王明遠，張賓，于剛，王雨曈，楊永林，余乾，趙宗勝，楊華

(1 石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000；2 新疆農墾科學院省部共建綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；3 北屯市阿山屯科肉用種羊繁育有限公司，新疆 北屯 836000；4 新疆生產建設兵團第十師181團農業(yè)發(fā)展服務中心，新疆 北屯 836001)

繁殖性狀是綿羊重要的經濟性狀，繁殖力的高低直接影響?zhàn)B羊業(yè)經濟效益。母羊的繁殖力主要表現(xiàn)為產羔數和季節(jié)發(fā)情特征，褪黑激素(melatonin，Mel)是一種重要的吲哚類內分泌激素，在哺乳動物中主要由視網膜和松果體分泌，在動物繁殖中具有重要的生物學作用。根據光照周期的表現(xiàn)，褪黑激素分泌呈現(xiàn)晝低夜高，其生物學功能主要通過與高親和力的褪黑素受體(melatonin receptor，MTNR)結合對季節(jié)性發(fā)情動物的晝夜節(jié)律和生殖活動發(fā)揮調節(jié)作用[1]。

綿羊MTNR1A基因位于第26號染色體，包含2個外顯子與1個內含子[2]。目前，研究人員已將MTNR1A基因作為調控綿羊繁殖性能的候選基因之一，其多態(tài)性位點大多數位于外顯子2區(qū)域，并證明與產仔數、季節(jié)性發(fā)情有關。PELLETIER等[3]發(fā)現(xiàn)了綿羊MTNR1A基因外顯子2的606和612兩個沉默突變與繁殖相關。MATEESCU等[4]研究表明，多賽特母羊MTNR1A基因外顯子2的612位點MM和Mm基因型相比于mm基因型具有更高的產羔數。MARTNEZ R等[5]證實在Rasa Aragonesa綿羊MTNR1A基因外顯子2存在11個SNPs，啟動子區(qū)存在17個SNPs，SNP606/RsaI等位基因與母羊常年發(fā)情相關，啟動子的422和677位點和外顯子2的612位點T、A和T等位基因的單倍型與常年發(fā)情相關。MUATEESCU等[6]研究表明，Sarda綿羊MTNR1A基因外顯子2的612位點的MM基因型與603～606位點的RR基因型具有更高的的受孕率與產羔數。由此可見，研究人員已將MTNR1A基因作為綿羊繁殖力的關鍵基因來研究，并取得了較多的研究成果。我國擁有豐富的綿羊品種資源，其中湖羊是引入新疆的高繁殖力和常年發(fā)情綿羊品種，多胎薩?？搜蚴切陆r墾科學院培育的多胎新品系肉羊[7]，中國美利奴羊(新疆軍墾型)是季節(jié)性繁殖的毛用綿羊品種。在這些不同繁殖特征的綿羊中，MTNR1A基因是否存在影響綿羊繁殖功能的新SNPs，SNPs是否引起MTNR1A基因功能改變值得進一步研究。

本試驗以高繁殖力的湖羊和多胎薩?？搜颍约爸袊览?新疆軍墾型)單胎羊為研究對象，對MTNR1A基因具有高度多態(tài)性的外顯子2區(qū)域進行克隆和測序，篩選重要的SNPs，并分析序列特征，預測基因功能，為進一步闡明MTNR1A基因在綿羊繁殖活動中的作用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

試驗樣本選擇周歲健康的201只母羊，包括45只湖羊，94只多胎薩?？搜蚝?2只中國美利奴(新疆軍墾型)單胎羊。采集綿羊頸靜脈血，制備EDTA-Na2抗凝血，利用基因組DNA提取試劑盒(Omega公司)提取血液基因組DNA。

1.2 引物設計與合成

根據NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中公布的綿羊MTNR1A基因序列(GenBank登錄號：NM_001009725.1)，與UCSC(http://genome.ucsc.edu/)中的綿羊參考基因組數據(Oar_v4.0，2015年11月)比對分析，獲得MTNR1A基因的exon 2及其上下游序列，利用Primer Premier 5.0設計引物，引物MTA2擴增的序列覆蓋MTNR1A基因exon2全長，引物信息見表1，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 擴增MTNR1A基因exon 2的引物信息

1.3 MTNR1A基因exon 2的克隆

隨機選擇3個品種(系)綿羊的基因組DNA各3只，應用PCR擴增MTNR1A基因exon 2，體系為50 μL：2×Es Taq MasterMix 25 μL，上下游引物各1 μL，基因組DNA模板2 μL，ddH2O 21 μL。MTNR1A基因exon 2的PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃終延伸5 min；PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

根據瓊脂糖凝膠回收試劑盒說明書(天根生化科技(北京)有限公司)分別回收純化目的PCR產物。經25 ℃ 20 min連接回收產物與pEASY-T1 Simple TA載體，連接產物轉化到Trans1-T1感受態(tài)細胞中。篩選陽性重組子，將陽性克隆菌液、MTNR1A基因exon 2的 PCR產物送往生工生物工程(上海)有限公司測序。

1.4 MTNR1A基因exon 2的序列比對和多態(tài)性分析

根據測序獲得的湖羊、多胎薩?？搜蚝椭袊览騇TNR1A基因exon 2序列，利用DNAMAN9.0對DNA序列進行比對分析，獲得基因新的SNPs位點。以3個品種(系)201只綿羊為試驗群體，應用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術檢測突變位點的真實性，并分析不同基因型在各綿羊群體中的分布，以及基因突變所引起的MTNR1A氨基酸變化。根據綿羊參考基因組數據獲得突變位點上下游200 bp序列，MassARRAY引物由北京康普森生物技術有限公司設計并合成。

1.5 生物信息學分析

根據綿羊MTNR1A基因參考序列(GenBank登錄號：NM_001009725.1)，利用DNAstar分析MTNR1A基因不同物種之間核苷酸序列的同源性；應用NovoPro在線轉換工具獲得氨基酸序列；通過ExPASy Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)、SOPMA、PSORT Ⅱ prediction、TMHMM Server 2.0、NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、NetOGlyc 4.0 Server、NetNGlyc 1.0 Server、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)在線軟件分析MTNR1A蛋白的基本理化性質、二級結構、亞細胞定位、跨膜結構域、磷酸化位點、信號肽、O糖基化位點、N糖基化位點以及三級結構預測，通過Interpro(www.ebi.ac.uk/interpro/)在線分析網站對MTNR1A蛋白功能進行預測。

1.6 數據分析

計算綿羊群體中各位點的基因型頻率和基因頻率，利用Haploview 4.2軟件進行哈代-溫伯格平衡檢驗、群體雜合度(Het-erozygosity，Ho)和最小等位基因頻率(MAF)的計算，利用PIC_CALC 0.6軟件計算多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結果與分析

2.1 MTNR1A基因的PCR擴增

MTNR1A基因exon2的PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產物約為1 155 bp，擴增產物大小與預期結果一致，特異性好(圖1)。

1-9為MTNR1A基因PCR產物，C為空白對照，M為DL2000 DNA Marker圖1 MTNR1A基因PCR擴增產物的電泳檢測

2.2 MTNR1A核苷酸序列比對分析

比對湖羊、多胎薩福克羊和中國美利奴羊MTNR1A基因exon 2序列，發(fā)現(xiàn)在綿羊群體中MTNR1A的exon 2存在8個突變位點。

其中，C378T、G405T、G564 A、A735G、A753G和T843C為同義突變，A658G和A845C為錯義突變；其中A658G導致第220位氨基酸纈氨酸變成異亮氨酸(V220I)，A845C導致第282位氨基酸處天冬氨酸變成丙氨酸(D282A)。

2.3 MTNR1A基因單核苷酸多態(tài)性分析

在綿羊群體中應用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術驗證8個SNPs位點的真實性(圖2)，進一步分析綿羊群體中MTNR1A基因8個SNPs的遺傳多態(tài)性。MassARRAY系統(tǒng)具有靈敏度高，精確度高，檢測速度快，成本低等優(yōu)點并且可以根據需求靈活調節(jié)，本次試驗8個突變位點在201個個體中檢出率達到100%。表2可見，MTNR1A基因C378T位點在湖羊和多胎薩福克羊中只存在CC基因型和C等位基因，而在中國美利奴羊中存在CC、CT和TT3種基因型，并處于哈代溫伯格不平衡狀態(tài)(P<0.05)。其余7個位點在3種綿羊品種中均存在3種基因型，并處于哈代溫伯格平衡狀態(tài)。T405G位點在湖羊和多胎薩?？搜蛉后w中G為優(yōu)勢等位基因，而在中國美利奴羊中T為優(yōu)勢等位基因；T843C位點在湖羊中C為優(yōu)勢等位基因，而在多胎薩福克羊和中國美利奴羊群體中T為優(yōu)勢等位基因；C378T、G564 A、A658G、A735G、A753G和A845C位點在3個綿羊品種中均有相同的優(yōu)勢等位基因。

圖2 MTNR1A基因突變位點的MassARRAY分型檢測結果

T405G、G564 A、A658G、A735G與A753G位點在湖羊，A845C位點在湖羊和中國美利奴羊中呈低度多態(tài)性(PIC<0.25)，這些位點在其余品種中均表現(xiàn)為中度多態(tài)性(0.25

表2 MTNR1A基因不同SNP位點在三個品種(系)綿羊中的群體遺傳學分析

表2續(xù)

2.4 MTNR1A基因核苷酸序列同源性分析

經序列比對分析表明，3個綿羊品種MTNR1A基因的核苷酸序列與Genbank數據庫中綿羊序列(登錄號NM_001009725.1)的核苷酸序列同源性均達到99.27%以上，表明克隆的序列確實為綿羊MTNR1A基因869 bp的exon2區(qū)域。核苷酸序列與已發(fā)表的Hassan羊(Genbank登錄號KC580735)、Malpura羊(Genbank登錄號KC757710)、Kashmir羊(Genbank登錄號HQ658144)、AvikaLIN羊(Genbank登錄號JF901325)、Musimon羊(Genbank登錄號FJ801038)MTNR1A基因同源性均在99.3%以上，與山羊(Genbank登錄號XM_018041838.1)、牛(Genbank登錄號XM_002698656.5)、人(Genbank登錄號NM_005958.4)、小鼠(Genbank登錄號NM_008639.3)同源性分別為98.2%、97.0%、84.6%、80.6%(圖3)。

MTNR1A基因核苷酸序列同源性比較，1～12分別為多胎薩?？搜?、湖羊、中國美利奴羊、Hassan羊、Malpura羊、Kashmir羊、AvikaLIN羊、Musimon羊、山羊、普通牛、人、小鼠。右上為核苷酸序列同源性結果，左下為核苷酸序列散度(分歧)結果圖3 MTNR1A基因核苷酸序列同源性分析

2.5 MTNR1A基因編碼蛋白質序列的基本信息和功能預測

利用ExPASy Protparam軟件分析突變前后MTNR1A基因編碼的蛋白質基本理化性質，結果顯示突變前后MTNR1A的蛋白分子式均為C1874H2932N476O482S18，由366個氨基酸組成，總平均親水性為0.614，表現(xiàn)為疏水性，蛋白質的理化性質均沒有發(fā)生變化。

綿羊MTNR1A突變引起了7處蛋白二級結構的改變(圖4)，突變前的α螺旋為37.43%，β轉角為5.46%，無規(guī)則卷曲為36.34%和延伸鏈為20.77%。

突變后α螺旋為37.98%，β折疊為4.92%，無規(guī)則卷曲為36.07%和延伸鏈為21.04%。MTNR1A蛋白的亞細胞定位表明，MTNR1A主要分布在內質網，分布比例為55.6%；磷酸化位點預測結果顯示MTNR1A蛋白存在20個絲氨酸殘基磷酸化位點，6個蘇氨酸殘基磷酸化位點；糖基化位點預測結果顯示MTNR1A蛋白含有6個O-糖基化潛在位點和2個N-糖基化潛在位點?；?個位點的突變沒有引起磷酸化、糖基化的變化。經蛋白功能預測，MTNR1A屬于視紫紅質樣G蛋白偶聯(lián)受體家族中褪黑素受體家族，MTNR1A在129-145含有G蛋白受體F1_2結構域蛋白。MTNR1A生物學過程參與G蛋白偶聯(lián)受體信號通路 (GO：0007186)；分子功能為G蛋白偶聯(lián)受體活性 (GO：0004930)、褪黑素受體活性 (GO：0008502)；細胞學組件均為膜整體組分 (GO：0016021)。

藍色長豎線為α螺旋，紅色中長線為延伸鏈，綠色中短線為β轉角，紫色短線為無規(guī)則卷曲；箭頭標識處為突變后二級結構有變化的位置圖4 MTNR1A突變前后蛋白二級結構示意圖

2.6 MTNR1A蛋白質三級結構分析

根據同源建模方法預測的MTNR1A蛋白質三級結構見圖5。突變前序列與模板相似度61.36%，GMQE=0.72，QMEAN=-3.68，可信度較高；突變后序列與模板相似度61.36%，GMQE=0.71，QMEAN=-3.69，可信度較高?？梢姡?個錯義突變引起的氨基酸改變沒有導致蛋白質三級結構的顯著變化。

圖5 MTNR1A突變前后蛋白三級結構示意圖

3 討論

褪黑激素是一種在夜間由松果體分泌的多效性信號分子，光周期信號被褪黑素轉化為神經內分泌信號后傳遞到下丘腦-垂體-性腺軸，能夠調節(jié)多種生理功能。在調節(jié)動物繁殖過程中，光周期信號會通過視交叉上核(Suprachiasmatic nucleus，SCN)傳遞到松果體，使松果體分泌褪黑激素與垂體結節(jié)部褪黑激素受體結合產生促甲狀腺激素，再與室管膜細胞上的促甲狀腺激素受體結合引起室管膜細胞中脫碘酶2(DIO2)和脫碘酶3(DIO3)表達變化，而DIO2和DIO3能夠調節(jié)T3/T4的水平，進而調節(jié)GnRH的釋放，最終調控動物的季節(jié)性繁殖[8]。研究表明，褪黑素是通過與高親和力的褪黑素受體結合發(fā)揮其生殖和生理效應，褪黑激素受體是一種經典的G蛋白，帶有七個跨膜結構域，一個細胞外N-末端結構域和三個細胞外環(huán)的耦合受體[9]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是在基因組水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，根據對氨基酸序列的影響分為同義突變、錯義突變、無義突變以及延長突變，其中錯義突變會導致蛋白質功能發(fā)生變化。基因突變所引起的任何氨基酸變化都可能影響受體與配體之間的相互作用。在MTNR1A基因多態(tài)性的研究報道中，MTNR1A基因存在較多SNPs位點，而且大多數都不相同，表現(xiàn)出品種差異性。程篤學等[10]以常年發(fā)情的小尾寒羊和季節(jié)性發(fā)情的多賽特羊共20只母羊為研究對象，在小尾寒羊的MTNR1A基因外顯子2上發(fā)現(xiàn)C329T、G355T、C566T、C580 A和A675G5個核苷酸變化。CALVO等[11]證明Rasa-Aragonesa羊存在rs403212791和rs403212791突變位點。SAXENA等[8]以101只Chokla綿羊為研究對象，在MTNR1A基因ExonⅡ區(qū)域克隆測序發(fā)現(xiàn)10個突變，其中G706 A、C893 A和G931C為非同義突變，在印度熱帶干旱綿羊品種中發(fā)現(xiàn)C426T、G555 A和G706 A三個突變位點；LURIDIANA等[12]發(fā)現(xiàn)Sarda 母羊存在C606T和G612 A兩個突變位點，與產羔數關聯(lián)分析證明兩位點與生殖活動相關聯(lián)。本次試驗以高繁殖力的湖羊和多胎薩?？搜?，以及中國美利奴羊(新疆軍墾型)單胎羊為研究對象，在MTNR1A基因exon2共發(fā)現(xiàn)8個SNPs(C378T、G405T、G564 A、G658 A、A735G、A753G、T843C、A845C)，均為未曾報道過的新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)位點，其中A658G引起氨基酸變化(V220I)，該突變在第5跨膜結構域可能會導致蛋白結合能力改變。A845C引起氨基酸變化(D282 A)，該突變在第三個胞外環(huán)沒有明確的生理功能。功能預測表明，A658G和A845C位點所引起的氨基酸的改變，導致蛋白質二級結構發(fā)生變化，但是沒有引起翻譯后修飾、拓撲結構以及三級結構的改變。王世銀等[13]以季節(jié)性發(fā)情的阿勒泰羊和常年發(fā)情的湖羊為研究對象，通過PCR-SSCP檢測g.15143697位點的T/C突變發(fā)現(xiàn)，湖羊以CC基因型為主,其基因型頻率達到0.919，阿勒泰羊中以TT基因型為主,基因型頻率為0.950,推測該位點可能與綿羊的季節(jié)性發(fā)情有關。與之相似的李廣錄[14]研究結果顯示MTNR1A基因與綿羊的繁殖性狀有一定聯(lián)系，而王瓊等[15]研究顯示MTNR1A基因與策勒黑羊繁殖性能關系不大。本研究根據突變位點在2個高繁殖力綿羊品種(湖羊和多胎薩?？搜?與中國美利奴羊(新疆軍墾型)單胎群體中的基因型分布，C378T位點在多胎的湖羊、多胎薩福克羊中只存在CC基因型，而在單胎中國美利奴羊中存在CC、CT和TT三種基因型，由此可見單胎中國美利奴羊與具有多胎性能的湖羊和多胎薩?？搜蛳啾扔刑厥獾腡等位基因，初步認為C378T位點突變影響綿羊繁殖性能。然而，由于試驗樣本為周歲母羊，MTNR1A基因C378T突變位點引起的繁殖功能變化有待于試驗母羊配種以后統(tǒng)計產羔情況后關聯(lián)分析驗證，或進一步擴大群體在經產母羊群體中驗證功能。

蔣維東等[16]研究表明和田羊MTNR1A基因與已發(fā)表的綿羊屬Chokla、Musimon和Patanwadi(登錄號分別為KC727711、FJ801038、KJ865682)三個品種羊的同源性均高于98%；與牦牛、野牛、牛、山羊和藏羚羊(登錄號分別為KF569810、XM010835821、U73327、KC865680、KJ005972610)的同源性為96%～98%。程篤學等[17]研究表明小尾寒羊MTNR1A基因外顯子2氨基酸序列與反芻動物差異最小。趙艷紅等[18]研究表明內蒙古絨山羊MNTR1A基因第2外顯子氨基酸序列與已發(fā)表的山羊氨基酸序列的同源性為97.7%，與已發(fā)表的綿羊、牛、人和鼠的氨基酸同源性分別為94.1%、91.8%、82.2%、83.1%。本試驗發(fā)現(xiàn)，綿羊品種間的MTNR1A核苷酸序列同源性達到99%以上，與牛科動物山羊、牛同源性較高也在98%、96%以上，與人、鼠同源性在80%以上。研究結果與蔣維東等、程篤學等與趙艷紅等相似，說明MTNR1A基因的核苷酸序列具有較高的的保守性。生物信息學分析表明，MTNR1A是疏水性的非極性分子，MTNR1A蛋白存在20個絲氨酸殘基磷酸化位點，6個蘇氨酸殘基磷酸化位點，這些修飾位點可能通過絲氨酸和蘇氨酸磷酸化作用以激活MTNR1A蛋白質的活力。進一步基因功能預測也顯示，MTNR1A的生物學作用主要富集在細胞表面受體信號傳導途徑與G -蛋白偶聯(lián)受體信號通路，可以促進在相關三聚體G蛋白復合物的α亞基上GTP/GDP的交換，表明MTNR1A在綿羊繁殖調控信號傳導中扮演了重要角色。

綜上所述，在湖羊、多胎薩?？搜蚝椭袊览蛑邪l(fā)現(xiàn)MTNR1A基因存在8個新的SNPs位點(C378T、G405T、G564 A、G658 A、A735G、A753G、T843C、A845C)，MTNR1A基因具有較高的遺傳多態(tài)性。其中，C378T突變位點可能與綿羊繁殖性能密切相關。下一步將擴大試驗綿羊群體，根據產羔數等表型數據進一步研究MTNR1A基因功能性SNPs，為闡明MTNR1A基因的繁殖學功能，以及開展高繁殖力綿羊的標記輔助育種提供基礎。