路靚，李鑫，李清嵐，陸思靜

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

支氣管哮喘(asthma)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是兩種常見的呼吸系統(tǒng)疾病。這兩種疾病發(fā)病機(jī)制、臨床特征、治療手段均不相同，然而臨床上一些患者同時(shí)出現(xiàn)哮喘及慢阻肺癥狀，這些病人被歸為支氣管哮喘-慢性阻塞性肺疾病重疊[1](asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap，ACO)。在一些特殊的患者身上，隨著其病程的延長(zhǎng)、疾病的發(fā)展以及年齡的增高，哮喘和COPD會(huì)發(fā)生相互轉(zhuǎn)變、相互影響和相互作用，導(dǎo)致部分發(fā)展為ACO[2]。ACO同時(shí)具備哮喘和COPD的特征，患者常有頻繁的急性加重、更差的生活質(zhì)量，病情進(jìn)展迅速且預(yù)后差，死亡率高。而ACO作為近些年提出的新概念，很多發(fā)病機(jī)制尚不清楚。GINA指出，與哮喘和 COPD 相關(guān)的炎性標(biāo)志物包括呼出氣一氧化氮、血嗜酸粒細(xì)胞、痰中炎性細(xì)胞、IL-6、IL-13、髓過氧化物酶、中性粒細(xì)胞等[3]。中性粒細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子被發(fā)現(xiàn)與慢阻肺的氣道炎性浸潤相關(guān)[4]，但其在ACO炎癥過程中的作用尚待明確。研究ACO相關(guān)炎性標(biāo)志物對(duì)ACO的診斷以及提高臨床治療效果具有重要意義。當(dāng)氣道炎癥發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞會(huì)通過產(chǎn)生白介素-8(interleulin-8，IL-8)增強(qiáng)自身的趨化聚集[5]，有研究表明IL-8能對(duì)COPD病情嚴(yán)重程度進(jìn)行有效區(qū)分[6]；白介素-17a(interleulin-17a，IL-17a)作為前炎性細(xì)胞因子，可募集并活化中性粒細(xì)胞[7]，介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)和組織損傷，導(dǎo)致肺組織結(jié)構(gòu)功能破壞；氣道上皮Toll樣受體家族可以誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥因子參與氣道炎癥，而主要由中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)則可以通過影響TLR4信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[8]。IL-8、IL-17a及LF作為中性粒細(xì)胞相關(guān)炎癥因子均可參與氣道炎癥反應(yīng)，然而現(xiàn)存對(duì)IL-8和IL-17a在ACO相關(guān)炎癥機(jī)制的研究較少，且尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)LF在ACO中所起作用的相關(guān)研究。因此，探究IL-8、IL-17a及LF這3種中性粒細(xì)胞相關(guān)炎癥因子在ACO患者血清中的表達(dá)水平很有必要。

本研究通過比較中性粒細(xì)胞相關(guān)因子IL-8、IL-17a、LF在ACO、COPD、哮喘急性期及ACO治療后患者血清表達(dá)水平，進(jìn)一步探討中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-8、IL-17a、LF在ACO診治中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年11月至2019年4月錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸科就診的ACO、COPD及哮喘急性期患者，按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)共入選ACO患者32例，COPD患者30例，哮喘患者25例。同時(shí)于我院體檢中心收集同時(shí)期健康人 20例為對(duì)照組，收集病例資料，抽取外周靜脈血10 mL用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。ACO患者規(guī)范化治療1個(gè)月后再次抽取靜脈血。其中納入標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)ACO患者入組標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均為在我院行肺功能檢查及支氣管舒張?jiān)囼?yàn)，參照2017年西班牙慢阻肺指南及哮喘管理指南關(guān)于ACO的共識(shí)[9]并結(jié)合實(shí)際情況制定診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：支氣管舒張?jiān)囼?yàn)強(qiáng)陽性，即FEV1改善值>400 mL且改善率>15%； 40歲前有哮喘病史；過敏史；有2次及以上支氣管舒張?jiān)囼?yàn)結(jié)果為陽性，即 FEV1 改善值大于200 mL，且改善率大于12%。在滿足COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)前提下，符合其中一條診斷標(biāo)準(zhǔn)即可入組；(2)ACO急性期患者入組后需于我院呼吸科病房或門診行規(guī)范治療，1個(gè)月后隨訪；(3)COPD及哮喘患者分別按照2017年GOLD和GINA制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)入組；對(duì)照組為體檢結(jié)果正常的健康人；(4)針對(duì)所有入組患者，均已向其告知參與研究事實(shí)并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有支氣管擴(kuò)張癥、肺纖維化、肺動(dòng)脈高壓、肺結(jié)核等肺部疾病者；(2)合并惡性腫瘤，嚴(yán)重的心、肝、腎疾病者，或存在精神、神經(jīng)性疾病所致的認(rèn)知、交流障礙及自身免疫性疾病者；(3)2 w內(nèi)有應(yīng)用激素(包括全身應(yīng)用及局部吸入糖皮質(zhì)激素)、抗白三烯受體拮抗劑及茶堿類等相關(guān)藥物的用藥史。

1.2 方法

患者晨起空腹抽取肘正中靜脈血10 mL置于EDTA抗凝管中，立即送錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心，將血樣在2000 rpm下離心 20 min，取上清液置于凍存管中，-80 ℃冰箱保存。待樣本集齊后，室溫解凍樣本血清，采用ELISA法檢測(cè)樣本血清中IL-17a、IL-8、LF的含量。ELISA試劑盒購于上海紀(jì)寧公司，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 入組患者一般資料比較

本研究共納入107例患者，分別比較得出4組之間性別、年齡、身高、體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，說明4組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間具有可比性，見表1。

2.2 ACO、COPD、哮喘急性期及健康對(duì)照組3種細(xì)胞因子濃度的比較

通過分析比較得出4組之間血清IL-8、IL-17a和LF水平均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)；其中經(jīng)兩兩比較，ACO組血清IL-8濃度高于哮喘組和對(duì)照組，但明顯低于COPD組，哮喘組IL-8水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；ACO組血清IL-17a水平較哮喘組高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，哮喘組IL-17a濃度平均水平雖略高于COPD組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，不過兩者均高于健康人水平(P<0.01)；ACO組血清LF含量低于哮喘組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而哮喘組和COPD組LF濃度差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均明顯低于對(duì)照組(P<0.01),見表2、表3。

2.3 ACO治療前后3種細(xì)胞因子濃度的比較

通過配對(duì)t檢驗(yàn)分析得出，ACO急性加重期患者血清IL-8、IL-17a的表達(dá)水平顯著高于臨床穩(wěn)定期，血清LF則低于穩(wěn)定期表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表4。

表1 入組患者的一般情況比較

表2 ACO、COPD、哮喘急性期及健康對(duì)照組3種細(xì)胞因子濃度的比較

表3 ACO、COPD、哮喘組及對(duì)照組3種細(xì)胞因子濃度的兩兩比較

表4 ACO治療前后3種細(xì)胞因子濃度的比較

3 討 論

慢性氣道炎癥是哮喘和慢阻肺共同特征，哮喘主要為嗜酸性粒細(xì)胞活化參與介導(dǎo)，慢阻肺以中性粒細(xì)胞浸潤為主，同時(shí)由多種炎癥因子參與。有學(xué)者曾提出“荷蘭學(xué)說”[10]，該學(xué)說認(rèn)為，由于遺傳及周圍環(huán)境影響因素不同，慢性非特異性肺疾病可發(fā)展為哮喘、COPD或兩者兼有。有研究發(fā)現(xiàn)部分哮喘患者與COPD患者相比細(xì)胞分類基本相同，部分重癥、難治性或激素抵抗型哮喘患者肺組織中性粒細(xì)胞浸潤明顯增加，可能提示病情發(fā)展更加迅速，激活的中性粒細(xì)胞可以引起氧自由基和多種水解酶的釋放，中性粒細(xì)胞表達(dá)CD11b/CD18增加，若控制不佳，長(zhǎng)期的炎癥細(xì)胞及因子的侵襲可導(dǎo)致氣道不可逆氣流受限，從而向COPD轉(zhuǎn)變。這是ACO可能的發(fā)病原因。故而從中性粒細(xì)胞浸潤的氣道炎癥機(jī)制入手，尋找ACO特征的炎性標(biāo)志物對(duì)ACO的識(shí)別、診斷、治療具有重要作用意義。

IL-8具有強(qiáng)大的趨化作用，激活并使中性粒細(xì)胞及肺泡巨噬細(xì)胞聚集于氣道黏膜，釋放自由基及炎癥因子，引起肺血管內(nèi)皮及肺泡上皮損傷，使血管通透性增加，炎癥反應(yīng)加重，引起氣道高反應(yīng)，使支氣管平滑肌痙攣、小氣道阻力增加。在IL-8與IL-6等細(xì)胞因子共同作用下，還能夠增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的釋放蛋白酶的能力，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的分解，使其沉積，從而導(dǎo)致氣道重構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-8表達(dá)水平在ACO、COPD、哮喘急性加重期組及健康對(duì)照組間存在顯著差異，其中ACO急性加重期患者外周血IL-8表達(dá)水平高于哮喘急性發(fā)作期患者，但低于COPD急性加重期患者。IL-8是在干擾素-α、白介素-1等作用下由單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及Th細(xì)胞等合成的炎癥因子，作用于中性粒細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用[11]，通過與中性粒細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，激活免疫炎癥反應(yīng)，使中性粒細(xì)胞脫顆粒，釋放溶酶體，釋放氧自由基和蛋白水解酶等，還可以自分泌方式募集中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞活性，并延長(zhǎng)其壽命，如此循環(huán)反復(fù)，致使氣道炎癥持續(xù)進(jìn)行。因此IL-8的升高導(dǎo)致氣道中性粒細(xì)胞炎癥和氣道持續(xù)損傷，而COPD以中性粒細(xì)胞浸潤為主，血清IL-8在COPD患者中明確升高。有研究報(bào)道，非Th2相關(guān)細(xì)胞因子如IL-8在ACO患者血清濃度高于嗜酸性粒細(xì)胞參與介導(dǎo)為主的哮喘患者[12]。這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。ACO兼有COPD和哮喘疾病的特征，中性粒細(xì)胞炎癥可能比COPD弱而強(qiáng)于哮喘。

IL-17a主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，作為一種前炎性細(xì)胞因，它募集中性粒細(xì)胞的能力極強(qiáng)，能夠誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞以及平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生多種炎性因子。 IL-17a與Th2類細(xì)胞因子在黏液大量分泌、平滑肌細(xì)胞增生、氣道增厚和氣道炎癥中有協(xié)同作用，并可通過促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生趨化生長(zhǎng)因子等引起中性粒細(xì)胞浸潤型炎癥。本研究顯示，ACO急性期患者血清IL-17a含量明顯高于COPD和哮喘組，COPD組和哮喘組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分析原因，有研究表明將卵清蛋白致敏小鼠Th17分泌的 IL-17a轉(zhuǎn)移到野生型小鼠中，隨后用卵清蛋白激發(fā)，可以導(dǎo)致小鼠肺中的中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤增加[13]。中性粒細(xì)胞還可以激活基質(zhì)金屬酶、白三烯等促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的增殖。結(jié)合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，IL-17a可能通過引起中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)，參與ACO相關(guān)免疫炎癥反應(yīng)。

LF是一種多功能蛋白，具有調(diào)節(jié)免疫、抗菌抗病毒作用，中性粒細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)含LF最多的細(xì)胞。血液中的LF主要來源于中性粒細(xì)胞，骨髓和子宮內(nèi)膜也可分泌少量乳鐵蛋白。LF可以抑制炎癥區(qū)域中IL-8的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的聚集，還可抑制肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的趨化。本次研究結(jié)果顯示3個(gè)患病組患者血清LF表達(dá)水平均較健康對(duì)照組明顯下降，其中ACO急性期患者LF含量明顯低于COPD和哮喘組，COPD組與哮喘組間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。有研究顯示乳鐵蛋白可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的成熟，通過誘導(dǎo)CD4+的表達(dá)，進(jìn)而使未成熟T淋巴細(xì)胞分化為CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能，改變Th1和Th2間的平衡，從而使炎癥因子釋放減少，緩解炎癥反應(yīng)的進(jìn)行[14]。本研究驗(yàn)證了LF作為抑炎因子的作用，ACO、COPD及哮喘患者外周血LF含量明顯減少的原因可能由于LF在抑制氣道炎癥的過程中消耗過多，也可能由于該類患者體內(nèi)LF分泌缺陷。

ACO患者治療前后比較結(jié)果可見3種中性粒細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子均在ACO急性加重的炎癥途徑中發(fā)揮著不可或缺的作用。這也提示可以將血清IL-8、IL-17a及LF濃度檢測(cè)作為ACO患者治療效果的觀察指標(biāo)，可以動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)上述指標(biāo)用于指導(dǎo)和調(diào)整臨床治療方案。另外，在研究ACO炎癥機(jī)制的基礎(chǔ)上，已有正在嘗試應(yīng)用特異性中性粒細(xì)胞靶向治ACO；也有通過補(bǔ)充乳鐵蛋白加強(qiáng)抗炎作用以緩解慢性氣道炎癥的嘗試，但療效尚需驗(yàn)證。

綜上所述，本研究證實(shí)中性粒細(xì)胞相關(guān)因子IL-8、IL-17a、LF在ACO、COPD及哮喘中發(fā)揮的重要作用，作為生物標(biāo)記物可對(duì)3種疾病有一定的鑒別意義。IL-8、IL-17a、LF表達(dá)水平在ACO急性發(fā)作期與穩(wěn)定期有明顯差異，可作為ACO治療效果的觀察指標(biāo)，為其診斷和治療提供依據(jù)。但是本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象樣本較少，且可能存在未發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)處理誤差等因素影響，因此針對(duì)ACO炎癥機(jī)制的研究仍需要在臨床上進(jìn)行大數(shù)據(jù)樣本的實(shí)驗(yàn)研究。