陸曉岑，杜明洋，周維佳，馬紅麗，黃璐熹，玉潔瑩，劉建男，郭思聰，趙小然，葉仕根

(大連海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，大連市海珍品疾病防控重點實驗室，遼寧 大連 116023)

鏈球菌是一種條件性人畜共患病病原菌，可感染人類和幾乎所有海淡水魚類，可引起局部組織蜂窩織炎、心內(nèi)膜炎及化膿性腦膜炎等[1]。目前，發(fā)現(xiàn)的水生動物致病性鏈球菌主要有無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae、海豚鏈球菌Streptococcusiniae和停乳鏈球菌Streptococcusdysgalactiae等種類。無乳鏈球菌又稱B群鏈球菌 (Group BStreptococcus)， 是鏈球菌中重要類型之一[2]。無乳鏈球菌除可感染人、牛、豬、狗外，還可感染海灣鯡Brevoortiapatronus、海鯰Ariusfelis、羅非魚Oreochromisniloticus、日本沼蝦Macrobrachiumnipponense、牛蛙Bullfrog等[3]。如無乳鏈球菌能夠引起新生兒敗血癥，血液中可分離培養(yǎng)出鏈球菌，感染后死亡率很高；感染無乳鏈球菌的羅非魚在泰國炎熱季節(jié)的死亡率高達(dá)95%，無論是在經(jīng)濟(jì)上還是在市場供應(yīng)方面都造成了重大損失[4]；2009、2010年在浙江養(yǎng)殖牛蛙地區(qū)發(fā)生一種新的無乳鏈球菌流行病，在蝌蚪和剛變態(tài)幼蛙中的發(fā)病率已超過了60%，該病死亡率也極高, 通常達(dá)60%以上[5]。

水生動物細(xì)菌性疾病的防治方法主要有投喂抗生素和化學(xué)合成抗菌藥物、接種疫苗預(yù)防及使用微生態(tài)制劑調(diào)控等[6]。目前，抗菌藥物治療是中國水生動物細(xì)菌性疾病防治的主要手段之一。然而，長期大量使用抗菌藥物易導(dǎo)致藥物殘留、增加病原菌的耐藥性，甚至?xí)a(chǎn)生超級耐藥菌株。接種疫苗雖具有安全、特異及綠色環(huán)保等優(yōu)點，但仍存在效果不穩(wěn)定、操作不便等問題，且目前多數(shù)水生動物疾病尚無疫苗可用。微生態(tài)制劑是在微生物理論指導(dǎo)下,對宿主有益的活性微生物及其代謝產(chǎn)物和促生長物質(zhì)的制劑，具有維持宿主微生態(tài)平衡、提高機體健康水平、拮抗病原及改善養(yǎng)殖水環(huán)境等多種作用，已在人類健康及多種水產(chǎn)動物疾病防控中表現(xiàn)出良好功效[7]。本研究中，以重要的水產(chǎn)病原菌——無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae為指示菌，以實驗室分離、保存不同來源芽孢桿菌為備選菌株進(jìn)行病原拮抗菌株篩選及主要拮抗物質(zhì)分析，以期從微生態(tài)制劑防控的角度為水生動物無乳鏈球菌病防治提供新的思路和參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

備選菌株：本試驗所用21株芽孢桿菌分離自鹽堿地養(yǎng)殖池塘、海洋牧場或受贈于研究所等地，保存在大連市海珍品疾病防控重點實驗室超低溫冰箱(-80 ℃)中。

指示菌：無乳鏈球菌(KCCM11957)，由韓國釜慶大學(xué)魚病預(yù)防實驗室自牙鲆腸道分離鑒定并贈予，保存于大連市海珍品疾病防控重點實驗室超低溫冰箱(-80 ℃)中。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的篩選與鑒定 拮抗菌的初篩方法參考李云等[8]的報道，采用雙層平板法。用接種針或滅菌牙簽將備選菌株點種于底層含NaCl質(zhì)量濃度為30 g/L的NA平板上，28 ℃下倒置培養(yǎng)。待備選菌株形成肉眼可見菌落后，在底層平板上倒入10 mL左右混有109CFU/mL無乳鏈球菌的半固體培養(yǎng)基(含30 g/L的NaCl和250 g/L瓊脂的NB)，于28 ℃培養(yǎng)6～8 h后，觀察并測量備選菌株的菌落和抑菌圈直徑。將有明顯抑菌活性的備選菌株進(jìn)行復(fù)篩。

拮抗菌的復(fù)篩方法參照Yang等[9]的報道，采用瓊脂擴(kuò)散法(打孔法)。挑取拮抗菌單菌落于液體培養(yǎng)基中，180 r/min恒溫28 ℃振蕩培養(yǎng)12 h獲得種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%的接種量接種于液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床中培養(yǎng)36 h。取發(fā)酵液于4 ℃、4 000 r/min下離心10 min，取上清液，經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后得到拮抗菌去菌體發(fā)酵液(CFS)待用。在半固體培養(yǎng)基滅菌后約45 ℃時加入指示菌菌液，使指示菌終濃度為105～106CFU/mL后倒板。平板凝固后用直徑5 mm的打孔器打孔，加入35 μL的CFS，28 ℃培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果，并測量抑菌圈直徑。選取CFS抑菌效果最好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)將篩選獲得的拮抗菌進(jìn)行生理生化鑒定。拮抗菌16S rDNA鑒定采用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后測序。測序結(jié)果在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，選擇相似度較高序列并使用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹分支置信度用1 000次重復(fù)自舉檢驗，在計算過程中，系統(tǒng)自動省略不確定和缺失的位點。

1.2.2 抑菌物質(zhì)的純化及最小抑菌濃度(MIC)測定 采用硫酸銨沉淀法初步純化拮抗菌胞外抑菌物質(zhì)。將CFS于4 ℃時加入硫酸銨，使硫酸銨飽和度分別達(dá)到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%，于4 ℃靜置過夜，以10 000 r/min離心30 min，收集沉淀。沉淀重懸于0.01 mol/L的PBS緩沖液后，置于相對分子質(zhì)量為1 000的透析袋透析24 h，測定經(jīng)不同飽和度硫酸銨沉淀后抑菌物質(zhì)的抑菌活性。選擇最適飽和度硫酸銨純化物質(zhì)經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱層析分段分離，用0.01 mol/L的PBS緩沖液洗脫，流速為0.5 mL/min，10 min為一組。經(jīng)指示菌檢測獲得抑菌活性最強的組分，取其進(jìn)行后續(xù)檢測。

取10個滅菌試管，編號1～10號，并加入NB肉湯1.0 mL。于1號管中加入1.0 mL抑菌活性最強組分溶液并在1～7號管中進(jìn)行倍比稀釋。1～7號管再加入100 μL指示菌。8號管不加抑菌物質(zhì)，9號管不加指示菌，10號管僅加1.0 mL NB肉湯。于28 ℃培養(yǎng)24 h后觀測結(jié)果。

1.2.3 抑菌物質(zhì)的MALDI-TOF-MS和LC-MSMS檢測 采用MALDI-TOF-MS(由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所完成)和LC-MSMS(由生工生物工程(上海)股份有限公司完成)法測定菌株抑菌物質(zhì)成分。

1.2.4 主要抑菌物質(zhì)的理化特性分析 物理因素對抑菌物質(zhì)的影響參照Wen等[10]的方法進(jìn)行。將純化的活性組分分別置于40、60、80、100、121 ℃溫度下孵育20 min，以熱處理前樣品作為對照，研究溫度對活性組分抑菌作用的影響。調(diào)節(jié)活性組分pH分別為2、4、6、8、10，處理30 min后調(diào)節(jié)pH至7，以處理前活性組分作為對照，研究pH對活性組分抑菌活性的影響。將活性組分置于20 W紫外燈下分別照射1、3、5 h，照射距離為15 cm，以未用紫外照射的抑菌物質(zhì)溶液作為對照組，研究紫外照射對活性組分抑菌活性的影響。

化學(xué)因素對抑菌物質(zhì)的影響參照張寶[11]的方法進(jìn)行。分別加入蛋白酶K、胰蛋白酶、胃蛋白酶，使酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL(調(diào)節(jié)胃蛋白酶處理組pH為2)，于37 ℃條件下水浴處理2 h，然后置于100 ℃條件下金屬浴5 min，以未添加蛋白酶的抑菌物質(zhì)作為對照組，研究蛋白酶對活性組分抑菌活性的影響。向活性組分中分別加入等量的甲醇、乙醇和丙酮有機溶劑，置于室溫條件下1 h，以不添加有機溶劑的抑菌物質(zhì)作為對照組，研究有機溶劑對活性組分抑菌活性的影響。將活性組分的pH調(diào)節(jié)為2，于4 ℃條件下靜置12 h。在4 ℃、10 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀。用甲醇抽提沉淀3次，得到拮抗菌的活性組分，利用薄層層析硅膠板進(jìn)行層析，用質(zhì)量濃度為5 g/L的茚三酮水溶液顯色并觀察結(jié)果。

從本次奇異變化的特征看，與地震前兆異常有一定的相似性(魏慶汝，2000)。另外，汶川地震前，全國地?zé)崤_網(wǎng)的256口觀測井，有40口觀測到了疑似異常，震前陡降異常有15口，占異?？倲?shù)的37.5%。這類異常出現(xiàn)時間與地震發(fā)生時間相差多為幾天至幾十天。雖然蘭考豫11井水溫、水位突降形態(tài)與某些疑似前兆異常類似，但此異常已持續(xù)長達(dá)一年，期間并沒有對應(yīng)的地震發(fā)生。因此，此異常為地震前兆異常的可能性很小。

2 結(jié)果與分析

2.1 無乳鏈球菌拮抗菌株篩選與鑒定結(jié)果

雙層平板法篩選結(jié)果顯示(圖1(a))，21株備選菌株中有19株有較明顯的抑菌活性(表1)，選取上述菌株進(jìn)行胞外產(chǎn)物的抑菌活性復(fù)篩試驗(圖1(b))，結(jié)果表明，共有7株芽孢桿菌的胞外抑菌物質(zhì)對無乳鏈球菌產(chǎn)生抑菌活性，其中，菌株BA015的CFS對無乳鏈球菌的拮抗作用最強，抑菌直徑達(dá)到(29.2±0.8) mm，故選擇BA015進(jìn)行后續(xù)拮抗特性研究。

圖1 細(xì)菌篩選結(jié)果Fig.1 Results of screening of partial bacteria

生理生化試驗結(jié)果顯示，拮抗菌BA015與吲哚、硫化氫不發(fā)生反應(yīng)，與V.P、甘露糖、甘露醇反應(yīng)為陽性，除肌醇、棉子糖和精氨酸雙水解酶外與BacillussubtilisATCC 6051基本一致(表2)。16S rDNA序列分析顯示，BA015的16S rDNA序列與BacillussubtilisBEST7613(AP012495.1)的一致性達(dá)到99.9%?；?6S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，BA015與枯草芽孢桿菌聚為一支(圖2)。結(jié)合生理生化特性分析，鑒定菌株BA015為枯草芽孢桿菌。

表1 拮抗菌的抑菌活性Tab.1 Antibacterial activity of antagonistic bacteria

圖2 基于菌株BA015 16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the strains based on BA015 16S rDNA

2.2 抑菌物質(zhì)純化及最小抑菌濃度

拮抗菌BA015的CFS經(jīng)不同飽和度硫酸銨純化后的抑菌活性結(jié)果顯示，采用80%飽和度硫酸銨沉淀提取的抑菌物質(zhì)對指示菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑可達(dá)22.8 mm(表3)。80%飽和度硫酸銨鹽析后的粗提物經(jīng)凝膠柱層析后共收集到15組抑菌物質(zhì)，其中第7、8組抑菌作用最強,抑菌直徑分別為22.2、20.8 mm。后經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，活性組分的蛋白質(zhì)量濃度為103.8 μg/mL，抑菌物質(zhì)的MIC為3.2 μg/mL，未檢測到最小殺菌濃度(MBC)。

表2 拮抗菌BA015的生理生化特征

表3 不同飽和度硫酸銨鹽析的抑菌物質(zhì)的抑菌活性

2.3 MALDI-TOF-MS及LC-MSMS檢測結(jié)果

用80%飽和度硫酸銨沉淀的產(chǎn)物經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖3所示。在荷質(zhì)比(m/z)為1 054.48、1 068.47處有離子峰出現(xiàn)，這2個離子峰均對應(yīng)于Iturin B的分子質(zhì)量；在m/z值為1 031.45、1 045.50、1 053.47、1 067.47、1 055.47、1 069.48處有離子峰出現(xiàn)，這6個離子峰均對應(yīng)于Bacillomycin D的質(zhì)量；在m/z值為1 032.49處有離子峰出現(xiàn)，這個離子峰對應(yīng)于Surfactin B的質(zhì)量；在m/z值為1 505.69、1 519.65、1 525.68、1 539.65、1 553.65、1 543.64處有離子峰出現(xiàn)，這6個離子峰均對應(yīng)于Fengycin A的質(zhì)量(表4)[12-21]。

圖3 枯草芽孢桿菌BA015脂肽類物質(zhì)的MALDI-TOF-MS分析Fig.3 MALDI-TOF-MS analysis of lipopeptide fraction from Bacillus subtilis BA015

LC-MSMS檢測質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過UniProt蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析，比對酶切肽評分值較低，共檢測到21個可信蛋白比對結(jié)果，未見有抗菌活性的相關(guān)報道。

2.4 拮抗菌活性組分的主要特性

從表5可見：溫度處理試驗顯示，芽孢桿菌活性組分熱穩(wěn)定性良好，不同溫度處理后各組的抑菌活性僅略有降低，但組間差異不明顯；pH處理試驗顯示，芽孢桿菌活性組分對pH不敏感，pH適應(yīng)范圍廣，不同酸堿條件處理后各處理組的均保持良好；紫外照射處理試驗顯示，芽孢桿菌活性組分對紫外不敏感，具有較好穩(wěn)定性，幾乎不受紫外照射影響；拮抗菌BA015活性組分可與茚三酮水溶液反應(yīng)顯紅色；蛋白酶處理試驗顯示，芽孢桿菌活性組分抑菌活性對其不敏感，抑菌活性仍保持穩(wěn)定；有機溶劑處理試驗顯示，芽孢桿菌活性組分抑菌活性對其不敏感，乙醇處理組與對照組相比，直徑大小僅損失約10%。

表4 活性組分的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析

表5 理化因素對活性組分抑菌活性的影響

3 討論

3.1 無乳鏈球菌拮抗菌篩選與鑒定

無乳鏈球菌宿主眾多、致病性高，可突破血腦屏障進(jìn)行繁殖[22]，已受到廣泛關(guān)注。本研究中以21株芽孢桿菌作為備選菌株，以無乳鏈球菌作為指示菌株，在初篩得到19株具有拮抗無乳鏈球菌作用的菌株基礎(chǔ)上，復(fù)篩中發(fā)現(xiàn)菌株BA015的去菌體發(fā)酵液對無乳鏈球菌抑制作用最強，經(jīng)鑒定該菌株為枯草芽孢桿菌。BA015在初篩時抑菌活性與復(fù)篩時存在差異，這可能是由于菌株間相互作用機制復(fù)雜，胞外產(chǎn)物只是其中一個影響因素，這一現(xiàn)象也進(jìn)一步證實了微生物拮抗作用的復(fù)雜性。

本研究中拮抗菌的初篩與復(fù)篩均采用瓊脂擴(kuò)散法，瓊脂擴(kuò)散法是利用待檢測菌在瓊脂表面對指示菌的生長顯示抑制效果的一種定性篩選方法,因具有操作簡單、使用方便、經(jīng)濟(jì)的特點，是目前較為常用的檢測方法，在篩選拮抗菌、測定抗生素效價、抑菌藥敏試驗等方面都有廣泛應(yīng)用[23-25]。

3.2 抑菌物質(zhì)分析

BA015的去菌體發(fā)酵液采用80%飽和硫酸銨鹽析后的粗體物，經(jīng)葡聚糖凝膠柱層析分離出的第7、8組活性組分抑菌作用最強。對其進(jìn)行LC-MSMS質(zhì)譜檢測，結(jié)果與蛋白質(zhì)比對后發(fā)現(xiàn)并無抑菌相關(guān)的蛋白質(zhì)。經(jīng)MALDI-TOF-MS質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)，有Iturin、Bacillomycin、Surfactin和Fengycin類脂肽同系物。后續(xù)試驗驗證顯示，理化因素對柱層析后的第7、8組活性組分影響均不明顯，這一特點符合脂肽類物質(zhì)的特征，由此推斷，脂肽為BAO15的主要抑菌物質(zhì)。

本研究中使用的MALDI-TOF-MS和LC-MSMS是目前物質(zhì)組分鑒定工作中較多使用的方法。MALDI-TOF儀器是最容易操作的MS儀器，對肽的檢測也十分精確、靈敏[12]。因此，MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)常應(yīng)用于鑒定脂肽、基因分型分析、鑒定病原體、質(zhì)譜成像等[26-27]。使用LC-MSMS所建立的分析方法通常具有較短的分析時間、較高的監(jiān)測感度及較高的選擇性，適合應(yīng)用于微量分析物的定性確認(rèn)與定量分析方法的開發(fā)[28]。LC-MSMS常應(yīng)用于酒中物質(zhì)殘留、中藥活性成分測定、菌株產(chǎn)物鑒定等[29-30]。

3.3 脂肽及其在疾病防控中的應(yīng)用

脂肽一般是革蘭氏陽性芽孢桿菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物[11]，作為一種細(xì)菌產(chǎn)生的由核糖體合成的抗菌肽，對相似或近緣菌株的生長有一定的抑制作用。芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽一般具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗支原體、抗病毒、抗血凝、抗腫瘤、抗昆蟲活性及表面活性劑的特性。其抑菌譜廣、穩(wěn)定性高，對熱、酶不敏感，能抗紫外照射[31]。因此，近年來對脂肽研究十分活躍，涉及許多領(lǐng)域。脂肽用于抗菌方面，如Sim等[32]將D-enantiomeric和脂肪酸共價添加到抗菌肽桿菌素中以增強其抗菌活性。在人類醫(yī)療方面,如Li等[33]用葡萄球菌Staphylococci中得到的脂肽激活β-連環(huán)蛋白抑制皮炎。由于抗菌脂肽具有區(qū)別于常規(guī)抗生素的全新抗菌機制，不僅不易產(chǎn)生耐藥性，而且對傳統(tǒng)藥物已具有耐藥性的菌株仍然有良好的抑菌或殺菌功效，因此，本文為尋找抑制動物細(xì)菌感染、安全無殘留的抑菌物質(zhì)提供了新思路，使脂肽成為綠色安全、新型高效的水產(chǎn)抗菌藥物的研發(fā)方向。

4 結(jié)論

1) 拮抗菌BA015的去菌體發(fā)酵液經(jīng)80%飽和度硫酸銨沉淀后抑菌直徑可達(dá)22.8 mm，MIC為3.2 μg/mL，因此，菌株BA015及其去菌體發(fā)酵液對無乳鏈球菌具有較好的抑制效果。

2) MALDI-TOF-MS分析結(jié)果確定脂肽含有伊枯菌素(Iturin)、桿菌霉素(Bacillomycin)、表面活性素(Surfactin)、芬薺素(Fengycin)等，因此，BA015的主要抑菌物質(zhì)為脂肽。