劉媛媛，劉娜，付建軍，李紅兵，黃輝紅，寧博，唐先梅，何英利，趙英仁，劉錦鋒

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西 西安 710061；2.西安市中心醫(yī)院感染科，陜西 西安 710003；3.延安大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科，陜西 延安 716000；4.渭南市中心醫(yī)院感染科，陜西 渭南 714000；5.安康市中心醫(yī)院感染科，陜西安康 725000；6.寶雞市中心醫(yī)院感染科，陜西 寶雞 721000；7.漢中3201醫(yī)院感染科，陜西 漢中 723099

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)為黃病毒科的一種，大小為55～65 nm，有包膜的正單鏈RNA 病毒。丙型肝炎病毒是由哈維·奧爾特、邁克爾·霍頓和查爾斯·M·賴斯所發(fā)現(xiàn)，并且三人均在2020年獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。丙型肝炎病毒在體內(nèi)感染后6 個月內(nèi)，因約80%的患者無明顯臨床癥狀，從而錯過了最佳治療時期。丙型肝炎病毒在體內(nèi)持續(xù)潛伏，導(dǎo)致肝臟慢性炎癥，進(jìn)而發(fā)展為肝硬化及肝癌，因此丙肝已成為我國乃至世界主要的公共衛(wèi)生問題，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。由于HCV 病毒聚合酶缺乏校正功能的特點，使其自身基因組序列容易發(fā)生變異，目前研究已發(fā)現(xiàn)7個基因型及100多種亞型。不同基因型與肝病進(jìn)展、肝癌發(fā)生及抗病毒藥物療效等密切相關(guān)。不同地區(qū)HCV基因型分布特點與感染、傳播路線密切相關(guān)，由于人口流動性增加及感染途徑的變化，HCV 基因型的分布也不斷變化。探討HCV 基因型的地域分布特征對于了解HCV病毒傳播路線、制訂合理而有效的診療方案、制訂合適的防控措施具有重要的研究價值。相關(guān)資料顯示，陜西省大樣本的HCV基因分型數(shù)據(jù)缺乏，因此，本研究對陜西省陜南、關(guān)中、陜北三個主要地理區(qū)域HCV感染者進(jìn)行基因分型，以了解陜西省HCV基因型的分布特征，為丙肝的治療及預(yù)防提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年12月在陜西省7 家市級醫(yī)院(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安市中心醫(yī)院，延安大學(xué)附屬醫(yī)院，渭南市中心醫(yī)院，安康市中心醫(yī)院，寶雞市中心醫(yī)院，漢中3201醫(yī)院)就診的2827例HCV患者作為研究對象，所有患者均符合《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》中HCV相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)且分型前未接受過抗病毒相關(guān)治療，排除因其他病毒所致的肝炎及酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等其他導(dǎo)致肝臟病變的疾病。收集所有患者的臨床資料，包括性別、年齡、居住地區(qū)等。其中，男性1639 例，女性1188 例；年齡17～75 歲，平均(46.35±14.38)歲；陜北地區(qū)(榆林、延安)298 例，陜南地區(qū)(漢中、安康)213 例，關(guān)中地區(qū)(西安、寶雞、渭南)2316 例。

1.2 方法

1.2.1 血清標(biāo)本采集 于晨間抽取兩組患者入院時的靜脈血10 mL，置于室溫下靜置24 h，離心后取陽性血清1.0 mL用Eppendor離心管分裝，-70℃保存標(biāo)本。

1.2.2 HCV基因型檢測 采用PCR-熒光探針法進(jìn)行HCV基因型檢測，試劑盒購自泰普生物科學(xué)有限公司，所有操作均嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。PCR-RDB分子雜交提取HCV 基因分型RNA 的方法：①取已滅菌離心管，依次加入50 μL RNA 蛋白酶K、200 μL 血清、200 μL 裂解液。②搖蕩均勻后，通過離心泵高速離心10 s，放于72℃環(huán)境中靜置10 min。③在其中加入250 μL 無水乙醇，使其充分融合在一起，再將其轉(zhuǎn)入離心柱中。以12000 r/min離心1 min后，除去離心液。④在離心柱中加入500 μL抑制去除液，以12000 r/min離心1 min，然后加入500 μL去離子液，以12000 r/min離心1 min，再重復(fù)一次，最后將離心柱移入新的收集試管中。⑤將離心柱以14000 r/min 離心3 min 以除去殘余乙醇。⑥將離心柱移入新的無菌離心管中，放于72℃環(huán)境中靜置2 min，再加入已預(yù)熱的50 μL洗脫液，室溫下靜置1 min，再以14000 r/min 離心1 min。⑦在試管中加入30 μL 提取的病毒核酸，按PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行擴增：第一次為：94℃5 min，然后再以以下方式進(jìn)行循環(huán)：94℃40 s；50℃40 s；72℃40 s，30個循環(huán)；第二次為：94℃5 min，按以下方式循環(huán)：94℃40 s；54℃40 s；72℃40 s，30個循環(huán)。所有檢測孔均設(shè)置為FAM 和HEX，熒光信號收集：60℃45 s；反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline 的Start 值，End 值以及Threshold 值，點擊Analysis 自動獲取分析結(jié)果，在Report界面查看結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo) 采用PCR-熒光探針法檢測HCV 基因型分型，對比不同地區(qū)、不同性別患者間的HCV基因型分布情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計數(shù)資料的統(tǒng)計描述采用百分率表示，多個樣本率間的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因分型結(jié)果 本組2827例HCV感染者中，有2595 例成功分型，檢出率為91.79%。其中1b 型1049 例，占37.11%；2a型1241例，占43.90%；1a型25例，占0.88%；2b型13例，占0.46%；3a 型181例，占6.4%；3b型50 例，占1.77%；6a 型36例，占1.27%，見圖1。

圖1 陜西省HCV基因型分布

2.2 陜西省三大地區(qū)HCV基因分型特征 關(guān)中和陜北地區(qū)，以2a 型為主，分別占43.36%和47.99%，而陜南以1b 型為主，占52.11%，三個地區(qū)的基因型分布比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=119.4，P＜0.05)；兩兩比較發(fā)現(xiàn)，陜南與關(guān)中、陜北與關(guān)中、陜南與陜北之間的基因型分布差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=54.355，62.274，36.976；P＜0.05)，見表1和圖2。

表1 陜南、陜北、關(guān)中地區(qū)HCV基因型分布比較(例)

圖2 陜西省陜南、關(guān)中、陜北地區(qū)HCV基因分型分布

2.3 性別與HCV基因型的關(guān)系 納入的丙肝男性患者中2a 型比例最高(40%)，其次是1b 型(39%)和3a型(15%)；女性患者中2a型和1b型比例相同(46%)，其次是3a型(4%)。2a、1b型在不同性別組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.734，1.003；P＞0.05)，3a型在不同性別組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.037；P＜0.05)，見圖3。

圖3 不同基因型的性別比較

3 討論

HCV 是一種流行于全球的RNA 病毒，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球約有1.7億的人口感染慢性HCV[1]。由于HCV的高遺傳變異性，目前HCV表現(xiàn)為7種基因型和100多種亞型，國際上通常采用阿拉伯?dāng)?shù)字(1～7)代表基因型，英文小寫字母代表基因亞型(如1a、1b等)。研究顯示，不同基因型或亞型感染的地理分布存在差異。1，2，3 型于全球最高，其中1 型約有8340 萬患者(46.2%)，幾乎占所有感染者的一半，且超過1/3的患者位于東亞；其次是3 型約有5430 萬感染者(30.1%)，且3/4的患者分布于南亞，據(jù)伊朗權(quán)威數(shù)據(jù)顯示，在伊朗地區(qū)，基因3 型為主要基因型，占90.3%左右[2]；2、4和6型感染者分別為1650萬(9.1%)，1500萬(8.3%)和980萬(5.4%)，2型和6型病例于東亞最多，而北非和中東的4 型病例較多；有研究顯示5 型可能是全球最少的HCV 基因型，大約140 萬人感染，大部分發(fā)生在南部和東部撒哈拉以南的非洲；迄今為止，7型是從一名居住于加拿大的中非移民體內(nèi)分離出來的，僅有此一例[3]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，長期的慢性丙型病毒性肝炎與肝硬化、原發(fā)性肝癌甚至肝衰竭密切相關(guān)[4]，而HCV基因型與抗病毒藥物的療效密切相關(guān)，如1a、1b 型易發(fā)生嚴(yán)重肝臟疾病以及對干擾素治療的低反應(yīng)，且1b 型患者患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險更大[5]。因此，探討HCV基因分型的地域性分布特征對于明確HCV病毒的演變及基因分型的轉(zhuǎn)化、制訂合理有效的診療方案具有重要的研究價值和意義。

我國是一個幅員遼闊，人口眾多的國家，丙肝的分布同全球略有不同。莊輝院士對我國各省慢性丙肝感染人群采取分層抽樣的方法調(diào)查后，顯示1b型為我國最主要基因型(56.8%)，但因我國地域廣闊，不同地區(qū)間差異較大[6]。其次為2a型。我國南方和北方的基因型分布也不相同，且基因型3a型、3b型、6a型正逐漸增加，同時1b型和2a型正處于降低趨勢[7]。一項納入29個省市自治區(qū)的32030例HCV感染者大樣本調(diào)查研究同樣發(fā)現(xiàn)1b(52.18%)、2a(28.69%)為我國最主要的基因型[8]。在我國北方地區(qū)HCV 基因型比較單一，以1b 和2a 為主；南方地區(qū)的HCV 基因型種類較多，以1b型為主，其次為2a、3a、3b，各型均占有較大比例。但一些地區(qū)基因型分布較特殊，例如云南省以3b型為主、香港以6a型為主。近幾年，由于受流動人口、涉毒人員增加、經(jīng)濟(jì)全球化、人員流動頻繁等因素影響，使得原有基因型分布狀況發(fā)生改變，例如，由于社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口流動的增加等因素，6a型已經(jīng)取代了2a型，成為廣東第二大丙肝基因型[9-10]。

本研究是目前樣本量最大的關(guān)于陜西省HCV 基因型分析，所研究結(jié)果為我省慢性丙肝患者進(jìn)行個體化抗病毒治療、經(jīng)濟(jì)且有效預(yù)防HCV傳播具有重要意義。本研究采用大樣本調(diào)查研究的方式，在陜西省三大地區(qū)(陜南、陜北、關(guān)中)的地區(qū)級中心醫(yī)院，收集了共2827例HCV感染者血清，結(jié)果顯示陜西省丙肝基因分型以2a型(43.90%)為主，其次依次為1b型(37.11%)，3a型(6.40%)，3b型(1.77%)。本研究顯示，陜南、陜北及關(guān)中病毒基因型并不完全一致，陜南以1b型為主，因地理位置、生活習(xí)慣等不同，對HCV 感染及傳播途徑也不盡相同。由于秦嶺這一天然分界線的存在，陜南地理位置更接近于四川，基因分型也更接近于四川[11-12]。本研究顯示陜北和關(guān)中均以2a型為主，2a型在我國丙肝基因型中僅次于1b型，而在陜西地區(qū)則排第一。在我國，2a型始于1979年，在此之前集中在西北地區(qū)，可能與毒品沿古代絲綢之路從西方和中亞運輸?shù)轿覈嘘P(guān)。并且我國西北部的2a型菌株和日本菌株很接近，提示2a型可能是流行于中國北部地區(qū)，特別是我省的原因之一[13]。基因型3a和3b在靜脈吸毒者中非常常見，主要在歐洲，美國和東南亞地區(qū)，我國主要集中在我國西南地區(qū)(云南、貴州、四川)和東部地區(qū)，尤其是靜脈吸毒的艾滋病患者，甚至高于1b型[14]。本研究顯示3a基因型在我省占有一定比例，考慮與鄰近國家(如阿富汗、阿塞拜疆、烏茲別克斯坦、白俄羅斯等)通過販運毒品傳播到中國以及與經(jīng)濟(jì)發(fā)展導(dǎo)致的人口流動性增加有關(guān)。

研究顯示，丙肝基因型分布可能與性別有關(guān)，在利比亞人群中，基因1 型中男性比例較高，而4 型則多發(fā)生于女性[15]；而在希臘的一項研究中顯示，1 型在老年人和女性中更常見，3 型在年輕人和男性中較常見[16]。此外，丙肝基因型分布在很大程度上受傳播途徑的影響，例如在年輕男性中，通過注射吸毒進(jìn)行持續(xù)傳播顯示出較高的患病率，而在受感染人群年齡較大的國家中，則是通過母嬰傳播和不安全血液制品的使用等途徑傳播[17]。Christer 在一項靜脈吸毒人群中研究性別對HCV 感染的影響中指出，在納入的310 例靜脈吸毒人群中，268 例吸毒人員HCV 抗體陽性(86.5%)，其中207例可以檢測出HCV-RNA。1型和3 型基因分別占35.9%和33%，女性在HCV 感染中更容易自發(fā)性的恢復(fù)，可能導(dǎo)致相對性的男性吸毒人員HCV比例的升高[18]。在我國多個地區(qū)，均有研究顯示在吸毒人群中，男性所占比例明顯高于女性。本研究結(jié)果顯示，女性丙肝患者以2a，1b型為主，男性患者最多的2a型，其次是1b型和3a型，且男性3a型比例明顯高于女性，考慮與通過販運毒品傳播到中國，且吸毒人員中，男性所占比重較大有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示陜西省的HCV 基因型的分布特征不同于省外其他地區(qū)，主要以2a 型、1b 型、3a 型為主，且3a 型基因型分布可能與性別有關(guān)，這將有助于了解陜西省不同地理區(qū)域丙型病毒性肝炎的流行病學(xué)趨勢，為疾病防控部門提供依據(jù)，也將為臨床工作者制訂更加合理且有針對性的診療方案和藥物的合理選擇提供幫助。