韓艷春，荊麗麗，石佳寧，朱昊翔，李宗睿，尚丹丹，王 希

近年乳腺癌已成為我國女性發(fā)病位居首位的惡性腫瘤，部分患者常因發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移而死亡，深入了解乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，才有可能實(shí)現(xiàn)乳腺癌的真正治愈[1]。已有研究表明，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在上皮性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，研究EMT發(fā)生過程的關(guān)鍵因子，探討EMT發(fā)生機(jī)制對(duì)于乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的防治具有重要意義。RASSF7是Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族(ras-association domain family, RASSF)的重要成員之一，與調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和增殖等重要的生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)，在一些腫瘤組織中呈高表達(dá)，并可能促進(jìn)腫瘤的形成。在缺氧誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞mRNA表達(dá)譜中研究發(fā)現(xiàn)存在RASSF7基因高表達(dá)[2]。然而，關(guān)于RASSF7在乳腺癌中的表達(dá)及其生物學(xué)功能研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)初步探討RASSF7在乳腺癌中的表達(dá)及作用。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015～2017年濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院病理科存檔的80對(duì)乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織標(biāo)本。所有患者均為女性，均行手術(shù)切除術(shù)，術(shù)前未行放、化療等治療；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)30例，Ⅱ級(jí)35例，Ⅲ級(jí)15例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期40例，Ⅲ期11例。無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者39例；發(fā)生同側(cè)腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者41例。8對(duì)新鮮乳腺癌及癌旁正常乳腺組織標(biāo)本手術(shù)切除后立即存放于-80 ℃超低溫冰箱中備用。

1.2 試劑乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系購于上海細(xì)胞庫。細(xì)胞于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞待貼壁后分為正常氧對(duì)照組、缺氧組(加入終濃度為200 μmol/L CoCl2)培養(yǎng)48 h。

兔抗人RASSF7、HIF-1α抗體購于武漢三鷹生物公司；兔抗人E-cadherin、vimentin、N-cadherin抗體購于北京博奧森生物公司；鼠抗人單克隆GAPDH抗體購于北京中杉金橋公司；ECL發(fā)光試劑購于Thermo公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉金橋生物公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 乳腺癌及癌旁正常乳腺組織蠟塊標(biāo)本均制成4 μm厚切片，免疫組化染色采用EnVision法。一抗包括RASSF7(稀釋度1 ∶200)、HIF-1α(稀釋度1 ∶300)、E-cadherin(稀釋度1 ∶300)、vimentin(稀釋度1 ∶300)、N-cadherin(稀釋度1 ∶300)，4 ℃孵育過夜。用已知陽性染色的乳腺癌組織切片作為陽性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定：RASSF7陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，HIF-1α陽性主要定位于細(xì)胞核，少量定位于細(xì)胞質(zhì)。按染色細(xì)胞比例劃分為五個(gè)等級(jí)：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)占1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；按染色強(qiáng)弱則劃分為四個(gè)等級(jí)：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色或棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘得分≥2定為RASSF7和HIF-1α陽性。E-cadherin陽性定位于細(xì)胞膜，>50%的細(xì)胞染為棕黃色顆粒為陽性；N-cadherin陽性定位于細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)，>10%的細(xì)胞染為棕黃色顆粒為陽性；vimentin陽性主要定位于細(xì)胞質(zhì)，>10%的細(xì)胞染為棕黃色顆粒為陽性。

1.3.2Western blot法 于-80 ℃超低溫冰箱中備用的乳腺癌及癌旁正常乳腺組織中加入RIPA裂解液，進(jìn)行組織蛋白提取，蛋白濃度測(cè)定采用BCA法。上樣總蛋白為60 μg，于10%的SDS-PAGE中電泳，電泳結(jié)束后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫5%脫脂奶粉封閉2 h，分別用一抗RASSF7、HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin(抗體終濃度均為1 ∶500)進(jìn)行4 ℃孵育過夜。次日，用以辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(稀釋度1 ∶1 500)室溫孵育1.5 h，用ECL發(fā)光并拍照。以GAPDH(稀釋度1 ∶1 500)作為內(nèi)參對(duì)照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Chi-Square檢驗(yàn)分析RASSF7表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)分析RASSF7表達(dá)與HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達(dá)的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌和癌旁正常乳腺組織中RASSF7的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，乳腺癌組織中RASSF7表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。乳腺癌組織中RASSF7的陽性率為70.0%(56/80)，明顯高于癌旁正常乳腺組織(27.5%，22/80)，差異有顯著性(P<0.05)。Western blot法結(jié)果亦證實(shí)，乳腺癌組織中RASSF7蛋白表達(dá)高于癌旁正常乳腺組織(圖2)。

圖1 A.乳腺癌中RASSF7呈陽性，EnVision法；B.癌旁正常乳腺組織中RASSF7呈陰性，EnVision法

圖2 Western blot法檢測(cè)RASSF7在乳腺癌和癌旁正常乳腺組織中的表達(dá)：T.乳腺癌組織；N.癌旁正常乳腺組織

2.2 RASSF7表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中RASSF7陽性率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P=0.002)，TNM高分期的乳腺癌組織中RASFF7陽性率明顯高于TNM低分期者(P=0.027)。RASSF7表達(dá)與乳腺癌患者年齡、腫塊直徑、腫瘤組織學(xué)分級(jí)無相關(guān)性(P>0.05，表1)。

2.3 不同氧環(huán)境下，HIF-1α、RASSF7及EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)水平變化分別比較常氧和低氧條件下培養(yǎng)48 h后，MDA-MB-231細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)水平變化。Western blot法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，低氧環(huán)境下，MDA-MB-231細(xì)胞中上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)顯著降低，間質(zhì)相關(guān)蛋白N-cadherin和vimentin表達(dá)顯著上升，HIF-1α和RASSF7表達(dá)均顯著上調(diào)(圖3)。

2.4 乳腺癌組織中RASSF7與HIF-1α、EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)之間的關(guān)系Pearson相關(guān)檢驗(yàn)顯示，乳腺癌組織中RASSF7與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.245，P=0.029)，RASSF7與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.33，P=0.003)，與vimentin(r=0.237，P=0.034)和N-cadherin(r=0.301，P=0.007)表達(dá)呈正相關(guān)(表2)。

表1 RASSF7表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖3 低氧條件下MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α、RASSF7及EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)變化

表2 乳腺癌中RASSF7表達(dá)與HIF-1α、E-cadherin、vimentin、N-cadherin表達(dá)的關(guān)系[n(%)]

3 討論

近來研究結(jié)果表明，乳腺癌細(xì)胞的EMT是其發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的主要原因。EMT是具有極性的上皮細(xì)胞與基膜作用后上皮細(xì)胞極性消失，獲得間質(zhì)細(xì)胞表型的過程[3-4]。通過EMT過程，乳腺癌細(xì)胞能夠獲得更強(qiáng)的侵襲能力，穿過細(xì)胞外基質(zhì)和血管基膜從而進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶，這是乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟。但目前關(guān)于乳腺癌EMT的機(jī)制尚不明確，需深入探究。

HIF-1α是腫瘤細(xì)胞缺氧的重要標(biāo)志物之一，已有文獻(xiàn)報(bào)道調(diào)控細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的表達(dá)水平可影響其EMT的發(fā)生。乳腺癌細(xì)胞處于缺氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)增加，通過一系列信號(hào)通路介導(dǎo)下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞間連接變疏松，向周圍組織侵襲性生長(zhǎng)，導(dǎo)致遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移[5]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，低氧環(huán)境下，MDA-MB-231細(xì)胞中上皮標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)顯著降低，間質(zhì)相關(guān)蛋白N-cadherin和vimentin表達(dá)顯著上升。以上結(jié)果提示低氧環(huán)境可能與乳腺癌的EMT表型改變有關(guān)。

現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)已證實(shí)低氧環(huán)境下MDA-MB-231細(xì)胞發(fā)生EMT表型改變，后續(xù)進(jìn)一步探討低氧誘導(dǎo)乳腺癌EMT的可能機(jī)制。相關(guān)研究結(jié)果表明RASSF7與調(diào)控細(xì)胞死亡和增殖等重要生物學(xué)進(jìn)程有關(guān)。有報(bào)道指出RASSF7在胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢透明細(xì)胞癌中的表達(dá)水平上調(diào)，且在腫瘤組織中的表達(dá)比正常組織高近百倍，認(rèn)為RASSF7可能促進(jìn)癌癥的形成[6]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RASSF7在乳腺癌組織中呈高表達(dá)。最近有研究表明，在低氧條件下人類細(xì)胞系中RASSF7蛋白表達(dá)上調(diào)[7]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在乳腺癌組織中RASSF7與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，且在低氧環(huán)境下MDA-MB-231細(xì)胞中HIF-1α和RASSF7表達(dá)均顯著上調(diào)。提示HIF-1α和RASSF7可能與低氧誘導(dǎo)乳腺癌EMT有關(guān)。

Wang等[8]報(bào)道DSC1與RASSF7結(jié)合并通過RAS/MEK/ERK信號(hào)通路調(diào)節(jié)胚胎腦中的星型膠質(zhì)細(xì)胞形成。Zhang等[9]報(bào)道RASSF7通過激活MEK1/2-ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖。ERK等信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)其下游轉(zhuǎn)錄因子活性而抑制E-cadherin的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生。Zheng等[10]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染RASSF7質(zhì)粒后可以明顯提高Hippo通路轉(zhuǎn)錄子TEAD的轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下乳腺癌細(xì)胞中RASSF7表達(dá)明顯增加，vimentin和N-cadherin呈高表達(dá)，E-cadherin呈低表達(dá)。且乳腺癌組織中RASSF7與E-cadherin表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與N-cadherin和vimentin表達(dá)呈正相關(guān)，其表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)。以上結(jié)果提示缺氧誘導(dǎo)RASSF7表達(dá)增加，RASSF7與乳腺癌的EMT表型有關(guān)，RASSF7可能通過下調(diào)E-cadherin，上調(diào)vimentin和N-cadherin介導(dǎo)EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移。而RASSF7與乳腺癌EMT具體的關(guān)聯(lián)和機(jī)制如何則有待深入探究。RASSF7在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及機(jī)制，可為乳腺癌的防治和分子靶向治療提供新靶點(diǎn)和思路。