于健康養(yǎng)殖、食品安全、環(huán)保減排等均有積極作用。目前國內(nèi)微生物飼料添加劑的市場容量在180億~200億元,市場推廣普及率僅為約10%,前景十分廣闊,但也存在基礎(chǔ)技術(shù)積累薄弱、菌種種類與性能單一、加工工藝粗放、產(chǎn)品質(zhì)量與功效參差不齊等現(xiàn)象。微生態(tài)生物制劑未來發(fā)展趨勢在于:①篩選更多具有直接促生長作用的優(yōu)良微生物,利用生物工程技術(shù)改造菌群遺傳基因,選育優(yōu)良菌種,使其具有抗酸、抗熱等能力。②加強微生物飼料添加劑菌體濃縮、穩(wěn)定工藝及菌體劑型的研究,提高活菌濃度及其對不良環(huán)境的耐受力,以提高生產(chǎn)效率及產(chǎn)品穩(wěn)定性。③微生物飼料添加劑菌種及其代謝產(chǎn)物功能研究,以篩選高酶活、產(chǎn)酸能力強、抑制病原菌能力強、抗逆性強、生產(chǎn)性能高的菌株,復(fù)合菌體現(xiàn)協(xié)同、疊加和附加值效應(yīng),并且需要重視動物消化道生理變化與微生態(tài)區(qū)系平衡。