李雪，唐慧,2，桑海明，李偉，王競(jìng)州，龐槐，張君*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院/新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832000;2 石河子大學(xué)科研處，新疆 石河子 832000;3 新疆石河子市人民醫(yī)院泌尿外科，新疆 石河子 832000;4 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 石河子 832000)

前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是歐美國(guó)家老年男性死亡的重要原因之一。在世界范圍內(nèi)，男性惡性腫瘤中PCa的發(fā)病率排名第2位，死亡率排名第5位[1]。在西方發(fā)達(dá)國(guó)家PCa是最常見的男性腫瘤，約占男性惡性腫瘤的1/3，病死率占第3位[2]。20世紀(jì)末至21世紀(jì)初的10年期間，中國(guó)PCa發(fā)病率的上升速度是同期瑞典、荷蘭等傳統(tǒng)高發(fā)地區(qū)6倍左右[3-4]。盡管已有大量的研究關(guān)注PCa發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，但目前仍然不是十分明確。因此，尋找PCa發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子，將為臨床預(yù)防和治療PCa提供理論基礎(chǔ)和分子靶標(biāo)。

Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一類具有鋅脂結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，目前發(fā)現(xiàn)并命名的KLF家族成員有18個(gè)，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化以及胚胎發(fā)育等多個(gè)生命活動(dòng)的調(diào)控[5-7]。已有研究表明，KLFs家族的多個(gè)成員參與多種腫瘤的發(fā)生過程[8]。有關(guān)KLF7(Krüppel-like factor 7)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，目前研究較少，DING X J等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，KLF7過表達(dá)可通過下調(diào)E-鈣粘蛋白的表達(dá)，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的遷移和表皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。JIANG Z等[10]報(bào)道KLF7可作為侵襲性胃癌和預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。最近的研究則表明，miR-185可以通過靶向下調(diào)KLF7的表達(dá)，從而抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲能力[11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，KLF7可通過與炎癥因子IL-6啟動(dòng)子區(qū)靶向結(jié)合促進(jìn)其表達(dá)[12]。

有關(guān)KLF7與PCa發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此本研究在收集前列腺增生和PCa患者前列腺組織的基礎(chǔ)上，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法比較KLF7及其下游因子IL-6，以及腫瘤發(fā)生相關(guān)因子E-鈣粘蛋白、Ki67在前列腺癌患者癌組織中的表達(dá)差異，同時(shí)運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)KLF7可能的下游靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，為闡明PCa發(fā)生的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源與納入標(biāo)準(zhǔn)

于新疆石河子市人民醫(yī)院泌尿外科調(diào)取2017-2019年住院病人病歷資料，選取血清游離前列腺特異性抗原(Prostate specific antigen,PSA)>3.5 ng·mL-1，結(jié)合病理穿刺結(jié)果明確診斷為前列腺癌(PCa)患者30例，以及前列腺增生(Benign prostatic hyperplasia,BPH)患者22例，收集患者一般資料及血糖、血脂等生化指標(biāo)，根據(jù)病人病案號(hào)于病理科調(diào)取病人石蠟包埋組織標(biāo)本。本研究方案通過了石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查，并批準(zhǔn)實(shí)施(2017-049-01)。

1.2 樣本分組

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，將樣本分為前列腺增生組(BPH，n=22)以及前列腺癌組(PCa，n=30)，比較兩組受試個(gè)體的一般資料和血糖、血脂含量。選取BPH和PCa患者石蠟包埋前列腺組織，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)前列腺組織中KLF7、IL-6及E-鈣粘蛋白的表達(dá)水平。

1.3 血脂血糖水平檢測(cè)

血清PSA采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，血糖 (Glucose,Glu)、總膽固醇 (Total cholesterol,TC)、甘油三酯 (Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白 (High density lipoprotein,HDL-C)、低密度脂蛋白 (Low density lipoprotein,LDL-C) 均采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.4 HE及免疫組織化學(xué)法

1.4.1 HE染色

(1) 將石蠟切片置于烘箱中60 ℃烤30 min；(2) 石蠟切片常規(guī)二甲苯，乙醇脫蠟至水；(3) 蘇木素染5 min；流水沖洗，去余色；(4) 0.7%鹽酸乙醇分化3～5 s；(5)流水沖洗，切片變藍(lán)約3～5 min；(6)酒精性伊紅染30 s；(7)I 95%乙醇30 s，II 95%乙醇30 s，I 100%乙醇30 s，II 100%乙醇30 s，I二甲苯30 s，II二甲苯30 s；(8)中性樹膠封片。

1.4.2 免疫組織化學(xué)染色

KLF7購于abcam公司(貨號(hào)：ab197690)；IL-6購于中杉金橋(貨號(hào)：TA50067)；E-鈣粘蛋白抗體購于中杉金橋(貨號(hào)：ZM0092)；Ki67購于中杉金橋(貨號(hào)：ZM-0166)。免疫組織化學(xué)步驟如下：(1)將石蠟切片置于烘箱中60 ℃烤30 min；(2)二甲苯脫蠟 3×5 min，酒精脫二甲苯 3×5 min；(3)用枸櫞酸鈉修復(fù)液，提前用微波爐加熱，高壓鍋沸騰后調(diào)至800 W,8 min關(guān)火；(4)將修復(fù)盒放入水盆置室溫，3% 雙氧水處理切片 避光10 min以滅活性內(nèi)源性過氧化物酶活性；(5)PBS洗3×5 min，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗，4 ℃過夜。(6)37 ℃復(fù)溫30 min，PBS洗去一抗 3×5 min；(7)滴加生物素標(biāo)記的二抗(PV6000)，室溫或37攝氏度孵育30～60 min；(8)PBS洗去二抗 3×5 min；配置DAB顯色液，每張切片50～100 μL；(9)顯色顯色結(jié)束后立即用自來水沖去顯色液；(10)蘇木素染核3～5 min，酸酒精5 s，用水沖洗；(11)酒精脫水，二甲苯透明，選擇適當(dāng)?shù)姆馄瑒?中性樹膠)封片。

1.4.3 免疫組織化學(xué)染色評(píng)分

染色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)值：陰性0分，淺棕色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。然后將陽性細(xì)胞百分比×染色強(qiáng)度對(duì)應(yīng)的值作為評(píng)分。

1.5 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)KLF7下游靶基因(圖1)

在轉(zhuǎn)錄因子靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫Cistrome Data Browser中輸入“KLF7”，得到3個(gè)項(xiàng)目ENCSR604VWJ_1、ENCSR604VWJ_2和GSM2026749，以score≥0.5為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從3個(gè)項(xiàng)目中共篩選出144個(gè)KLF7預(yù)測(cè)靶基因。然后在生物信息學(xué)軟件DAVID中對(duì)144個(gè)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，分析流程見圖1。

圖1 生物信息學(xué)分析KLF7下游關(guān)鍵基因流程圖

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 受試個(gè)體一般資料比較

比較前列腺增生個(gè)體和PCa患者一般資料和血糖、血脂水平后發(fā)現(xiàn)，PCa患者血清PSA水平顯著高于前列腺增生個(gè)體，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而其它一般資料在3組間均無顯著差異。(表1)。

表1 受試個(gè)體一般資料比較

2.2 BPH與PCa患者前列腺組織中KLF7及其下游因子IL-6蛋白表達(dá)水平的比較

比較BPH患者(n=22)前列腺組織和PCa患者(n=30)腫瘤組織中的KLF7及IL-6表達(dá)情況，結(jié)果顯示：PCa患者癌組織中KLF7及IL-6的表達(dá)水平均顯著高于增生的前列腺組織(P<0.05)(圖2，3)。以上結(jié)果提示：作為轉(zhuǎn)錄因子的KLF7高表達(dá)，可能通過轉(zhuǎn)錄激活I(lǐng)L-6誘發(fā)炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致前列腺癌的發(fā)生發(fā)展，而炎癥反應(yīng)在PCa發(fā)生過程中的作用尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

圖2 免疫組化染色比較PCa與BPH組織中KLF7的表達(dá)情況

圖3 免疫組化染色比較PCa與BPH組織中IL-6的表達(dá)情況

2.3 前列腺增生與前列腺癌患者組織中腫瘤發(fā)生相關(guān)因子E鈣粘蛋白、Ki67蛋白表達(dá)水平的比較

比較BPH患者(n=22)前列腺組織和PCa患者(n=30)腫瘤組織中腫瘤發(fā)生相關(guān)因子E鈣粘蛋白、Ki67的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：PCa患者癌組織中Ki67的表達(dá)水平顯著高于增生的前列腺組織(P<0.001)(圖4)；而E-鈣粘蛋白的表達(dá)在兩組間無顯著差異(圖5)。

以上結(jié)果證實(shí)：細(xì)胞周期紊亂是PCa發(fā)生過程中的重要條件，而這一過程是否與KLF7高表達(dá)有關(guān)，值得進(jìn)一步探討和研究。

圖4 免疫組化染色比較PCa與BPH組織中Ki67的表達(dá)情況

圖5 免疫組化染色比較PCa與BPH組織中E-鈣黏蛋白的表達(dá)情況

2.4 前列腺癌患者癌組織中KLF7表達(dá)與各因子間的相關(guān)性分析

將PCa患者癌組織中KLF7表達(dá)與其他各因子進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，KLF7的表達(dá)與患者血清中PSA含量顯著正相關(guān)(r=0.465,P=0.001)，與癌組織中IL-6的表達(dá)顯著正相關(guān)(r=0.437,P=0.014)，與癌組織中Ki67的表達(dá)顯著正相關(guān)(r=0.434,P=0.002)，與癌組織中E-鈣粘蛋白的表達(dá)顯著正相關(guān)(r=0.473,P=0.009)；并且癌組織中IL-6、Ki67的表達(dá)均與患者血清中前列腺癌特異性抗原的含量顯著正相關(guān)(r=0.427，P=0.026；r=0.553，P<0.001)(圖6)。

圖6 前列腺癌患者癌組織中KLF7表達(dá)與各因子的相關(guān)性分析

2.5 KLF7下游靶基因預(yù)測(cè)

在Cistrome Data Browser數(shù)據(jù)庫中預(yù)測(cè)KLF7下游靶基因，按照?qǐng)D1流程圖進(jìn)行分析：將三個(gè)項(xiàng)目預(yù)測(cè)結(jié)果取交集后共得到144個(gè)靶基因。隨后將144個(gè)靶基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO富集結(jié)果將以上基因分為3類：生物過程(Biology Process,BP)、細(xì)胞組分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)(表2)。以上基因主要有53個(gè)GO條目富集于生物過程，主要包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄、調(diào)控RNA代謝過程、細(xì)胞周期進(jìn)程、負(fù)向調(diào)控大分子代謝過程、負(fù)向調(diào)控基因表達(dá)等；有26個(gè)GO條目富集于細(xì)胞組分，主要包括非膜結(jié)合細(xì)胞器、細(xì)胞器內(nèi)腔、膜封閉腔、細(xì)胞骨架、細(xì)胞漿、核漿等；有12個(gè)GO條目富集于分子功能，主要包括DNA結(jié)合、金屬離子過渡結(jié)合、鋅離子結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活動(dòng)、RNA結(jié)合等(圖7)。以上結(jié)果提示，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的KLF7下游靶基因能夠富集到癌癥相關(guān)進(jìn)程，包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程、核酸結(jié)合、鋅離子結(jié)合等，以上基因中與癌癥相關(guān)的基因有：STAT3,DDX20,ZNF233,ZNF581,ZNF487,ZNF580,ZNF391,ZNF793,HMGB1,DMAP1,CTNNB1,ZBTB45等。

表2 144個(gè)靶基因功能分類

表2續(xù)

表2續(xù)

表2續(xù)

圖7 靶基因富集于分子功能的12個(gè)GO條目

3 討論

Krüppel樣因子(Krüppel-like factors,KLFs)是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，目前發(fā)現(xiàn)并命名的KLF家族成員有18個(gè)，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化以及胚胎發(fā)育等多個(gè)生命活動(dòng)的調(diào)控[5-7]。已有研究表明，KLFs家族的多個(gè)成員參與多種腫瘤的發(fā)生過程，并且發(fā)揮著截然不同的作用，如：KLF4的低表達(dá)與乳腺癌、膀胱癌、宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生負(fù)相關(guān)；KLF5的高表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生；KLF6的高表達(dá)與乳腺癌、前列腺癌等的發(fā)生顯著正相關(guān)[8]。

KLF7定位于細(xì)胞核中，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可對(duì)靶基因發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用[13]。KLF7與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前研究較少，在僅有的幾篇報(bào)道中，均表現(xiàn)出促癌的作用，但具體的作用機(jī)制尚不十分明確[9-11]。有關(guān)KLF7表達(dá)在PCa發(fā)生過程中的作用，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)法比較后發(fā)現(xiàn)，PCa患者癌組織中KLF7的表達(dá)水平顯著高于前列腺增生患者前列腺組織，提示KLF7高表達(dá)可能與PCa的發(fā)生有關(guān)，其作用的具體分子機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。目前已有的機(jī)制研究，均闡明的是KLF7的表達(dá)如何受到影響，即研究的是KLF7的上游，而高表達(dá)的KLF7是如何導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的研究甚少[14-16]。

有關(guān)炎癥因子IL-6與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道，在癌前病變的細(xì)胞中，炎性細(xì)胞因子IL-6等能夠促進(jìn)NF-κB和STAT3的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、血管生成等過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。FRIEDENREICH C M等[18-19]研究表明，子宮內(nèi)膜癌個(gè)體血漿IL-6及TNF-α的水平顯著高于對(duì)照個(gè)體，并且IL-6可以促進(jìn)體外子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖。已有文獻(xiàn)提出[20]，前列腺周圍組織中脂肪細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞來源的IL-6可能通過旁分泌的方式促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生與發(fā)展。HAYASHI T等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食下前列腺巨噬細(xì)胞可通過分泌IL-6促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

本研究結(jié)果顯示：IL-6在前列腺癌患者癌組織中的表達(dá)顯著升高。以上提示：IL-6的高表達(dá)在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但其高表達(dá)的具體原因目前尚不十分明確。ZHANG M X等[12]研究發(fā)現(xiàn)，KLF7可通過與IL-6啟動(dòng)子區(qū)靶向結(jié)合促進(jìn)其表達(dá)。結(jié)合本研究中KLF7與IL-6均在前列腺癌組織中高表達(dá)，并且癌組織中KLF7的表達(dá)與患者血清PSA含量及IL-6表達(dá)均顯著正相關(guān)，IL-6表達(dá)也與患者血清PSA含量顯著正相關(guān)，以上結(jié)果提示KLF7可能通過調(diào)控IL-6的表達(dá)促PCa的發(fā)生，其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

Ki67和E-鈣粘蛋白均已被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并作為診斷標(biāo)志物廣泛應(yīng)用于臨床[22]，而有關(guān)KLF7與Ki67和E-鈣粘蛋白在前列腺癌中表達(dá)的相關(guān)性，目前尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示：前列腺癌組織中KLF7的表達(dá)與Ki67及E-鈣粘蛋白的表達(dá)均顯著正相關(guān)，提示上述因子之間可能存在內(nèi)在聯(lián)系并且與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)，而做為轉(zhuǎn)錄因子的KLF7是否通過轉(zhuǎn)錄激活作用上調(diào)Ki67及E-鈣粘蛋白的表達(dá)，有待進(jìn)一步的深入研究加以證實(shí)。此外，生物信息學(xué)初步分析結(jié)果顯示，做為轉(zhuǎn)錄因子，KLF7可能通過調(diào)控一系列腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程，而上述基因中具體何種基因參與了KLF7高表達(dá)導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生的過程，尚需進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。