滕 磊，蔡蔚然，柴宇琪，忻耀杰，袁 波

(上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203)

變應(yīng)性鼻炎是發(fā)生在特應(yīng)性個體的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng),這種“特應(yīng)性個體”即中醫(yī)學“體質(zhì)”的概念。雖然變應(yīng)性鼻炎可發(fā)生于各種不同體質(zhì)，但寒體最容易引起變應(yīng)性鼻炎，癥狀最嚴重[1]。由于引起變應(yīng)性鼻炎的多種炎性細胞及細胞因子與癥狀呈相關(guān)表達[1]，且受到骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的分化和免疫調(diào)控的影響[2]，說明體質(zhì)能影響骨髓MSCs的增殖表達。本研究以大鼠遺傳性體質(zhì)模型為基礎(chǔ)，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建變應(yīng)性鼻炎模型，探討骨髓MSCs在不同體質(zhì)變應(yīng)性鼻炎中的增殖表達情況。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 6周齡清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(165±55)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。自由進水、常規(guī)飼料喂養(yǎng)，室溫穩(wěn)定于20～25 ℃,空氣濕度為60%。

1.2實驗試劑和設(shè)備 卵清蛋白(Ⅴ級，Sigma，美國)；氫氧化鋁、PBS磷酸鹽緩沖液、抗體稀釋液(科夷生物科技有限公司提供)；CD29(ab179471)單克隆抗體和APC- Goat Anti-Rabbit(Ab130805)(Abcam，美國)；CD44-PE(88151)單克隆抗體(CST，美國)；CD45-FITC(561867)單克隆抗體(BD，美國)；Fresco離心機(Thermo，美國)；FACSCalibur流式細胞儀(BD，美國)；Scepter細胞計數(shù)器(Millipore，美國)。

1.3遺傳性體質(zhì)模型的建立 參照文獻[3]進行建模。將40只SD大鼠按雌雄分別測量肛溫，按照肛溫高低篩選自然狀態(tài)下寒、熱、常體3種體質(zhì)的SD大鼠各8只(雌雄各半)作為親代大鼠，按體質(zhì)類型及性別分籠飼養(yǎng)。寒體組灌飼黃連解毒湯，熱體組灌飼附子理中湯，常體組灌飼生理鹽水，進行體質(zhì)強化。按人與動物等效劑量換算方法折算用藥量，人與大鼠藥物每公斤體質(zhì)量劑量比為1∶6。黃連解毒湯成人劑量：黃連9 g、黃芩10 g、黃柏6 g、生梔子10 g；附子理中湯成人劑量：熟附片9 g、黨參10 g、炒白術(shù)10 g、炙甘草9 g、干姜9 g。調(diào)整至灌藥量2 mL/(次·d)，連續(xù)30 d后，同種體質(zhì)類型之間的雌雄鼠兩兩交配，產(chǎn)下的子1代大鼠同親代大鼠一樣，飼養(yǎng)至體質(zhì)量(165±55)g，分別按照肛溫高低，在同種體質(zhì)中篩選寒、熱、常體的同體質(zhì)大鼠并灌飼以上中藥或生理鹽水，如此重復親代大鼠的體質(zhì)強化和遺傳，直至子4代大鼠形成穩(wěn)定的寒、熱、常體的遺傳性體質(zhì)模型，待子4代鼠體質(zhì)量(165±55)g時實驗用。

1.4動物分組 將子4代鼠按體質(zhì)和是否藥物干預(yù)分為寒體無干預(yù)組、寒體干預(yù)組、熱體無干預(yù)組、熱體干預(yù)組、常體無干預(yù)組、常體干預(yù)組，每組24只，雌雄各半。

1.5變應(yīng)性鼻炎造模方法 ①系統(tǒng)致敏階段：以20 mg卵清蛋白+30 mg氫氧化鋁為免疫佐劑，溶于1 mL 0.9%氯化鈉注射液中，腹腔注射，隔日1次，共8次。②鼻腔激發(fā)階段：在完成系統(tǒng)致敏后，每日以50 mg卵清蛋白溶于1 mL 0.9%氯化鈉注射液中，制成濃度為5%的溶液，每只大鼠每側(cè)鼻腔50 μL滴鼻激發(fā)變態(tài)反應(yīng)，連續(xù)10 d。③局部維持階段：實驗階段無論取材與否，每日鼻腔繼續(xù)用卵清蛋白激發(fā)，以維持變應(yīng)性鼻炎的發(fā)作狀態(tài)。在末次滴鼻激發(fā)后30 min 內(nèi)，仔細觀察大鼠噴嚏、流涕、鼻癢、鼻塞等鼻變態(tài)反應(yīng)癥狀，并根據(jù)動物行為學積分評價標準進行臨床評分[4]，噴嚏:1～3個記1分，4～10個記2分，11個以上記3分；鼻涕:流至前鼻孔記1分，超過前鼻孔記2分，涕流滿面記3分；鼻癢: 輕擦鼻1～2次記1分，頻繁抓撓鼻記2分，撓鼻不止記2分；鼻塞：喘息急促記1分，喘息加重記2分，喘息致死記3分。上述癥狀評分累計>5分，表示模型成立。

1.6干預(yù)方法 變應(yīng)性鼻炎造模完成后，3個干預(yù)組從第2天開始在鼻腔激發(fā)后立即灌胃干預(yù)，藥物與體質(zhì)造模相反，即寒體干預(yù)組和常體干預(yù)組喂飼附子理中湯，熱體干預(yù)組喂飼黃連解毒湯，劑量同前，連續(xù)7 d；3個無干預(yù)組無治療措施。每次灌胃2 h后按時間節(jié)點取材。

1.7取材及檢測方法 變應(yīng)性鼻炎模型建立當天為第0天，在第0,1,3,7天分別進行癥狀評分及取材，每次每組6只大鼠，雌雄各半。大鼠拉頸處死后，取完整右側(cè)股骨，洗滌后PBS反復沖洗骨髓腔，經(jīng)洗滌、離心，去除上清液，分離細胞層做流式細胞技術(shù)檢測。骨髓MSCs檢測方法：分別加入CD44-PE、CD45-FITC、CD29一抗震蕩，PBS洗滌重懸后加入APC- Goat Anti-Rabbit二抗孵育，PBS洗滌、震蕩、離心后棄上清液，加PBS 400 μL上流式細胞儀檢測。將檢測到的表面標志物CD29/CD44陽性/CD45陰性的細胞定為骨髓MSCs。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠不同時間點臨床癥狀評分比較 實驗當天，寒體2組臨床癥狀評分均明顯高于熱體2組、常體2組(P均<0.05)，常體2組與熱體2組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。寒、熱、常體無干預(yù)組實驗第1，3，7天臨床癥狀評分與實驗當天比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；寒、熱、常體干預(yù)組實驗第7天臨床癥狀評分均明顯低于實驗當天(P均<0.05)。見表1。

表1 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠不同時間點臨床癥狀評分比較分)

2.2各組大鼠不同時間點骨髓MSCs增殖表達情況比較 寒體干預(yù)組、常體干預(yù)組實驗第1天、第3天、第7天骨髓MSCs增殖表達量均明顯高于同一時間點同體質(zhì)非干預(yù)組(P均<0.05)。熱體干預(yù)組和非干預(yù)組實驗第1天骨髓MSCs增殖表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗第3天、第7天熱體干預(yù)組均明顯高于熱體非干預(yù)組(P均<0.05)。經(jīng)混合效應(yīng)模型分析，非干預(yù)各組骨髓MSCs表達量(對數(shù)轉(zhuǎn)換后)明顯低于干預(yù)各組(P均<0.05)；不同體質(zhì)間比較，熱體組和常體組間骨髓MSCs表達量(對數(shù)轉(zhuǎn)換后)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而寒體組骨髓MSCs表達量(對數(shù)轉(zhuǎn)換后)明顯少于常體組和熱體組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠不同時間點骨髓MSCs增殖情況(取對數(shù)轉(zhuǎn)換后)

2.3各組大鼠骨髓MSCs增殖趨勢 隨著時間的推移，寒、熱、常體無干預(yù)組的骨髓MSCs增殖趨勢整體上呈逐漸減少趨勢；而寒、熱、常體干預(yù)組的骨髓MSCs增殖趨勢整體上呈先減少后增多趨勢。見圖1。

圖1 各組變應(yīng)性鼻炎大鼠不同時間點骨髓MSCs增殖趨勢圖

3 討 論

中醫(yī)體質(zhì)與疾病的相關(guān)性是中醫(yī)體質(zhì)學的關(guān)鍵科學問題之一。體病相關(guān)理論認為，人的體質(zhì)與疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在相關(guān)性，表現(xiàn)為體質(zhì)決定發(fā)病與否及發(fā)病的傾向性，影響疾病的病機和證候性質(zhì)，是預(yù)測疾病預(yù)后的重要依據(jù)。通過研究評價和驗證體質(zhì)與疾病的相關(guān)性，對于中醫(yī)病因?qū)W和治療學發(fā)展具有重要意義[5]，可為實施“治未病”提供方法、工具及評估體系，有助于個體化診療[6]。

變應(yīng)性鼻炎的病因病機是正氣不足，風寒異氣侵襲所致，內(nèi)因主要涉及肺脾氣虛及腎陽的不足，是一個與體質(zhì)相關(guān)性的疾病。研究顯示，變應(yīng)性鼻炎的主要體質(zhì)是陽虛質(zhì)[7]，陽虛則溫煦和氣化功能不足，衛(wèi)外和固密功能不足，導致機體易受外邪的侵襲，如果患者是陽虛質(zhì)，則應(yīng)在辨證論治的基礎(chǔ)上結(jié)合辨體質(zhì)論治，將溫陽之法貫穿治療的全過程，將有助于提高療效[8]。筆者以前的實驗[9]和本次實驗研究均證實，寒體最容易引起變應(yīng)性鼻炎，發(fā)病時癥狀最嚴重，而附子理中湯可以有效持續(xù)地緩解變應(yīng)性鼻炎大鼠的局部癥狀。

骨髓MSCs具有自我復制、多向分化和低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)功能，不僅可以分化替代損傷細胞，還可通過分泌和表達一系列免疫抑制因子，從而影響炎癥的進程，達到調(diào)控炎癥微環(huán)境的目的[10]。有研究表明MSCs可用于治療變應(yīng)性鼻炎[11]，不過機制不明確，可能是MSCs可促進Treg細胞增殖，糾正Th1/Th2免疫失衡。Th1與Th2細胞間的免疫失衡是變應(yīng)性鼻炎發(fā)病的免疫學基礎(chǔ)，兩者通過分泌細胞因子相互調(diào)節(jié)，以維持機體免疫功能的平衡。當機體受到異?？乖碳r，上述平衡被打破，便會引起異常的免疫應(yīng)答[12]，且能誘導產(chǎn)生的Treg細胞在MSCs定植消失后可繼續(xù)控制炎癥反應(yīng)[13-14]。有研究表明，中藥聯(lián)合MSCs治療可降低肥大細胞分泌的組胺和漿細胞分泌的IgE水平，對變應(yīng)性鼻炎小鼠模型有較好的治療作用[15]。從以上研究可知，骨髓MSCs在變應(yīng)性鼻炎中扮演了促進變應(yīng)性鼻炎恢復、調(diào)節(jié)免疫平衡的作用。因此，研究骨髓MSCs增殖在變應(yīng)性鼻炎中的表達規(guī)律就顯得尤為重要。

本實驗觀察了干預(yù)和無干預(yù)狀態(tài)下不同體質(zhì)變應(yīng)性鼻炎大鼠的骨髓MSCs增殖表達規(guī)律，結(jié)果表明體質(zhì)因素和干預(yù)因素對骨髓MSCs的增殖都有影響，也說明骨髓MSCs的增殖可以反映體質(zhì)情況。試驗中，寒、熱、常體無干預(yù)組的骨髓MSCs增殖趨勢整體上呈逐漸減少趨勢，一開始骨髓MSCs增殖最多的是常體組，熱體組次之，寒體組增殖最少，而隨著時間的推移，3組的骨髓MSCs量趨于無差異，說明在不干預(yù)的情況下，隨著病情的持續(xù)，骨髓MSCs增殖越來越趨于較低水平，自然狀態(tài)下機體很難通過調(diào)動骨髓MSCs而達到免疫平衡，而干預(yù)后各組骨髓MSCs量均有增加。本實驗采用體質(zhì)治療干預(yù)方法，即寒體組和常體組用溫陽的附子理中湯，熱體組用清熱的黃連解毒湯治療，結(jié)果顯示附子理中湯能促使常體組、寒體組的骨髓MSCs持續(xù)增殖,黃連解毒湯能促使熱體組的骨髓MSCs增殖，說明體質(zhì)治療能促進骨髓MSCs的增殖。。

綜上所述，骨髓MSCs的增殖能反映變應(yīng)性鼻炎的體質(zhì)情況，最容易發(fā)生變應(yīng)性鼻炎的寒體(陽虛質(zhì))，其骨髓MSCs的增殖最少，而溫陽的附子理中湯可以促進寒體變應(yīng)性鼻炎大鼠的骨髓MSCs增殖，進一步調(diào)節(jié)其免疫功能，從而達到免疫平衡狀態(tài)；其他體質(zhì)治療也可達到相應(yīng)的效果。但附子理中湯或黃連解毒湯對BMSCs的增殖是如何介導變應(yīng)性鼻炎鼻腔黏膜組織的屏障修復和功能恢復的，還需要深入的基礎(chǔ)研究。由于MSCs體外擴增迅速，具有低免疫原性和優(yōu)越的免疫調(diào)節(jié)能力，研究BMSCs的增殖與體質(zhì)及中藥干預(yù)作用的關(guān)系無疑具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。雖然研究仍處于細胞和動物模型試驗階段，但MSCs臨床應(yīng)用將成為細胞療法的未來方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。