王珺，梁騰，王化敏，閆喜武，丁鑒鋒*

(1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023； 2.遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心，遼寧 大連 116023)

生物體有氧呼吸和氧化代謝過程中產生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在介導信號轉導和細胞凋亡過程中扮演重要角色，在對病原微生物的免疫過程中發(fā)揮重要作用[1]。但過量的活性氧能夠引起嚴重的細胞損傷并導致生物體存活時間縮短[2]。因此，生物體內存在維持機體活性氧水平的機制，其中，由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)組成的抗氧化酶系統(tǒng)在維持體內活性氧平衡過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。GPx是一類內源性抗氧化酶，其通過使用谷胱甘肽(Glutathione,GSH)作為電子供體，催化過氧化氫和有機過氧化物還原為水和氧氣，在保護機體免受氧化損傷過程中起著關鍵作用[5]。根據(jù)其亞細胞的定位、與底物的結合特性和氨基酸序列，哺乳動物GPx分為GPx1～GPx6共6個家族[4,6]。根據(jù)催化活性中心是否含硒代半胱氨酸，又將GPx分為硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶(Se-GPx)和非硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶(non-Se-GPx)。在無脊椎動物中，珠蚌屬的Uniotumidus[7]和長牡蠣Crassostreagigas[8]中的GPx在抗氧化反應中發(fā)揮重要作用，而皺紋盤鮑Haliotisdiscusdiscus[6]、櫛孔扇貝Chlamysfarreri[9]、凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei[10]和中國明對蝦Fenneropenaeuschinensis[11]中的GPx則參與免疫調節(jié)過程。

菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum(以下簡稱蛤仔)是重要的海水養(yǎng)殖貝類，占中國灘涂養(yǎng)殖貝類總量的近70%[12]。在過去幾十年里，蛤仔養(yǎng)殖過程中發(fā)生的幾次大規(guī)模死亡造成嚴重的經濟損失。造成蛤仔死亡的原因可能是環(huán)境污染導致的水質惡化，或者是弧菌、病毒等引起的感染等，因此，了解蛤仔免疫調控機制對蛤仔健康養(yǎng)殖具有重要意義。此外，不同殼色蛤仔對環(huán)境脅迫抗性及其免疫能力有所不同[13-14]，研究不同殼色抗逆性差異機制對于蛤仔優(yōu)良品系的選育具有重要的理論價值。本研究中，結合基因組數(shù)據(jù)，采用cDNA末端快速擴增技術(RACE)獲得蛤仔Se-GPx基因(命名為RpSe-Gpx)全長序列，通過實時熒光定量PCR技術(RT-qPCR)對基因組織表達及不同殼色蛤仔免疫應答過程中的作用進行分析，以期深入了解Se-GPx基因在蛤仔免疫中的作用，為蛤仔殼色選育和健康養(yǎng)殖提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用蛤仔采自遼寧省盤錦市灘涂區(qū)域，為遼寧省貝類良種繁育工程技術研究中心繁育的橙蛤、白蛤、白斑馬蛤3種蛤仔，殼長為(2.0±0.5)cm。挑選殼形完整且活力較強的個體，在50 L水體的平底塑料槽中暫養(yǎng)一周，水溫為(18.0±0.5)℃，鹽度為32，溶解氧為(7.50±0.05)mg/L。每天換水一次，并投喂螺旋藻粉，持續(xù)充氧，使其適應實驗室環(huán)境后再進行正式試驗。

1.2 方法

1.2.1 組織表達和免疫刺激處理 取暫養(yǎng)的普通養(yǎng)殖群體蛤仔3只，采集其閉殼肌、外套膜、鰓、水管、性腺、肝胰腺和足組織樣品，用液氮速凍后于-80 ℃下保存，用于基因克隆和組織表達分析。

脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)用磷酸緩沖液(PBS)配制成濃度為100 μg/mL的溶液。取暫養(yǎng)的3種殼色菲律賓蛤仔，分別設置LPS和PGN刺激組。LPS刺激組3種殼色蛤仔各設置2個重復組，共分為6組，每組30枚蛤仔，分別向每只蛤仔血淋巴中注射50 μL LPS溶液，注射后的蛤仔置于水溫為(18±0.5)℃、鹽度為32、溶解氧為(7.5±0.05)mg/L、容積為50 L的養(yǎng)殖水槽中。分別在處理后0、6、12、24、48 h隨機選取3種殼色蛤仔各3枚，取外套膜組織50～100 mg，迅速放入液氮中冷凍后于-80 ℃下保存，用于免疫刺激基因表達分析。PGN刺激組采用相同方式處理，其注射劑量也為50 μL。

1.2.2 RNA提取和反轉錄 按照天根生化科技(北京)有限公司動物組織總RNA抽提試劑盒說明書方法進行總RNA提取，用15 g/L瓊脂糖電泳檢測產物完整性，用核算分析儀(Thermo Nanodrop 2000c)檢測A260 nm/A280 nm值。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa公司)反轉錄試劑盒對提取的RNA進行反轉錄獲得cDNA。

1.2.3RpSe-GPx基因全長克隆RpSe-GPx基因開放閱讀框由菲律賓蛤仔基因組數(shù)據(jù)中獲取[15]，以鰓組織反轉錄產物為模板，3′RACE采用半巢式PCR法，按照SMARTer?RACE 5′/3′ Kit說明書進行操作，所用引物見表1。

1.2.4 基因表達分析 以蛤仔Tublin基因作為內參基因，對RpSe-GPx基因表達量進行分析。引物設計見表1。本試驗中采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。不同組織基因表達量分析中以水管組織表達量作為對照；免疫刺激基因表達量分析中以白蛤0 h的表達量作為對照。

表1 試驗使用引物序列Tab.1 Sequences of primers used in the experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果以平均值±標準差(mean±S.D.)表示，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析，用Duncan法進行多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 基因全長及序列分析

序列分析表明,RpSe-GPx-a cDNA序列全長1 257 bp (GenBank 登錄號：MH085058.1)(圖1(a))，包括582 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼193個氨基酸(GenBank 登錄號：AVZ23985.1)，5′端非編碼區(qū)(5′-UTR)長度為97 bp， 3′端非編碼區(qū)(3′-UTR)長度為578 bp，推導的蛋白相對分子質量為 22 250，等電點(pI)為7.71。RpSe-GPx-b序列全長為1 112 bp (GenBank 登錄號：MH085059.1)(圖1(b))，包括633 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼210個氨基酸(GenBank 登錄號：AVZ23986.1),5′端非編碼區(qū)長度109 bp，3′端非編碼區(qū)長度為370 bp，推導的蛋白相對分子質量為24 110，等電點為8.88。使用SignalP 4.1 Server 進行信號肽預測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，結果顯示，兩個蛋白N末端無信號肽結構。使用SECISearch 2.19工具(http://genome.unl.edu./SECISearch.html)分析發(fā)現(xiàn)，在Se-GPx基因3′UTR區(qū)域存在SECIS元件(圖2)。

起始密碼子ATG和終止密碼子TAA用粗體標注；硒半胱氨酸U及其密碼子TGA用粗體和單下劃線標注；GPx活化位點基序GKVVLVENVASLUGTT、信號肽基序LGFPCNQF和典型的GPx的活化位點基序WNFEKF用雙下劃線標注；SECIS元件用斜體和單下劃線標注；加尾信號AATAAA用方框標注。Start codon ATG and stop codon TAA are shown in bold,selenocysteine and its codon TGA are shown in bold and underlined,GPx active site motif GKVVLVENVASLUGTT,the signal peptide motif LGFPCNQF and the typical activation site motif WNFEKF of Se-GPx are indicated in double underlined,the SECIS components are italicized and in single underlined, and the tailed signal AATAAA is boxed.圖1 菲律賓蛤仔Se-GPx-a和Se-GPx-b基因全長 cDNA 序列及其編碼的氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and the deduced amino acid sequence of Se-GPx-a and Se-GPx-b genes in Manila clam Ruditapes philippinarum

圖2 RpSe-GPx-a和RpSe-GPx-b基因SECIS元件Fig.2 SECIS components of RpSe-GPx-a and RpSe-GPx-b genes

2.2 蛤仔Se-GPx基因多序列比對和系統(tǒng)進化分析

使用BioEdit 7.09軟件的Clustal W程序進行氨基酸多序列比對。從圖3可見：RpSe-GPx-a與RpSe-GPx-b基因一致性為67%；RpSe-GPx-a基因與三角帆蚌序列一致性最高，為73%；RpSe-GPx-b基因與背角無齒蚌序列一致性最高，為71%。此外，硒代半胱氨酸位點、GPx活化位點基序GKVVLVENVASLUGTT和典型的GPx活化位點基序WNFEKF在選用的物種中高度保守，此位點和兩個功能域與GPx的催化活性相關[7]。

為進一步分析菲律賓蛤仔Se-GPx在進化中所處的地位，利用MEGA 6.0軟件，基于鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建34個物種的Se-GPx氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹。從圖4可見，所使用物種的GPx1～GPx6各自聚集到相應分支，而菲律賓蛤仔Se-GPx-a和Se-GPx-b則聚為一支，并與其他軟體動物Se-GPx聚集在一個單獨的分支中，這表明軟體動物Se-GPx可能具有區(qū)別于脊椎動物的共同進化途徑。

曼氏無針烏賊(ID: AEK48346，AGZ63440)、紫貽貝(ADY38576)、背角無齒蚌(ANG56607)、三角帆蚌(ACY72387)、真蛸北極七鰓鰻(AIU44099)、小鼠(NP_109602)、雙斑隆頭魚(XP_020497739)、藍鰭金槍魚(BAL41419)和斑馬魚(NP_001007282)；硒代半胱氨酸位點(U)用三角號標注；GPx活化位點基序GKVVLVENVASLUGTT用下劃線標注；典型GPx活化位點基序WNFEKF用方框標注；參與二聚體形成的氨基酸殘基用星號標注。Sepiella maindroni，Octopus vulgaris， Mytilus galloprovincialis，Sinanodonta woodiana，Hyriopsis cumingii，Lethenteron camtschaticum，Mus musculus，Labrus bergylta，Thunnus orientalis，and Danio rerio； Highly conserved regions are shown in the figure and completely conserved selenocysteines (U) are indicated with a black triangle；the GPx signature motif (GKVVLVENVASLUGTT) is underlined and the active site motif (WNFEKF) is boxed,and residues involved in making dimer interface are marked with asterisks.圖3 菲律賓蛤仔Se-GPx氨基酸序列多重比較Fig.3 Multiple amino acid sequence alignments of Se-GPx in Manila clam Ruditapes philippinarum

圖4 菲律賓蛤仔Se-GPx系統(tǒng)進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Se-GPx family amino acid sequences in Manila clam Ruditapes philippinarum

2.3 蛤仔Se-GPx基因的組織表達

從圖5可見：蛤仔Se-GPx基因在閉殼肌、外套膜、鰓、水管、性腺、肝胰腺和足組織中均有表達；Se-GPx-a和Se-GPx-b在肝胰腺中表達量均最高(P<0.05)，分別在外套膜、鰓組織中表達量次之，而閉殼肌中表達水平均最低(P<0.05)。

2.4 LPS刺激下3種殼色蛤仔Se-GPx表達變化

使用Ttublin作為內參基因，對3種殼色蛤仔Se-GPx基因在LPS刺激下外套膜的相對表達量水平進行檢測。從圖6(a)可見：白蛤Se-GPx-a基因表達量在12 h時達到最大值(P<0.05)，且顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)；白斑馬蛤Se-GPx-a表達量在48 h時達到最大值(P<0.05)，且顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)；橙蛤Se-GPx-a表達量在3 h時達到最大值(P<0.05)，在3、6 h時表達量均顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)。從圖6(b)可見：白蛤和白斑馬蛤Se-GPx-b基因表達量均在6 h時達到最大值(P<0.05)，且均顯著高于橙蛤(P<0.05)；橙蛤Se-GPx-b表達量在24 h時達到最大值(P<0.05)，且顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)。

標有不同字母者表示同一種基因不同組織間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters in the same gene are significantly different in the different tissues at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖5 菲律賓蛤仔Se-GPx基因的組織表達Fig.5 Expression levels of Se-GPx gene in various tissues in Manila clam Ruditapes philippinarum

標有不同大寫字母者表示同一時間下3種殼色蛤仔間有顯著性差異(P<0.05)，標有不同小寫字母者表示同一殼色蛤仔在不同時間點有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。Note：The means with different capital letters at the same time are significantly different among shell-colour groups at the 0.05 probability level; the means with different letters in different time at the same shell-colour group being significantly different at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.圖6 LPS刺激下3種殼色蛤仔外套膜組織中Se-GPx mRNA表達量比較Fig.6 mRNA expression level of Se-GPx mRNA in mantle of three shell-colour Manila clam challenged with LPS at different time intervals

2.5 PGN刺激下3種殼色蛤仔Se-GPx表達變化

從圖7(a)可見：白蛤外套膜組織中Se-GPx-a基因表達量在24 h時達到最大值(P<0.05)，且顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)；白斑馬蛤Se-GPx-a基因表達量在24 h時達到最大值(P<0.05)，在48 h時顯著性下降(P<0.05)；橙蛤Se-GPx-a基因表達量在48 h時達到最大值(P<0.05)，且顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)。

從圖7(b)可見：白蛤Se-GPx-b基因表達量在24 h時達到最大值(P<0.05)，在6 h時顯著高于其他2種殼色(P<0.05)；白斑馬蛤Se-GPx-b基因表達量在24 h時達到最大值(P<0.05)，在12 h和24 h時顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)；橙蛤Se-GPx-b基因表達量在48 h時顯著升高并達到最大值(P<0.05)，在0、3、48 h時均顯著高于其他2種殼色蛤仔(P<0.05)。

圖7 PGN刺激下3種殼色蛤仔外套膜組織中Se-GPx mRNA表達量比較Fig.7 mRNA expression level of Se-GPx mRNA in mantle of three shell-colour Manila clam challenged with PGN at different time intervals

3 討論

3.1 蛤仔Se-GPx基因序列特征

本研究中，蛤仔Se-GPx-a中第184～186位和Se-GPx-b中第183～185位發(fā)現(xiàn)密碼子TGA,在不含硒蛋白中，UGA往往被識別作為終止密碼子，而在含硒蛋白中，可識別并翻譯作為Se-Cys，成為硒蛋白的重要部分并作為催化基團發(fā)揮作用[16]。此外，真核生物中處于3′UTR區(qū)域的硒代半胱氨酸插入元件(SECIS)則是密碼子UGA被翻譯成Se-Cys所必需的結構[17]。在蛤仔Se-GPx的3′UTR區(qū)域存在SECIS結構，由此可以推斷，蛤仔Se-GPx為含硒依賴性谷胱甘肽過氧化物酶且具有與其他物種Se-GPx類似的抗氧化功能[3,6]。

3.2 蛤仔Se-GPx基因的組織表達

對皺紋盤鮑[3]、櫛孔扇貝[9]、菲律賓蛤仔[18]、珠蚌屬的Uniotumidus[7]、淡水雙殼蚌Dreissenapolymorpha[19]等貝類的研究發(fā)現(xiàn)，其肝胰腺組織中均有高表達量的Se-GPx基因。對紫貽貝Mytilusedulis和Mytilusgalloprovincialis的研究發(fā)現(xiàn)，其肝胰腺消化細胞內溶酶體能夠蓄積細胞內離子轉移過程中產生的ROS[20]。而保護溶酶體膜免受氧化損傷，可能是貝類肝胰腺中較高Se-GPx基因表達量的重要原因之一。此外，對青蛤Cyclinasinensis的研究發(fā)現(xiàn)，其組織抗氧化能力依次為肝胰腺>外套膜>鰓[21]。本研究結果與上述文獻結果一致，蛤仔肝胰腺中Se-GPx基因高表達，且蛤仔外套膜和鰓組織中Se-GPx基因可能與其組織抗氧化能力密切相關。

3.3 3種殼色蛤仔Se-GPx基因免疫應答反應比較

谷胱甘肽過氧化物酶能夠催化降解體內的各種ROS保護機體免受氧化損傷，并在先天免疫反應過程中扮演重要角色[22]。本研究中3種殼色蛤仔Se-GPxmRNA表達量在LPS和PGN刺激后均表現(xiàn)出了一個增加的過程。研究發(fā)現(xiàn)，皺紋盤鮑在使用革蘭氏陰性菌弧菌Vibrioalginolyticus感染后其體內Se-GPx能夠被誘導表達[6]；凡納濱對蝦Se-GPx表達量在弧菌Vibrioalginolyticus感染后的12 h呈現(xiàn)出升高過程[10]；斑節(jié)對蝦PenaeusmonodonSe-GPx基因表達量在被美人魚發(fā)光桿菌Photobacteriumdamsela感染后6～12 h也表現(xiàn)出顯著升高過程[4]；櫛孔扇貝感染Listonellaanguillarum8 h時體內Se-GPx基因表達量顯著升高[9]；羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii注射漢斯德巴氏酵母菌Debaryomyceshansenii后Se-GPx基因表達量顯著升高[23]。本研究中3種殼色蛤仔經LPS和PGN刺激后，Se-GPx表達量均顯著升高，并在不同時間點呈現(xiàn)最大值，蛤仔Se-GPx基因表達量增加可能是細菌感染導致的呼吸爆發(fā)產生大量的活性氧，導致作為抗氧化組分的Se-GPx基因被大量誘導表達的結果[6]。研究表明，無脊椎動物對LPS和PGN刺激具有不同的免疫反應途徑，LPS通過與體內革蘭氏陰性菌結合蛋白結合，激活蛋白酶級聯(lián)反應，誘導抗菌肽的合成，并可以促進血淋巴吞噬、黑化、包囊和凝集反應[24]；而PGN主要與肽聚糖識別蛋白結合，激活酚氧化酶途徑，產生黑色素和活性氧完成其免疫響應過程[25]。酚氧化酶表達量差異所導致的黑色素合成及分布的不同是貝類產生殼色變化的一個重要因素[26-27]。此外，對3種殼色菲律賓蛤仔轉錄組分析發(fā)現(xiàn)，其酚氧化酶基因表達量依次為白斑馬蛤>白蛤>橙蛤，且白斑馬蛤表達量顯著高于白蛤和橙蛤[28]。本研究中，使用LPS刺激時，白斑馬蛤和白蛤Se-GPx-a和Se-GPx-b基因表達量增加幅度顯著高于橙蛤，使用PGN刺激時，橙蛤Se-GPx-a和Se-GPx-b基因表達量增加幅度顯著高于白蛤和斑馬蛤，兩種刺激劑對酚氧化酶誘導途徑差異所引起的活性氧生成量不同，可能是蛤仔Se-GPx基因表達量差異的主要原因。在活性氧清除過程中，白斑馬蛤和白蛤體內黑色素能夠參與并一定程度替代了抗氧化酶的作用[29]，因此，PGN誘導后白斑馬蛤和白蛤兩種蛤仔的Se-GPx表達量要略低于橙蛤。

綜上所述，殼色形成機制差異是導致3種殼色蛤仔Se-GPx基因對LPS和PGN刺激后出現(xiàn)不同響應過程的重要原因之一，本研究結果可為菲律賓蛤仔殼色選育及健康養(yǎng)殖提供數(shù)據(jù)資料。