朱冰清,姜 晟,蔡 琨,張小瓊,李旭文,徐東炯,劉 佳

1.江蘇省環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,江蘇 南京 210019

2.江蘇省常州環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,江蘇省環(huán)境保護(hù)水環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 常州 213001

3.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院,北京 100012

近年來(lái),隨著我國(guó)工業(yè)化的快速發(fā)展,排放到空氣、水體及土壤中的化學(xué)污染物的總量大幅增長(zhǎng),對(duì)生態(tài)環(huán)境、群眾健康和社會(huì)穩(wěn)定造成的危害不容小覷[1]。 對(duì)水體水質(zhì)影響嚴(yán)重的工業(yè)廢水主要來(lái)自冶金、化工、印染和造紙等行業(yè),該類廢水中所含的大量有毒有害物質(zhì)具有成分復(fù)雜、毒性大、不易被生物降解和污染范圍廣等特點(diǎn)[2]。大量“三致”物質(zhì)隨廢水排放至自然水體,會(huì)造成江河湖庫(kù)水質(zhì)安全問(wèn)題及生態(tài)系統(tǒng)退化。 縱觀全球,水環(huán)境質(zhì)量不容樂(lè)觀。 由于缺乏對(duì)點(diǎn)源污染物排放的控制,北美有40%的流域受到工業(yè)廢水污染;歐洲部分流域僅有36%的水域達(dá)到《歐盟水框架指令》中的良好生態(tài)狀況標(biāo)準(zhǔn);由于缺少完善的污水處理設(shè)施,非洲部分流域遭受大面積水質(zhì)污染[3]。 據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),2018 年我國(guó)工業(yè)廢水排放量達(dá) 183 億噸, 占廢水排放總量的23.52%,造紙、制品制造、紡織等行業(yè)的化學(xué)需氧量(COD)和氨氮(NH3-N)排放量占工業(yè)源排放總量的比例超過(guò)50%。 常規(guī)污染物問(wèn)題尚未解決,新型污染物持續(xù)出現(xiàn),水質(zhì)綜合污染形勢(shì)十分嚴(yán)峻。 工業(yè)廢水排放量大,如果處理措施落實(shí)不到位,排放到自然水體中的大量工業(yè)廢水易對(duì)生態(tài)環(huán)境健康和安全產(chǎn)生負(fù)面影響,對(duì)受納水體中的水生生物產(chǎn)生生理、生化方面的毒害作用,導(dǎo)致物種密度的降低及生物多樣性的減少,甚至威脅到人類的生命安全[4]。

目前,對(duì)工業(yè)廢水的監(jiān)測(cè)和處理主要針對(duì)懸浮物、COD 和NH3-N 等理化指標(biāo)。 理化分析可以對(duì)水體中污染物的種類和濃度進(jìn)行比較快速和靈敏的分析測(cè)定,但大部分監(jiān)測(cè)只能反映瞬時(shí)樣品的污染水平,無(wú)法判斷排水是否安全,監(jiān)測(cè)結(jié)果很難準(zhǔn)確反映復(fù)雜的水環(huán)境健康變化趨勢(shì),不能滿足水體安全保障、監(jiān)管與評(píng)價(jià)的需求。 在受污水體中,生物的分布和生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)首先受到影響。生物監(jiān)測(cè)就是利用生物種群、個(gè)體和細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、功能、生理狀況等指標(biāo)上的變化,來(lái)對(duì)環(huán)境介質(zhì)中的毒害物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)。 2015 年,國(guó)務(wù)院發(fā)布了《水污染防治行動(dòng)計(jì)劃》,明確提出要提升水生生物監(jiān)測(cè)技術(shù)支撐能力,提高環(huán)境監(jiān)管能力。生物監(jiān)測(cè)技術(shù)的應(yīng)用已不僅僅是為了彌補(bǔ)理化監(jiān)測(cè)的不足,而是作為一項(xiàng)綜合性監(jiān)測(cè)從不同的視角深化水環(huán)境監(jiān)測(cè),有助于水環(huán)境管理目標(biāo)從“水污染防治”向“水生態(tài)健康”的轉(zhuǎn)變[5]。 相比傳統(tǒng)理化分析,生物監(jiān)測(cè)可以系統(tǒng)反映環(huán)境中的有害物質(zhì)對(duì)生物生長(zhǎng)的影響,及其在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化與遷移,可以表征生態(tài)環(huán)境的長(zhǎng)期綜合質(zhì)量狀況,在環(huán)境監(jiān)測(cè)、綜合評(píng)價(jià)和生態(tài)預(yù)警過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。 本文就生物監(jiān)測(cè)技術(shù)在工業(yè)廢水監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了論述,并對(duì)其研究前景進(jìn)行了展望,以期為生物監(jiān)測(cè)技術(shù)在水環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 工業(yè)廢水生物監(jiān)測(cè)研究進(jìn)展

常見(jiàn)的工業(yè)廢水生物監(jiān)測(cè)方法主要包括微生物群落監(jiān)測(cè)法和生物毒性測(cè)試法。 隨著DNA 重組技術(shù)的建立,基于分子生物學(xué)的現(xiàn)代生物監(jiān)測(cè)技術(shù)也被逐漸引入環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。

1.1 微生物群落監(jiān)測(cè)法

不同于普通清潔水體監(jiān)測(cè)常用的生物群落指標(biāo)(浮游生物、底棲動(dòng)物、著生生物等),工業(yè)廢水監(jiān)測(cè)通常采用微生物群落指標(biāo),即通過(guò)掌握廢水微生物群落組成、豐度及分布的變化規(guī)律,來(lái)判斷和評(píng)價(jià)水質(zhì)變化情況及污水處理效果[6]。 以下主要圍繞以傳統(tǒng)培養(yǎng)為主的聚氨酯泡沫塑料塊法(PFU)和基于分子生物學(xué)的微生物群落監(jiān)測(cè)法進(jìn)行論述。

1.1.1 PFU 法

19 世紀(jì)以來(lái),隨著工業(yè)革命的興起,大量工業(yè)廢水、生活污水未經(jīng)處理直排入河,導(dǎo)致受納河道生態(tài)系統(tǒng)面臨極大挑戰(zhàn)。 美國(guó)CAIRNS 等[7]于1966 年首次采用PFU 法測(cè)定了微生物的群集速度,對(duì)水體水質(zhì)進(jìn)行了監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)。 該方法僅需將PFU 塊放入受污染水體中,暴露一定時(shí)間后,通過(guò)實(shí)驗(yàn)室鏡檢觀察PFU 孔中微生物群落的種群結(jié)構(gòu),即可判斷水體受污情況。 由于幾乎不受污水類型和時(shí)間、空間的限制,且操作簡(jiǎn)單,PFU法被廣泛應(yīng)用于工業(yè)排放廢水、城鎮(zhèn)生活廢水和各類污水的監(jiān)測(cè)。 自20 世紀(jì)80 年代起,國(guó)內(nèi)開(kāi)始采用PFU 法從群落水平評(píng)價(jià)不同污染類型水體的水質(zhì)狀況。 1985 年,沈蘊(yùn)芬院士等[8]首次利用PFU 法采集了微生物群落,通過(guò)分析微生物種群在農(nóng)藥廢水中的集群過(guò)程,監(jiān)測(cè)、評(píng)價(jià)了水域農(nóng)藥污染情況。 其研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),PFU 法是一種操作簡(jiǎn)便、迅速且經(jīng)濟(jì)的生物監(jiān)測(cè)方法,可用作判定廢水中污染物的生物效應(yīng)。 1991 年,經(jīng)過(guò)多年改進(jìn)和完善,我國(guó)對(duì)PFU 法進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化,制定了《水質(zhì) 微型生物群落監(jiān)測(cè)PFU 法》(GB/T 12990—1991)。 同時(shí),基于群落水平的PFU 毒性試驗(yàn)也被用作預(yù)報(bào)工業(yè)廢水對(duì)受納水體中微生物群落的毒性強(qiáng)度,為制定工業(yè)廢水安全排放濃度提供了科學(xué)依據(jù)。 陳旭[9]和鄭鑫[10]使用原生動(dòng)物群落對(duì)冶金工業(yè)廢水的毒性效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)價(jià),并與理化監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)方法(綜合污染指數(shù)法)進(jìn)行了比較,發(fā)現(xiàn)兩種監(jiān)測(cè)方法的結(jié)果趨勢(shì)基本一致,并且相比理化分析方法,PFU 法可以進(jìn)一步反映潛在污染物的綜合毒性。 李朝霞等[11]采用PFU法評(píng)價(jià)了江蘇鹽城沿?；@區(qū)的靜態(tài)毒性,發(fā)現(xiàn)原生動(dòng)物群落對(duì)化工廢水效應(yīng)濃度(EC)的變化非常敏感,隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),微生物種群多樣性指數(shù)下降、種類減少、群集速度明顯降低,說(shuō)明化工廢水有較強(qiáng)的生物脅迫效應(yīng)。 DING 等[12]采用PFU 法對(duì)造紙廢水的生物累積效應(yīng)和生態(tài)毒性進(jìn)行了監(jiān)測(cè),其中,靜態(tài)毒性試驗(yàn)表明,原生動(dòng)物群落對(duì)造紙廢水中毒素反應(yīng)時(shí)間和效應(yīng)濃度的變化非常敏感。 相比其他水生生物群落法,PFU 法可以準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)地監(jiān)測(cè)并反映水質(zhì)突變,被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境質(zhì)量與狀況預(yù)警。

1.1.2 基于分子生物學(xué)技術(shù)的微生物群落監(jiān)測(cè)法

過(guò)去,工業(yè)廢水大多未經(jīng)處理直接排放至自然水體,而如今大部分污水均通過(guò)污水處理廠或納入污水處理管網(wǎng)處理后達(dá)標(biāo)排放,導(dǎo)致排水中微生物群落的數(shù)量及種類較過(guò)去大幅下降,因此,如仍采取傳統(tǒng)PFU 法進(jìn)行微生物群落監(jiān)測(cè),存在富集時(shí)間長(zhǎng)、時(shí)效性差等問(wèn)題。 不斷發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)為微生物群落監(jiān)測(cè)提供了新方向,該技術(shù)可以同時(shí)從物種和基因水平評(píng)估微生物群落的豐度和多樣性等特征。 基于核酸雜交的微生物群落分析方法是在一定條件下以被標(biāo)記的特異性單鏈核苷酸片段為探針,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則,與目標(biāo)樣品中微生物的核苷酸形成雜交分子,從而通過(guò)自顯影或者發(fā)光技術(shù)對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[13]。 利用該技術(shù)可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)廢水中的菌種豐度、多樣性和一些重要致病菌進(jìn)行檢測(cè),提高了微生物檢測(cè)的時(shí)效性。 核酸雜交技術(shù)無(wú)需對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),可以減少PCR 過(guò)程中產(chǎn)生的誤差,但未經(jīng)擴(kuò)增的基因濃度較低,也會(huì)給檢測(cè)帶來(lái)困難。 同時(shí),由于微生物存在亞群類的差異,如果設(shè)計(jì)的探針核苷酸序列與某些亞群目標(biāo)基因的互補(bǔ)性較差,會(huì)造成某些微生物群落檢測(cè)結(jié)果的假陰性。

PCR 技術(shù)則是通過(guò)選取目標(biāo)微生物的特異性基因進(jìn)行體外脫氧核糖核酸(DNA)合成反應(yīng),然后對(duì)擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行分析,從而確定環(huán)境基質(zhì)中微生物的種類與含量。 相比傳統(tǒng)的微生物監(jiān)測(cè)方法,PCR 技術(shù)特異性好、靈敏度高,且具有較高的可重復(fù)性。 就工業(yè)廢水而言,利用PCR 技術(shù)可以對(duì)樣品中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行更詳盡的深度分析。 通過(guò)采用16S rRNA 特異性片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,可以對(duì)廢水中的微生物進(jìn)行精準(zhǔn)鑒定和定量分析[14-16]。 基于16S rDNA 的PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)則是利用不同序列組成的DNA 在變性梯度電泳膠上變性后跑膠速度的不同,來(lái)區(qū)分、鑒別不同的DNA 片段。 提取樣本中微生物的DNA 后,通過(guò)對(duì)特征序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,再利用DGGE 方法分離擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物,可以客觀、完整地判斷廢水中微生物群落的組成及功能。 采用PCR-DGGE 技術(shù)分析石化、冶金和制藥廢水處理系統(tǒng)中的微生物結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)不同廢水中的微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)差異很大,研究結(jié)果對(duì)于優(yōu)化不同類型工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中活性污泥的微生物工藝具有重要意義[17-19]。

為進(jìn)一步降低樣品量大小、采樣難易程度的限制,高通量測(cè)序技術(shù)也被應(yīng)用于對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的深入研究,尤其是二代測(cè)序技術(shù)使直接研究自然條件下的微生物種群結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)變化成為可能,還把對(duì)環(huán)境微生物的認(rèn)識(shí)從物種水平上升到基因功能水平,極大地拓展了對(duì)環(huán)境微生物的認(rèn)知[20]。 HU 等[21]應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)采用不同處理工藝的污水處理廠曝氣池中的微生物群落進(jìn)行了監(jiān)測(cè)研究,發(fā)現(xiàn)處理方法的差異會(huì)直接導(dǎo)致污水中優(yōu)勢(shì)菌群的改變。 LU 等[22]利用該技術(shù)研究了不同類型生產(chǎn)企業(yè)排放的廢水對(duì)受納河道中微生物生態(tài)系統(tǒng)的影響,發(fā)現(xiàn)各類廢水均會(huì)影響水生生態(tài)系統(tǒng)的自然變化,導(dǎo)致環(huán)境生物均質(zhì)化。

綜上,基于微生物群落的廢水生物監(jiān)測(cè)技術(shù)可以準(zhǔn)確、直觀地反映水質(zhì)突變,被廣泛應(yīng)用于水環(huán)境質(zhì)量與狀況監(jiān)控預(yù)警。 在微生物群落監(jiān)測(cè)中引入分子生物學(xué)技術(shù),可以更加快速地獲得水體中微生物的結(jié)構(gòu)、功能及遺傳多樣性等信息,便于優(yōu)化和調(diào)整污水處理系統(tǒng)。

1.2 生物毒性測(cè)試法

盡管理化監(jiān)測(cè)可以快速、準(zhǔn)確地判斷污染物的環(huán)境水平,但對(duì)于污染物成分通常比較復(fù)雜的工業(yè)廢水來(lái)說(shuō),該方法難以反映全部污染組分對(duì)環(huán)境的綜合影響。 生物毒性測(cè)試法可以綜合反映廢水中各種污染物的相互作用,判定污染水平與生物效應(yīng)的直接關(guān)系。 目前常用的工業(yè)廢水生物毒性分析方法有發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試法、藻類毒性測(cè)試法、蚤類毒性測(cè)試法和魚(yú)類毒性測(cè)試法等,詳見(jiàn)表1。

1.2.1 發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)試法

由于發(fā)光細(xì)菌對(duì)有毒物質(zhì)的靈敏度高,且檢測(cè)結(jié)果與理化分析指標(biāo)有較好的相關(guān)性,利用發(fā)光細(xì)菌監(jiān)測(cè)工業(yè)廢水毒性的方法已相對(duì)成熟。 該方法根據(jù)細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度與水體毒性之間的相關(guān)性,以相對(duì)發(fā)光度評(píng)價(jià)受污染水體的綜合毒性,或有針對(duì)性地對(duì)其中的單一污染物組分測(cè)定[23]。我國(guó)于1995 年將發(fā)光細(xì)菌法列為進(jìn)行水質(zhì)急性毒性檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。 國(guó)內(nèi)與國(guó)際測(cè)試方法的主要區(qū)別在于菌種和毒性的表達(dá)形式。 其中,應(yīng)用最廣的發(fā)光細(xì)菌包括費(fèi)氏弧菌、青?；【兔髁涟l(fā)光桿菌等,毒性結(jié)果的表達(dá)形式主要有氯化汞當(dāng)量、發(fā)光率/抑光率和半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)等。

表1 不同受試生物標(biāo)準(zhǔn)毒性測(cè)試方法Table 1 Standard toxicity test methods for different testing organisms

20 世紀(jì)80 年代初,為了更加快速、便捷地檢測(cè)廢水生物毒性,BULICH 等[24]首次將發(fā)光細(xì)菌與所用試劑、耗材制備成試劑盒,開(kāi)啟了水質(zhì)毒性檢測(cè)的商業(yè)化時(shí)代。 研究表明,石化、印染、造紙等工業(yè)廢水對(duì)發(fā)光菌均有很強(qiáng)的抑制作用[25-27]。馬梅等[28]分別利用從青海湟魚(yú)體表提取出的青?；【兔髁涟l(fā)光桿菌對(duì)重金屬含量很高的水體進(jìn)行了毒性測(cè)試,發(fā)現(xiàn)前者對(duì)水體中大多數(shù)重金屬的靈敏度很高。 張秀君等[29]用明亮發(fā)光桿菌測(cè)定了污染源廢水樣的毒性,發(fā)現(xiàn)評(píng)價(jià)級(jí)別的高低與采樣點(diǎn)相對(duì)于污染源的位置呈現(xiàn)正相關(guān),且金屬冶煉業(yè)和化纖業(yè)排水的毒性要明顯高于醫(yī)藥業(yè)和食品加工業(yè)。 唐景春等[2]對(duì)天津某化工園區(qū)9 個(gè)主要污染企業(yè)總排放口的排放尾水進(jìn)行了理化監(jiān)測(cè)和生物毒性監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)排污口污水對(duì)發(fā)光菌有較強(qiáng)的促進(jìn)作用,且對(duì)周邊植物生長(zhǎng)有不利影響,個(gè)別企業(yè)廢水具有很強(qiáng)的生物毒性,進(jìn)入受納水體后會(huì)對(duì)河流生態(tài)產(chǎn)生負(fù)面作用。

發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試在水質(zhì)突發(fā)性污染監(jiān)測(cè)方面也發(fā)揮了重要作用。 與實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)的魚(yú)類、蚤類和藻類毒理學(xué)試驗(yàn)相比,發(fā)光細(xì)菌法通?？稍谳^短的時(shí)間內(nèi)(30 min)判斷出水質(zhì)綜合毒性。2008 年汶川大地震后,華東師大朱文杰課題組[30]和成都軍區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站[31]分別利用青?；【兔髁涟l(fā)光桿菌及時(shí)、準(zhǔn)確地對(duì)受災(zāi)地區(qū)的飲用水樣本做出安全性判斷,有效保障了災(zāi)區(qū)人民的飲用水安全。 化工園區(qū)突發(fā)環(huán)境污染事故時(shí),可采用該方法對(duì)可能遭受污染的水體進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,迅速確定污染物在水體中的擴(kuò)散范圍和綜合毒性級(jí)別,跟蹤污染物遷移狀態(tài),及時(shí)指導(dǎo)監(jiān)測(cè)人員對(duì)有毒點(diǎn)位優(yōu)先進(jìn)行理化分析,進(jìn)一步判斷污染來(lái)源,為應(yīng)急監(jiān)測(cè)方案的制訂提供數(shù)據(jù)支撐。

發(fā)光細(xì)菌毒性測(cè)試法具有受試生物反應(yīng)靈敏、儀器操作自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn),可被應(yīng)用于重污染行業(yè)廢水毒性常規(guī)監(jiān)測(cè)和突發(fā)事件安全應(yīng)急監(jiān)測(cè)等,但該方法同時(shí)也存在發(fā)光菌菌種成本高、表征指標(biāo)單一和國(guó)內(nèi)外缺乏統(tǒng)一的毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題。

1.2.2 藻類和蚤類毒性測(cè)試法

藻類和蚤類個(gè)體小,在水體中可大量繁殖。當(dāng)生存環(huán)境惡化時(shí),藻類的生長(zhǎng)會(huì)受到抑制,蚤類的生存和繁殖能力也會(huì)發(fā)生變化,因此,在毒理學(xué)研究中,通常采用生長(zhǎng)率和繁殖率作為監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)毒性效應(yīng)的終點(diǎn)。

張瑛等[32]以微藻的生長(zhǎng)抑制率為測(cè)試指標(biāo),研究了不同行業(yè)廢水對(duì)4 種微藻的急性毒性效應(yīng),發(fā)現(xiàn)不同行業(yè)廢水對(duì)微藻的毒性效應(yīng)有明顯差異,研究結(jié)果為化工廢水毒性監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)中受試生物的選擇提供了數(shù)據(jù)支撐。 2002 年,COOMAN 等[33]用兩種蚤類對(duì)皮革廠排放污水不同工藝的出水進(jìn)行了毒性效應(yīng)評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)兩種水蚤對(duì)所有工藝出水均有毒性響應(yīng),致毒因子主要來(lái)源于出水中殘余的NH3-N 和氧化劑。 然而,韓洪軍等[34]利用生物毒性法測(cè)試了煤熱解廢水的毒性,發(fā)現(xiàn)藻類方法在實(shí)際操作中易受光照強(qiáng)度和氮磷濃度的影響,無(wú)法準(zhǔn)確判斷水質(zhì)毒性,認(rèn)為大型蚤更宜作為評(píng)估該類工業(yè)廢水毒性的指示生物。 GUO 等[35]基于大型蚤在江蘇省某化工園區(qū)排水中表現(xiàn)出的體內(nèi)毒性效應(yīng),對(duì)工業(yè)廢水中的致毒化合物進(jìn)行了高通量可疑性篩查,發(fā)現(xiàn)4 類疏水性有機(jī)污染物的致毒效應(yīng)最明顯。 HASHIGUCHI等[36]根據(jù)大型蚤毒性試驗(yàn)結(jié)果,對(duì)馬來(lái)西亞棕櫚油廠排水的整體綜合毒性進(jìn)行了判斷,并結(jié)合致毒因子的毒性鑒別評(píng)估技術(shù)(TIE),得出受納水體中的有毒物質(zhì)主要來(lái)源于棕櫚油制作加工過(guò)程中的精煉環(huán)節(jié)使用到的凈化劑的結(jié)論。

藻類和蚤類毒性試驗(yàn)均能通過(guò)生物生長(zhǎng)狀態(tài)的變化直觀地反映廢水的毒性效應(yīng),但也存在前期培養(yǎng)工作量大、測(cè)定周期長(zhǎng)、應(yīng)急響應(yīng)不及時(shí)等問(wèn)題,預(yù)計(jì)未來(lái)有關(guān)這兩類生物毒性效應(yīng)測(cè)試新技術(shù)的研究將主要側(cè)重于分子水平。

1.2.3 魚(yú)類毒性測(cè)試法

與低等實(shí)驗(yàn)生物相比,魚(yú)類是水體中群落級(jí)別較高的動(dòng)物,使用魚(yú)類作為受試生物的廢水毒性測(cè)定方法已相對(duì)成熟,目前已被廣泛應(yīng)用于行業(yè)廢水毒性測(cè)試與評(píng)價(jià)。 在ISO、OECD 和歐盟等組織的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中,主要通過(guò)觀察成魚(yú)和仔魚(yú)外觀和行為的改變,或通過(guò)獲取LC50來(lái)判斷成魚(yú)的毒性效應(yīng),從而確定受試水體的污染程度。

作為標(biāo)準(zhǔn)毒性測(cè)試生物,斑馬魚(yú)與人類的基因相似度接近90%,由斑馬魚(yú)毒性測(cè)試結(jié)果可以間接推導(dǎo)出污染物對(duì)人類潛在的致毒機(jī)制。 李麗君等[37]以斑馬魚(yú)的LC50作為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)不同企業(yè)排放的工業(yè)廢水進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)不同行業(yè)廢水的濃度變化與毒性效應(yīng)均成正相關(guān),其中電子行業(yè)廢水毒性最大。 陳文艷等[38]采用斑馬魚(yú)幼魚(yú)和胚胎對(duì)制革廢水進(jìn)行了毒性評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)胚胎對(duì)制革廢水的敏感性明顯高于幼魚(yú)。 2005 年,查金苗等[39]將斑馬魚(yú)仔魚(yú)暴露于印鈔廠廢水,通過(guò)評(píng)估早期發(fā)育階段的形態(tài)學(xué)變化、急性毒性、慢性毒性和內(nèi)分泌干擾情況,構(gòu)建了一套評(píng)估污水或排水毒性和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的方法。

采用魚(yú)類進(jìn)行工業(yè)廢水毒性效應(yīng)評(píng)價(jià)有比較成熟的國(guó)內(nèi)外技術(shù)方法標(biāo)準(zhǔn),但實(shí)際開(kāi)展情況受到很大的制約。 首先,國(guó)內(nèi)行業(yè)廢水達(dá)標(biāo)排放限值中,未將魚(yú)類毒性效應(yīng)作為規(guī)定的監(jiān)測(cè)指標(biāo);其次,依據(jù)單一魚(yú)種的毒性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)得出的評(píng)價(jià)結(jié)果存在一定的局限性。

1.2.4 成組生物毒性測(cè)試法

由于水體中各生物之間存在著復(fù)雜的競(jìng)爭(zhēng)、捕食及共生等關(guān)系,對(duì)有毒物質(zhì)的敏感程度也不同,以單一物種的毒性試驗(yàn)結(jié)果表征水生態(tài)健康綜合受影響程度并不絕對(duì)科學(xué)。 成組生物毒性測(cè)試法則是以涵蓋不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)別的受試生物對(duì)廢水進(jìn)行急性和慢性毒性試驗(yàn),以毒性當(dāng)量、LC50和EC50等為毒性表征指標(biāo)。

周秀艷等[40]用斑馬魚(yú)、發(fā)光菌和蠶豆微核根尖等檢測(cè)了遼寧省某重點(diǎn)工業(yè)污染源廢水的毒性,發(fā)現(xiàn)廢水的綜合生物毒性與廢水排放量、受試生物種類之間存在密切聯(lián)系。 孫婕等[41]利用3種小型觀賞魚(yú)對(duì)工業(yè)廢水進(jìn)行了急性毒性試驗(yàn),分析了不同行業(yè)廢水對(duì)受試生物的劑量效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng),將受試生物在廢水原液中的半致死時(shí)間作為劃分毒性等級(jí)的依據(jù),提出了一套全新的毒性級(jí)別分析標(biāo)準(zhǔn)。 鄒葉娜等[42]將發(fā)光菌、大型蚤急性毒性試驗(yàn)與單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)相結(jié)合,建立了潛在生態(tài)毒性效應(yīng)探測(cè)(PEEP)方法,可以對(duì)不同種類工業(yè)廢水的生物綜合效應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià),更客觀、真實(shí)地反映工業(yè)廢水中的污染物對(duì)水質(zhì)與生物的影響。 生物綜合毒性在線監(jiān)測(cè)設(shè)備利用多層級(jí)生物對(duì)有毒污染物敏感的特點(diǎn),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)模式生物的生理響應(yīng)與水體中的有機(jī)污染物、重金屬等有毒物質(zhì)具有劑量效應(yīng)關(guān)系的毒理學(xué)機(jī)制,將模式魚(yú)、發(fā)光菌等作為多層級(jí)模式生物,通過(guò)生物傳感器監(jiān)測(cè)生物生理變化(行為變化、發(fā)光量變化等),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)水質(zhì)綜合毒性的在線生物預(yù)警監(jiān)測(cè),擴(kuò)大飲用水水源地生物毒性連續(xù)監(jiān)測(cè)和生物預(yù)警監(jiān)測(cè)的范圍,進(jìn)一步全面有效地預(yù)警監(jiān)測(cè)水質(zhì)突發(fā)污染事故。 目前,作為實(shí)現(xiàn)水質(zhì)污染早期預(yù)報(bào)的有效技術(shù)手段,大部分在線生物預(yù)警設(shè)備主要被應(yīng)用于飲用水水源地水質(zhì)監(jiān)測(cè),在工業(yè)廢水監(jiān)測(cè)中引入在線生物預(yù)警設(shè)備仍存在一定困難,需在儀器安裝調(diào)試前使用實(shí)驗(yàn)室靜水暴露稀釋方法測(cè)定該污水處理廠排水對(duì)模式生物有無(wú)水質(zhì)綜合毒性,確定LOEC,并以此為依據(jù)確定在線監(jiān)測(cè)時(shí)的污水稀釋倍數(shù),以稀釋后的水樣測(cè)定模式生物的行為變化,評(píng)價(jià)水質(zhì)綜合毒性。

西方發(fā)達(dá)國(guó)家在采用生物綜合毒性法評(píng)價(jià)工業(yè)廢水水質(zhì)毒性的基礎(chǔ)上,制定了相關(guān)的毒性排放標(biāo)準(zhǔn)。 德國(guó)在成分較為復(fù)雜的化工行業(yè)污水排放標(biāo)準(zhǔn)中引入了綜合毒性指標(biāo),毒性試驗(yàn)受試生物包括不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)別的水生生物,工業(yè)污水對(duì)生物的綜合毒性采用LID 表示[43]。 EPA 對(duì)綜合毒性測(cè)試生物的選擇與德國(guó)類似,要求至少包含3種不同營(yíng)養(yǎng)級(jí)的物種,分別以96 h LC50和7 d NOEC 表示急性毒性和慢性毒性的測(cè)試終點(diǎn)[44]。

今后,在應(yīng)用綜合毒性指標(biāo)評(píng)價(jià)污水質(zhì)量時(shí),需考慮選取有代表性的水生生物,明確受試生物綜合毒性的表征方式,廣泛開(kāi)展工業(yè)廢水綜合毒性監(jiān)測(cè)研究并積累數(shù)據(jù),構(gòu)建出適合我國(guó)的工業(yè)廢水生物毒性評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范與管理辦法。

1.3 其他生物監(jiān)測(cè)方法

除較為人熟知的生物群落監(jiān)測(cè)和生物毒性監(jiān)測(cè)等方法外,許多以理化指標(biāo)為對(duì)象的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)也被應(yīng)用于工業(yè)廢水監(jiān)測(cè)領(lǐng)域。 例如,生物傳感器和生物電化學(xué)監(jiān)測(cè)方法是將生物識(shí)別單元和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合,然后將產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)化為電化學(xué)信號(hào)并檢測(cè)。 應(yīng)用于廢水監(jiān)測(cè)的生物傳感器所使用的分子識(shí)別元件有酶、微生物和細(xì)胞等,主要用于檢測(cè)有機(jī)物和重金屬等污染物。

傳統(tǒng)稀釋接種法測(cè)定生化需氧量(BOD)需要在實(shí)驗(yàn)室連續(xù)監(jiān)測(cè)5 ～7 d,而使用固定了微生物的醋酸纖維膜傳感器可以在數(shù)分鐘內(nèi)測(cè)定BOD 濃度,方法檢出限達(dá)1 mg/L[45]。 OLANIRAN等[46]報(bào)道了由全套發(fā)光酶基因轉(zhuǎn)換的兩種全細(xì)胞細(xì)菌生物傳感器,可以通過(guò)檢測(cè)生物發(fā)光效應(yīng)來(lái)測(cè)定廢水中的COD 含量。 近年來(lái),基于微生物燃料電池的生物傳感器被逐步引入水質(zhì)監(jiān)測(cè),不僅可以對(duì)溶解氧(DO)、BOD 和COD 進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)還可以鑒別和分析水樣中的多種有機(jī)污染物[47]。 DOONG 等[48]和MARRAZZA 等[49]分 別利用光化學(xué)生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器檢測(cè)了廢水中的多環(huán)芳烴(PAHs) 和多氯聯(lián)苯(PCBs)。 酚類生物傳感器將從新鮮植物中提取的酪氨酸酶與碳納米管修飾電極相結(jié)合,主要用于檢測(cè)制藥廠、合成纖維廠生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的且最終通過(guò)工業(yè)廢水進(jìn)入環(huán)境水體的鄰苯二酚、鄰甲酚等酚類物質(zhì)[50]。 還有某些生物傳感器可以在含有低濃度重金屬的水體中發(fā)射生物發(fā)光信號(hào),進(jìn)而通過(guò)信號(hào)強(qiáng)度判斷重金屬含量。 例如,基于熒光蛋白表達(dá)的細(xì)菌生物傳感器,當(dāng)其與重金屬接觸時(shí),可以通過(guò)蛋白質(zhì)的熒光表達(dá)強(qiáng)度判斷廢水中的重金屬含量[51]。 基于抑制效應(yīng)的酶生物傳感器也被廣泛應(yīng)用于對(duì)含有鉻離子、銀離子和鎳離子等重金屬的廢水的監(jiān)測(cè)[52-53]。 DNA 生物傳感器以核酸探針為元件,通過(guò)特定指示劑信號(hào)判斷環(huán)境基質(zhì)中有機(jī)物和重金屬等污染物的濃度[54]。 隨著DNA 重組技術(shù)和納米技術(shù)的高速發(fā)展,基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的納米生物傳感器也被應(yīng)用于多種重金屬的測(cè)定。 WU等[55]研發(fā)的新型FRET 傳感器針對(duì)不同金屬離子顯示出相應(yīng)的熒光信號(hào),可以特異性地檢測(cè)工業(yè)廢水中單一重金屬的含量。

除了以上技術(shù),應(yīng)用于工業(yè)廢水監(jiān)測(cè)的生物監(jiān)測(cè)方法還包括生物芯片技術(shù)、流式細(xì)胞測(cè)定技術(shù)等。 現(xiàn)代生物監(jiān)測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速,與傳統(tǒng)生物監(jiān)測(cè)方法相比,其特異性好、靈敏度高,可以提高生物處理效率,但也存在設(shè)備、試劑等耗材經(jīng)濟(jì)成本高,對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)性要求高等問(wèn)題(表2)。

表2 廢水監(jiān)測(cè)領(lǐng)域生物監(jiān)測(cè)方法綜合比較Table 2 General comparison of biological monitoring methods of wastewater monitoring

2 現(xiàn)存問(wèn)題及對(duì)策建議

工業(yè)廢水中污染物的種類復(fù)雜且排放量相對(duì)不穩(wěn)定,采用生物監(jiān)測(cè)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)污染物環(huán)境影響的連續(xù)監(jiān)測(cè),并能對(duì)污水處理廠各個(gè)環(huán)節(jié)的出水進(jìn)行綜合生物效應(yīng)分析,但目前依然存在以下幾點(diǎn)問(wèn)題:

一是受生物群落鑒定和實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法的制約,大部分生物監(jiān)測(cè)技術(shù)無(wú)法做到精準(zhǔn)定量分析,且相較于理化監(jiān)測(cè),生物監(jiān)測(cè)的結(jié)果缺少合適的方法標(biāo)準(zhǔn)和對(duì)應(yīng)的質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。 因此,建議加強(qiáng)生物監(jiān)測(cè)結(jié)果與理化監(jiān)測(cè)結(jié)果的聯(lián)合分析,從不同角度對(duì)廢水進(jìn)行綜合、系統(tǒng)、全面的環(huán)境質(zhì)量狀況評(píng)價(jià),并建立起適用于人類健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的方法標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

二是生物監(jiān)測(cè)對(duì)潛在污染因子的識(shí)別存在一定困難。 目前,主要利用TIE 技術(shù)判斷潛在的目標(biāo)污染物。 該技術(shù)主要是應(yīng)用理化方法(有針對(duì)性地去除或屏蔽某一類物質(zhì))初步鑒別樣品中的重金屬、NH3-N、氧化劑等無(wú)機(jī)污染物,但對(duì)有機(jī)物質(zhì)的分析鑒定能力有限。 效應(yīng)引導(dǎo)的污染物識(shí)別技術(shù)(EDA)可以有效彌補(bǔ)TIE 方法在有機(jī)化合物鑒別方面的不足。 EDA 方法通過(guò)高通量篩查將樣品中的有機(jī)污染物進(jìn)行提取分離,有效鎖定目標(biāo)污染物,進(jìn)而對(duì)每個(gè)組分進(jìn)行毒性評(píng)估,可精確識(shí)別關(guān)鍵污染因子。

三是盡管現(xiàn)代分子生物技術(shù)的特異性好、靈敏度高,可以提高生物處理效率,使得研究周期縮短,增加數(shù)據(jù)豐富度,但仍存在著一些不足。 例如:在PCR 操作過(guò)程中,由于試劑、樣品易受污染,容易導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性和假陰性,做好實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控及增加平行樣可以有效減少此類錯(cuò)誤的發(fā)生;高通量測(cè)序技術(shù)后續(xù)涉及的數(shù)據(jù)分析量巨大,亟須研究開(kāi)發(fā)更為人性化的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法和分析軟件;除常規(guī)儀器設(shè)備外,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室其他專業(yè)儀器的價(jià)格通常相對(duì)較為高昂,試劑耗材等的經(jīng)濟(jì)成本高,且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員有較高的專業(yè)技術(shù)要求。 隨著生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,廣大科研人員可以通過(guò)更深入的研究探索,進(jìn)一步完善和優(yōu)化該類技術(shù),并與其他監(jiān)測(cè)手段配合使用,為環(huán)境監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)支撐。

作為一種綜合性監(jiān)測(cè)技術(shù),工業(yè)廢水生物監(jiān)測(cè)已不再僅僅是理化監(jiān)測(cè)的補(bǔ)充,它可以從宏觀和微觀角度全面深入地審視水環(huán)境質(zhì)量狀況,進(jìn)而對(duì)其產(chǎn)生的生物健康效應(yīng)進(jìn)行直觀評(píng)價(jià)。 因此,在廢水監(jiān)管中開(kāi)展生物監(jiān)測(cè)是環(huán)境監(jiān)測(cè)發(fā)展的必然趨勢(shì)。 近幾十年來(lái),我國(guó)針對(duì)生物監(jiān)測(cè)技術(shù)在廢水監(jiān)管中的應(yīng)用開(kāi)展了積極的研究和探索,在《化學(xué)合成類制藥工業(yè)廢水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 21904—2008)中首次引入了發(fā)光菌毒性指標(biāo),并規(guī)定了毒性當(dāng)量限值。 當(dāng)前,我國(guó)水環(huán)境管理正從單純的水質(zhì)管理向生態(tài)管理轉(zhuǎn)變,傳統(tǒng)的理化指標(biāo)監(jiān)測(cè)已不能滿足生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)的需求,迫切需要將生物指標(biāo)引入水體生態(tài)和健康風(fēng)險(xiǎn)管理當(dāng)中。 建議在進(jìn)一步完善我國(guó)工業(yè)廢水生物監(jiān)測(cè)體系時(shí),可以借鑒西方國(guó)家的成熟經(jīng)驗(yàn),篩選出國(guó)際普遍認(rèn)可的方法標(biāo)準(zhǔn),并不斷加強(qiáng)生物監(jiān)測(cè)人才隊(duì)伍建設(shè),鼓勵(lì)開(kāi)展本土受試生物的篩選和標(biāo)準(zhǔn)化工作,進(jìn)而制定出符合我國(guó)需求及特征的工業(yè)廢水生物監(jiān)測(cè)方法與評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),為掌握工業(yè)園區(qū)整體環(huán)境健康及污染狀況、受納地表水體水生生物健康狀況,加強(qiáng)對(duì)排污企業(yè)的管理提供技術(shù)支撐和科學(xué)依據(jù)。