農(nóng)衛(wèi)霞,王奎

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000)

粘膜相關(guān)淋巴組織(mucosal associated lymphoid tissue,MALT)淋巴瘤發(fā)病率約占全部淋巴瘤的10%[1]。胃MALT淋巴瘤是其中主要的類型之一，發(fā)病機(jī)制與幽門螺桿菌的慢性感染密切相關(guān)[2-3]，因此長期使用清除幽門螺桿菌的抗生素治療是MALT淋巴瘤的主要方式[4]。但長期使用抗生素容易引起過敏、肝腎損傷及神經(jīng)系統(tǒng)損害等多種副反應(yīng)[5]，超過半數(shù)患者還可復(fù)發(fā)[6]。因此，探索和尋找胃MALT淋巴瘤新靶點(diǎn)有助于提高療效并降低復(fù)發(fā)率。

小分子RNA(MicroRNAs,miRNAs)是一類非編碼的內(nèi)源性小分子RNA，研究發(fā)現(xiàn)大量異常表達(dá)的miRNAs可通過表觀遺傳學(xué)修飾來調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平而影響腫瘤的進(jìn)程[7-8]。通過篩選腫瘤組織中異常表達(dá)的miRNAs，為腫瘤早期診斷、預(yù)后監(jiān)測和基因的靶向治療提供思路[9]。ZHANG Y等[10]認(rèn)為miR-320a和miR-429與某些靶基因的表達(dá)趨勢與微陣列分析結(jié)果一致，提示miR-320a和miR-429可能是參與胃MALT淋巴瘤發(fā)病機(jī)制的新型miRNA。SONG Y等[11]檢測122例原發(fā)性胃MALT淋巴瘤的邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤患者miR-383在腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)呈低表達(dá)，體外研究顯示miR-383靶向ZEB2來抑制MALT淋巴瘤細(xì)胞的增殖。類似的研究也顯示miR-21是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤關(guān)鍵的原癌基因[12]。

作為致癌基因，miR-20a-5p通過負(fù)調(diào)控腫瘤抑制基因促進(jìn)腫瘤形成，如GUO L等[13]研究乳腺癌細(xì)胞源性外泌體miR-20a-5p通過靶向SRCIN1促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖和分化，HUANG D等[14]認(rèn)為MiR-20a-5p通過在鼻咽癌細(xì)胞中靶向Rab27B來抵抗化療。但miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤發(fā)生發(fā)展中的作用目前報(bào)道尚少。本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測人胃MALT淋巴瘤組織及癌旁組織miR-20a-5p表達(dá)，考察miR-20a-5p對Raji淋巴瘤細(xì)胞增殖的影響，為靶向治療胃MALT淋巴瘤提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 病例資料與納入標(biāo)準(zhǔn)

收集2015年1月～2019年1月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬院普外科手術(shù)切除的組織凍存標(biāo)本，胃MALT淋巴瘤及其相鄰的正常粘膜組織18例，其中男性10例和女性8例；年齡32～63歲，平均年齡(48.2±10.8)歲；5名患者經(jīng)胃鏡活檢確診，13名患者經(jīng)手術(shù)病理組織學(xué)檢查證實(shí)；病變部位胃底4例、胃體3例、胃竇9例、幽門2例；參照Lisaacson等的分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行MALT淋巴瘤組織學(xué)分類：所有淋巴瘤組織經(jīng)病理學(xué)鑒定均為低度惡性腫瘤，鄰近的癌旁組織呈現(xiàn)陰性，即無腫瘤細(xì)胞浸潤。所有患者在正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission tomography/computed tomography,PET/CT)檢查前均直接未行放療、化療和手術(shù)治療，既往無淋巴瘤病史。本研究根據(jù)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)的方案進(jìn)行，不違背《人胚胎干細(xì)胞研究倫理指導(dǎo)原則》相關(guān)原則。所有患者均了解手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)及受益，同意將術(shù)中切除的癌變組織及為確保癌組織被切除完全需切除相鄰的部分正常粘膜組織用于科學(xué)研究，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

miR-20a-5p mimic、miR-20a-5p inhibitor及陰性對照均由上海吉瑪公司合成；Lipo2000購自美國Invitrogen公司；RPMIl640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Opti-MEM培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自同仁化學(xué)公司；結(jié)晶紫購自美國Sigma公司；TRIZOL試劑和細(xì)胞裂解液均購自美國Thermo scientific公司；GAPDH抗體和人Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3(unt related transcription factor 3 gene,RUNX3)單克隆抗體均購自美國Abcam公司。-80 ℃超低溫冰箱購自日本SANYO公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司；ABI 7300 型PCR儀購自美國ABI公司；微量移液槍購自美國Eppendorf公司；生物安全柜購自香港Heal Force公司；酶標(biāo)儀及低溫高速離心機(jī)均購自美國Thermo Scientific公司；超純水儀購自美國Millipore公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞凍存管及Transwell小室均購自美國Coming公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

人B細(xì)胞淋巴瘤Raji細(xì)胞株由中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供，采用含10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基于37 ℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選用對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

將處于對數(shù)期的Raji細(xì)胞按照每孔1 × 105個(gè)接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞融合70%～80%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按是否轉(zhuǎn)染，將細(xì)胞分為4組：miR-20a-5p mimic negative control轉(zhuǎn)染組(miR-20a-5p mimic NC)、miR-20a-5p mimic轉(zhuǎn)染組(miR-20a-5p mimic)、miR-20a-5p inhibitor negative control轉(zhuǎn)染組(miR-20a-5p inhibitor NC)和miR-20a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組(miR-20a-5p inhibitor)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。參照Lipofectamine2000操作說明書，將miR-20a-5p mimic NC、miR-20a-5p mimic、miR-20a-5p inhibitor NC和miR-20a-5p inhibitor與脂質(zhì)體按比例混合，室溫靜置20 min。將之前鋪好的培養(yǎng)板中培液棄去，PBS清洗。每孔中加入opti-MEM補(bǔ)至1 mL，轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測各組細(xì)胞的miR-20a-5p表達(dá)。

1.5 細(xì)胞增殖活性檢測(cell counting kit-8,CCK-8)細(xì)胞增殖能力

每孔2 × 104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔：空白對照組、miR-20a-5p mimic NC、miR-20a-5p mimic、miR-20a-5p inhibitor NC和miR-20a-5p inhibitor組，按1.4項(xiàng)步驟轉(zhuǎn)染。選取24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每孔加100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8溶液并培養(yǎng)2 h，采用酶標(biāo)儀測定各組細(xì)胞450 nm波長的吸光度。

1.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染miR-20a-5p mimic或miR-20a-5p inhibitor后48 h收集細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。在無血清的DMEM中，Raji細(xì)胞接種到Transwell小室的上室，將10%胎牛血清的DMEM添加到下室。37 ℃培養(yǎng)24 h，移除小室中殘留的細(xì)胞，福爾馬林固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色5 min，鏡下觀察，使用image pro plus軟件計(jì)數(shù)。遷移抑制率/%=(1-實(shí)驗(yàn)組遷移細(xì)胞數(shù)/正常對照組遷移細(xì)胞數(shù))×100%

1.7 qRT-PCR檢測組織或細(xì)胞mRNA相對表達(dá)量

將胃MALT淋巴瘤切除的樣本研磨后移入無酶EP管中，加Trizol試劑。將4個(gè)組的細(xì)胞樣本(miR-20a-5p mimic組、miR-20a-5p inhibitor組及對應(yīng)的NC組)，加Trizol試劑。將加入Trizol的組織或細(xì)胞樣品室溫放置5 min，每管加入200 μL氯仿，振蕩混勻15 s，室溫靜置5 min，離心取上清，加入等體積的異丙醇，混勻，-20 ℃靜置30 min。4 ℃12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇，混勻重懸，4 ℃12 000 r·min-1離心5 min，棄上清，DEPC水溶解。采用分光光度計(jì)檢測各組總RNA的濃度及純度。

利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照qRT-PCR反應(yīng)體系配制20 μL的反應(yīng)體系，放入7500 型PCR儀內(nèi)擴(kuò)增。按2-ΔΔCt法計(jì)算miR-20a-5p及RUNX3的相對表達(dá)，U6和GAPDH分別為miR-20a-5p及RUNX3的內(nèi)參。

表1 引物序列

1.8 Western blotting試驗(yàn)

取各組的Raji細(xì)胞樣本，加入蛋白裂解液裂解，使用蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度法，通過SDS-PAGE將細(xì)胞總蛋白分離，濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫封閉后孵育RUNX3抗體4 ℃過夜(ab49117，工作濃度1.25 μg·mL-1)。去除一抗孵育液，1×PBST漂洗，加入1×PBST液稀釋的山羊抗兔IgG H&L (HRP)(ab205718，工作濃度1∶2000)室溫孵育1 h，加入發(fā)光液成像，imageJ軟件分析。

1.9 Luciferase活性測定

含有RUNX3 3'-UTR野生型(Wt)和3'-UTR突變體(Mut)的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒由GenePharma公司構(gòu)建。轉(zhuǎn)染前24 h，將細(xì)胞接種于24孔板，使用Lipofectamine 2000混合miR-20a-5p mimic和熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染淋巴瘤細(xì)胞。培養(yǎng)48 h，將收集的細(xì)胞液氮反復(fù)凍融2次，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，收集上清，將細(xì)胞提取液以及Luciferase反應(yīng)底物22 ℃水浴10 min，加入100 μL Luciferase反應(yīng)底物及20 μL細(xì)胞提取液，讀數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤的表達(dá)

miR-20a-5p在人胃MALT淋巴瘤表達(dá)增高，顯著高于鄰近正常粘膜組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)(圖1)。

與鄰近正常粘膜組織相比，**P<0.05圖1 qRT-PCR檢測胃MALT淋巴瘤與鄰近正常粘膜組織的miR-20a-5p的表達(dá)(n=18)

2.2 miR-20a-5p對淋巴瘤細(xì)胞的增殖和遷移的影響

與正常Raji細(xì)胞相比，miR-20a-5p mimic轉(zhuǎn)染顯著提高miR-20a-5p的表達(dá)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，miR-20a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染顯著提抑制miR-20a-5p的表達(dá)，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

miR-20a-5p mimic轉(zhuǎn)染與正常Raji細(xì)胞或miR-20a-5p mimic對照組相比，**P<0.05；miR-20a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染組與miR-20a-5p inhibitor轉(zhuǎn)染對照組相比，##P<0.05圖2 qRT-PCR檢測Raji細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miR-20a-5p的相對表達(dá)量

CCK-8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，與正常對照組相比，miR-20a-5p mimic組細(xì)胞的OD450值在48 h和72 h均明顯增加，miR-20a-5p inhibitor組細(xì)胞的OD450在48 h和72 h均明顯降低，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

miR-20a-5p抑制劑可明顯抑制Raji細(xì)胞的遷移作用，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4、表2)。

圖3 CCK-8檢測miR-20a-5p對Raji細(xì)胞增殖的影響

圖4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測miR-20a-5p對Raji細(xì)胞遷移的影響(×100)

表2 Raji細(xì)胞遷移抑制率

2.3 miR-20a-5p直接靶向RUNX3表達(dá)

miRbase數(shù)據(jù)庫包括了大量已報(bào)道的miRNA的前提序列及成熟序列，本研究查找該數(shù)據(jù)庫找到了人源miR-20a-5p的成熟序列，通過TargetScan (http://www.targetscan.org)、Microrna (http://www.microrna.au.uk/cgibin/targets/v4/search.pl) 及DIANA LAB (http://www.diana.cslab.ece.ntua.gr)3種生物信息學(xué)軟件算法預(yù)測分析顯示RUNX3蛋白為miR-20a-5p的主要的候選靶點(diǎn)之一。RUNX3蛋白是一個(gè)有前景的腫瘤促癌基因，參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。例如，miRNA-20a-5p可通過靶向RUNX3促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的生長[15]，miR-20a-5p可調(diào)控RUNX3的表達(dá)。

Western blot結(jié)果顯示外源miR-20a-5p可下調(diào)RUNX3的蛋白水平，轉(zhuǎn)染miR-20a-5p inhibitor可恢復(fù)RUNX3蛋白水平。雙熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評估，與RUNX3-Wt相比，miR-20a-5p能夠抑制RUNX3的Mut 3′-UTR報(bào)告載體的熒光素酶活性(P<0.05)(圖5)。

圖5 miR-20a-5p直接靶向RUNX3的表達(dá)

2.4 RUNX3蛋白在人胃MALT淋巴瘤組織中的表達(dá)(圖6)

與鄰近的正常粘膜組織相比，胃MALT淋巴瘤組織中RUNX3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.000 1)。miR-20a-5p和RUNX3 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(r=-0.502,P<0.05)(圖6)。

圖6 miR-20-5p下調(diào)胃MALT淋巴瘤中RUNX3的表達(dá)

3 討論

胃MALT淋巴瘤是一種低度惡性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤，其病理機(jī)制與胃癌相似，可發(fā)生于胃的任何部位，最常見于胃竇，如本文納入的18例胃MALT淋巴瘤中9例病變部位為胃竇。miRNA參與調(diào)控多種實(shí)體瘤的發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移等過程，作為療效評判和預(yù)后指標(biāo)，具有重要的臨床價(jià)值，miRNA在胃MALT淋巴瘤的發(fā)病過程中扮演怎樣的角色，對胃MALT淋巴瘤的治療又有怎樣的啟示等是近年來研究的熱點(diǎn)問題。

miR-20a-5p是腫瘤中頻繁發(fā)生改變的miRNA之一，在很多惡性腫瘤中表達(dá)異常并參與腫瘤的發(fā)病過程[16]：miR-20a-5p在胃癌細(xì)胞系及癌組織中呈高表達(dá)，并與淋巴結(jié)侵襲轉(zhuǎn)移及浸潤深度有關(guān)；miR-20a-5p可負(fù)向調(diào)控TNFRSF21促進(jìn)頭頸鱗癌細(xì)胞增殖，與miR-20a-5p通過調(diào)控趨化因子受體-7(chemokine C-C-motif receptor 7,CCR7)來促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲能力緊密相關(guān)；在同一淋巴瘤的不同亞型中，miR-20a-5p在腫瘤組織的表達(dá)也存在明顯的不同，如WU Y Y等[17]研究顯示，生發(fā)中心 B 細(xì)胞樣(germinal center B cell,GCB)是彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中一類常見的亞型，miR-20a-5p的表達(dá)顯著高于非GCB型的DLBCL，提示miR-20a-5p可能與DLBCL生發(fā)中心形成有關(guān)；CHEN Y等[18]對比了miR-20a-5p在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)組織和鄰近正常組織的表達(dá)，結(jié)果表明miR-20a-5p在HCC中高表達(dá)。

盡管miRNA參與調(diào)控多種實(shí)體瘤的發(fā)生發(fā)展過程，但miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤中的表達(dá)模式和作用機(jī)制報(bào)道較少。本研究結(jié)果表明，miR-20a-5p在胃MALT淋巴瘤組織中的表達(dá)顯著高于鄰近的正常粘膜組織，66.7%(12/18)的腫瘤樣本miR-20a-5p表達(dá)顯著增加。進(jìn)一步的轉(zhuǎn)染研究顯示，用人工合成的外源性miR-20a-5p mimic提高或抑制劑抑制miR-20a-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示外源性miR-20a-5p mimic可促進(jìn)細(xì)胞增殖，而抑制miR-20a-5p表達(dá)可降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步證實(shí)miR-20a-5p與MALT淋巴瘤的發(fā)病緊密相關(guān)，因而有必要探討miR-20a-5p促進(jìn)胃MALT淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制。

大量研究表明RUNX3是一類的重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，調(diào)控腫瘤的病變活動(dòng)，作為一種腫瘤抑制因子，在多種腫瘤中發(fā)揮抑制作用[19]。當(dāng)RUNX3在實(shí)體腫瘤中功能降低或失活，腫瘤容易增殖或發(fā)生轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后。臨床研究表明RUNX3表達(dá)缺失可能與胃癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期縮短密切相關(guān)[20]，使用生物信息學(xué)軟件TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，RUNX3的3'UTR區(qū)含有一個(gè)潛在的miR-20a-5p結(jié)合位點(diǎn)，能夠靶向結(jié)合RUNX3的3'UTR區(qū)，抑制RUNX3 mRNA的翻譯，在肝癌的分子機(jī)制研究中，下調(diào)RUNX3蛋白表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。在本研究的miRbase數(shù)據(jù)庫查找人源miR-20a-5p的成熟序列，通過TargetScan、Microrna 及DIANA LAB 三種生物信息學(xué)軟件算法預(yù)測到腫瘤抑制因子RUNX3為miR-20a-5p的候選靶點(diǎn)，體外轉(zhuǎn)染及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)也證實(shí)RUNX3是miR-20a-5p的直接靶點(diǎn)。類似的研究在乳腺癌及肝細(xì)胞癌也有報(bào)道，如BAI X D等[21]研究顯示，乳腺癌的miR-20a-5p呈高表達(dá)，當(dāng)miR-20a-5p呈低表達(dá)時(shí)，乳腺癌裸鼠的腫瘤生長明顯減緩，高表達(dá)的miR-20a-5p顯著降低RUNX3的mRNA和蛋白水平，RUNX3是為人類乳腺癌miR-20a-5p的靶標(biāo)，表明miR-20a-5p在乳腺癌具有潛在臨床應(yīng)用前景。CHEN Y K[22]等人研究顯示miR-20a-5p在肝細(xì)胞癌組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)，超過1/2的腫瘤組織中呈高表達(dá)，體外研究顯示miR-20a-5p過表達(dá)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移，抑制miR-20a-5p表達(dá)可抑制肝細(xì)胞癌的增殖活性及遷移程度，進(jìn)一步，與非腫瘤組織相比，肝細(xì)胞癌組織中RUNX3的mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，miR-20a-5p的過表達(dá)可通過抑制RUNX3的翻譯促進(jìn)了肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移。

綜上所述，miR-20a-5p在胃MATL淋巴瘤中呈高表達(dá)并具有致癌特性，體外研究顯示miR-20a-5p可促進(jìn)Raji細(xì)胞增殖，可能與下調(diào)RUNX3蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究對miR-20a-5p調(diào)控胃MATL淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為miRNAs應(yīng)用于淋巴瘤的治療及預(yù)后評估提供了新的思路，但miR-20a-5p在體內(nèi)的作用有待深入研究。