胡美娟，周燕燕，彭 冉，邱 琰，周永杰，楊李波，包 驥，步 宏

去分化脂肪肉瘤作為惡性間葉組織腫瘤的一員，臨床表現(xiàn)具有侵襲性，局部復(fù)發(fā)率達(dá)80%[1]。該病發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移較少，轉(zhuǎn)移率約20%。原發(fā)于腹膜后的腫瘤相比其它部位預(yù)后明顯較差[1]，且易與腹膜后脂肪肉瘤相關(guān)多原發(fā)惡性腫瘤(multiple primary malignant neoplasms, MPMN)混淆[2]。目前治療主要依賴手術(shù)切除，因?yàn)槠鋵?duì)放、化療均不敏感，所以需要尋找有效的分子標(biāo)志物作為診斷標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。目前關(guān)于分子標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)在低分化脂肪肉瘤中的報(bào)道較少。本文通過(guò)獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus,GEO)的去分化脂肪肉瘤和正常脂肪組織的芯片數(shù)據(jù)，基于生物信息學(xué)分析篩選差異表達(dá)基因，對(duì)探究潛在核心基因在去分化脂肪肉瘤的惡性生物學(xué)行為中的作用提供理論依據(jù)，為分析去分化脂肪肉瘤的分子機(jī)制和治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料通過(guò)GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得GSE21122和GSE52390的芯片數(shù)據(jù)，GSE21122數(shù)據(jù)集中包括9例正常脂肪樣本(樣本編號(hào)GSM528425-528433)，46例去分化脂肪肉瘤樣本(樣本編號(hào)GSM528276-528321)；GSE52390數(shù)據(jù)集中包括2例正常脂肪樣本(樣本編號(hào)GSM1264449-1264450)，12例去分化脂肪肉瘤樣本(樣本編號(hào)GSM1264437-1264448)。

1.2 差異表達(dá)基因的篩選通過(guò)GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析，對(duì)去分化脂肪肉瘤和正常脂肪組織之間的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，篩選條件：矯正后P<0.05和|LogFC|≥2，用R包進(jìn)行差異表達(dá)基因的火山圖繪制。分別輸入GSE21122和GSE52390中上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因到https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html，對(duì)差異表達(dá)基因取交集。

1.3 差異表達(dá)基因的基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析GO主要包括以下三個(gè)部分：分子功能(molecular function, MF)、細(xì)胞成分(cellular component, CC)、生物過(guò)程(biological process)。提交差異表達(dá)基因到Funrich 3.1.3軟件(http://funrich.org/)中進(jìn)行GO功能富集分析。

1.4 差異表達(dá)基因的京東基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析KEGG是一個(gè)從分子水平注釋基因功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。將差異表達(dá)基因輸入KOBAS 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)進(jìn)行KEGG通路富集分析，篩選條件為P<0.01，F(xiàn)DR<0.01。

1.5 差異表達(dá)基因的蛋白互作分析將差異表達(dá)基因輸入String11.0在線網(wǎng)站(https://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行蛋白互作分析，參數(shù)設(shè)置為：互作分值低度可信(low confidence:0.15)，隱藏網(wǎng)絡(luò)中的不相關(guān)節(jié)點(diǎn)。

1.6 潛在核心基因的篩選將蛋白互作分析中的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Cytoscape 3.8.0軟件(https://cytoscape.org/)中，用cytoHubba插件按照節(jié)點(diǎn)數(shù)篩選出前10個(gè)基因作為潛在核心基因。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因的篩選通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，分別得到GSE21122的差異表達(dá)基因220個(gè)，64個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，156個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；GSE52390的差異表達(dá)基因173個(gè)，28個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，145個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。通過(guò)韋恩圖取交集，最后得到差異表達(dá)基因68個(gè)，10個(gè)共上調(diào)基因，58個(gè)共下調(diào)基因(圖1、2)。

圖1 差異表達(dá)基因的韋恩圖：10個(gè)共上調(diào)差異表達(dá)基因，58個(gè)共下調(diào)差異表達(dá)基因

圖2 A.GSE21122的差異表達(dá)基因火山圖；B.GSE52360的差異表達(dá)基因火山圖；紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，黑色代表基因變化不顯著

2.2 GO功能富集分析GO功能富集分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集：(1)代謝和能量通路的生物過(guò)程，分別有23個(gè)和22個(gè)基因參與；(2)細(xì)胞外基質(zhì)和線粒體的細(xì)胞組分，分別有7個(gè)和12個(gè)基因參與；(3)細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分和催化活性的分子功能，分別有6個(gè)和8個(gè)基因參與(圖3)。

圖3 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析：A.生物過(guò)程；B.細(xì)胞組分；C.分子功能

表1 差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析

2.3 KEGG通路富集分析KEGG富集分析結(jié)果表明上調(diào)差異表達(dá)基因顯著富集在蛋白消化、吸收信號(hào)通路和AGE-RAGE信號(hào)通路，參與的基因主要有COL1A1、COL1A2和COL3A1；下調(diào)差異表達(dá)基因顯著富集在脂肪細(xì)胞因子、AMPK信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路和調(diào)控脂肪分解信號(hào)通路，參與的基因主要有PNPLA2、LIPE、ADIPOQ、SCD、PLIN1和LEP(表1)。

2.4 蛋白互作分析輸入68個(gè)差異表達(dá)基因到String11.0在線網(wǎng)站后，合計(jì)得到68個(gè)節(jié)點(diǎn)，445條連線，去除不相關(guān)的節(jié)點(diǎn)后構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

2.5 潛在核心基因的篩選用Cytoscape 3.8.0軟件將蛋白互作分析中的數(shù)據(jù)可視化，分別用紅色和綠色代表上調(diào)和下調(diào)的差異表達(dá)基因(圖4A)。通過(guò)CytoHubba插件篩選出前10個(gè)潛在核心基因分別為L(zhǎng)EP、ADIPOQ、SCD、PLIN1、LPL、CAV1、PNPLA2、LIPE、CEBPA和CIDEA，且均在去分化脂肪肉瘤中表達(dá)下調(diào)，其中ADIPOQ、PNPLA2和LIPE富集的信號(hào)通路較多，包括脂肪細(xì)胞因子、AMPK信號(hào)通路、代謝、PPAR信號(hào)通路和調(diào)控脂肪分解信號(hào)通路(圖4B)。

3 討論

去分化脂肪肉瘤是成人脂肪肉瘤中較常見(jiàn)的亞型之一，局部復(fù)發(fā)率較高。目前關(guān)于去分化脂肪肉瘤的研究為在12q13-15區(qū)域上發(fā)現(xiàn)MDM2、CDK4等[3]基因的高水平擴(kuò)增及在1p32、6q23區(qū)域上[4]發(fā)現(xiàn)JUN、ASK1等基因的共同擴(kuò)增[5]。但已有研究表明MDM2的擴(kuò)增并非僅見(jiàn)于去分化脂肪肉瘤，MDM2的抑制劑Nutlin-3也只能有限抑制去分化脂肪肉瘤的生長(zhǎng)，因此需要進(jìn)一步分析去分化脂肪肉瘤發(fā)生過(guò)程中的其它關(guān)鍵基因。從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下載GSE21122和GSE52390的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，使用GEO在線分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)將樣本分為正常脂肪組和去分化脂肪肉瘤組，按照矯正后P<0.05和|LogFC|≥2的條件進(jìn)行篩選，得到220個(gè)GSE21122的差異表達(dá)基因和173個(gè)GSE52390的差異表達(dá)基因，用在線網(wǎng)站VENNY2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取交集后得到共差異表達(dá)基因68個(gè)，然后對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析和蛋白互作分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在篩選的10個(gè)潛在核心基因中，PNPLA2、LIPE、ADIPOQ、SCD、PLIN1和LEP基因的富集通路較多，可以在去分化脂肪肉瘤的下游通路機(jī)制研究中重點(diǎn)關(guān)注。

圖4 A.Cytoscape中的可視化蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖：紅色代表上調(diào)差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)，綠色代表下調(diào)差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)；B.篩選的前10個(gè)潛在核心基因：顏色越深，代表評(píng)分越高

篩選出的68個(gè)差異表達(dá)基因中，按照矯正后P排名上調(diào)最顯著的是COL1A2，下調(diào)最顯著的是LEP。有研究發(fā)現(xiàn)COL1A2和COL1A1這兩條I型膠原在多種類(lèi)型的腫瘤中均表達(dá)異常，可以作為腫瘤治療的新型分子標(biāo)志物[6-7]。Omar等[6]研究表明TBX3結(jié)合并激活COL1A2啟動(dòng)子，分別在軟骨肉瘤和纖維肉瘤細(xì)胞中介導(dǎo)TBX3的促遷移和抗遷移作用。Fang等[7]研究提示COL1A1和COL1A2在肺癌和食管癌中的mRNA表達(dá)水平高于正常組織，但與腫瘤結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，I型膠原的低表達(dá)與總生存期差和癌細(xì)胞分化顯著相關(guān)。Italiano等[8]研究通過(guò)人類(lèi)基因組芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)LEP是乳腺癌的顯著差異表達(dá)基因之一，可以作為腫瘤的新型治療靶點(diǎn)。Kroll等[9]研究表明脂肪蛋白(ADIPOQ)和瘦素(LEP)基因變異與能量攝入存在關(guān)聯(lián)，表明LEP-rs7799039多態(tài)性與能量攝入之間存在正相關(guān)。但是關(guān)于COL1A2和LEP在去分化脂肪肉瘤中的功能缺乏報(bào)道，仍需進(jìn)一步探討。

將差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與代謝和細(xì)胞通訊等生物學(xué)過(guò)程，并且主要涉及脂肪細(xì)胞因子通路、AMPK信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路和調(diào)控脂肪細(xì)胞分解信號(hào)通路。有研究發(fā)現(xiàn)AMPK-mTOR通路是平衡細(xì)胞代謝過(guò)程和調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要開(kāi)關(guān)，通過(guò)激活A(yù)MPK可以抑制mTOR通路[10]。Kikuchi等[11]研究發(fā)現(xiàn)SCD通過(guò)單不飽和脂肪酸調(diào)控AMPK信號(hào)通路，促進(jìn)了癌癥中的代謝重編程，可作為癌癥的潛在治療靶點(diǎn)。Samovski等[12]研究發(fā)現(xiàn)CD36的表達(dá)會(huì)抑制AMPK信號(hào)通路，但同時(shí)CD36與脂肪酸的結(jié)合會(huì)激活A(yù)MPK信號(hào)通路。在去分化脂肪肉瘤組織中，AMPK通路對(duì)于其促進(jìn)或抑制腫瘤的雙重功能需要結(jié)合腫瘤的不同發(fā)展階段來(lái)考慮。Zhao等[13]研究表明AMPK信號(hào)通路的磷酸化底物ULK1是自噬的核心基因之一，可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而發(fā)揮抗腫瘤作用。有研究發(fā)現(xiàn)鐵死亡在多數(shù)腫瘤的病理生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[14]，通過(guò)激活A(yù)MPK可降低多不飽和脂肪酸的合成，從而抑制鐵死亡，促進(jìn)腫瘤發(fā)生[15]。Sultan等[16]研究表明在PPAR-γ信號(hào)通路中顯著富集的基因PLIN1在乳腺癌中低表達(dá)，可以作為乳腺癌早期診斷的新靶點(diǎn)。Lu等[17]研究發(fā)現(xiàn)奧利多寧在體外和體內(nèi)通過(guò)激活PPAR-γ通路和抑制Nrf2通路來(lái)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，可以作為骨肉瘤的靶向藥物。在去分化脂肪肉瘤中，Horvai等[18]研究表明PPAR-γ的免疫表型再結(jié)合其他標(biāo)志物可以方便診斷去分化脂肪肉瘤和其它分化良好的脂肪肉瘤。Kim等[19]研究發(fā)現(xiàn)ADIPOQ通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)增加PPAR-α的表達(dá)，進(jìn)而激活PPAR-γ核受體共激活因子PGC-1α，從而調(diào)節(jié)脂肪代謝和誘導(dǎo)抗癌作用。以上研究結(jié)果表明AMPK、PPAR和脂肪細(xì)胞因子等信號(hào)通路在去分化脂肪肉瘤的發(fā)生中可能存在相互作用，仍需要進(jìn)一步探究。

利用String對(duì)差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，再通過(guò)Cytoscape篩選的10個(gè)潛在核心基因，均在去分化脂肪肉瘤中下調(diào)表達(dá)。Codenotti等[20]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)一致的脂肪生成分化特征，可將CAV1作為脂肪肉瘤的分子標(biāo)志物。Taylor等[21]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)去甲基化能恢復(fù)去分化脂肪肉瘤細(xì)胞中的CEBPA表達(dá)，發(fā)揮體外抗增殖、促凋亡及體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。Straub等[22]研究發(fā)現(xiàn)PLIN1可作為脂肪肉瘤與其他軟組織肉瘤診斷的潛在治療靶點(diǎn)。Cytoscape軟件預(yù)測(cè)的潛在核心基因與上述研究中報(bào)道的基因比較一致，結(jié)果表明這些基因可能是去分化脂肪肉瘤惡性生物學(xué)行為中的潛在核心基因。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了去分化脂肪肉瘤的潛在核心基因均表達(dá)下調(diào)，并初步分析其相關(guān)的生物過(guò)程和信號(hào)通路，為未來(lái)去分化脂肪肉瘤的發(fā)病機(jī)制和靶向研究提供理論依據(jù)。