趙艷霞，王大紅

（武漢職業(yè)技術學院 生物工程學院，湖北 武漢 430074）

多抗霉素、丙草胺都是廣譜抗生素類生物源農藥，是蔬菜種植中常用的抗菌素[1-5]，對多種真菌性病害具有良好的防治效果。但隨著多抗霉素、丙草胺在蔬菜病蟲害防治上的廣泛應用，由其引起的環(huán)境和食品安全問題日益突顯[6-9]，因此研究多抗霉素、丙草胺在蔬菜中的殘留檢測方法具有十分重要的意義。

目前兩者的分析方法主要有酶聯免疫吸附法[10-12]、氣相色譜法[13]、高效液相色譜法[14-15]和高效液相色譜-串聯質譜法[16-17]等方法。但這些方法存在預處理繁瑣、耗時長等缺點。毛細管電泳-電化學發(fā)光（capillary electrophoresis-electrochemiluminescence，CE-ECL）聯用技術因其具有檢出限低、分離速度快、線性范圍寬等優(yōu)點[18-20]，逐漸成為農藥殘留檢測高效技術之一。目前還未見CE-ECL同時測定多抗霉素和丙草胺的報道。本研究嘗試將毛細管電泳雙重分離機理與電化學發(fā)光的特異性優(yōu)點相結合，開發(fā)蔬菜中多抗霉素和丙草胺殘留同時檢測的方法，并對前處理方法進行優(yōu)化，以期為農產品質量安全檢測提供有效的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

二氯三聯吡啶釕（Ru（bpy）32+）（純度98.0%）、多抗霉素（純度99.8%）、丙草胺（純度99.5%）標準品：購于國家標準物質中心；甲醇（色譜純）：上海麥克林有限公司；實驗用去離子水：由美國Millipore MilLi-Q型超純水機制得超純水，電阻率＞18.2 MΩ·cm；測試樣品（青菜、芹菜等）：市售。

1.2 儀器與設備

MPI-A型毛細管電泳電化學發(fā)光檢測系統(tǒng)：西安瑞邁公司；Agilent1120型高效液相色譜儀：Agilent公司；API 3500 QTrap高效液相色譜-串聯質譜儀：美國AB公司；Trace 1310氣相色譜儀：賽默飛公司；XS204型分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；MX1000型渦旋振蕩儀：杭州瑞誠儀器有限公司；TQ20型超聲波儀：無錫寶得瑞有限公司；DL5Y高速離心機：長沙湘銳離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測電位對發(fā)光強度的影響

檢測電位是CE-ECL實驗條件中一個重要的實驗參數[21]，不同的檢測電位對兩種目標物的電化學發(fā)光強度會產生不同影響。試驗在0.2～1.25 V區(qū)間范圍內施加不同正向電位，考察對兩種目標物電化學發(fā)光曲線強度的影響。

1.3.2 檢測池條件的優(yōu)化

檢測池磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）的濃度以及檢測池緩沖液的pH也是影響電化學發(fā)光強度的重要因素[22]。試驗分別考察PBS濃度在20～55 mmol/L和檢測池緩沖液的pH 6.0～9.5時，對兩種目標物電化學發(fā)光強度的影響。

影響多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度的另一關鍵參數是Ru（bpy）32濃度的選擇[23-24]。作為電化學發(fā)光試劑，Ru（bpy）32濃度影響著電化學發(fā)光的底值和兩種目標物共發(fā)光的強度。較佳的Ru（bpy）32濃度會增加目標物質的響應值，減少干擾。試驗考察了Ru（bpy）32濃度在2～9 mmol/L范圍內對多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度的影響。

1.3.3 標準工作曲線的制作

分別吸取一定質量的多抗霉素和丙草胺標準品，配制成多抗霉素和丙草胺質量濃度分別為0.5 μg/L、5.0 μg/L、50.0 μg/L、100.0 μg/L、500.0 μg/L、1000.0 μg/L的混合標液。將毛細管進樣端插入緩沖液中，施加電泳電壓，啟動電化學發(fā)光分析儀，約10 s后采用電動進樣進行分離檢測，以樣品發(fā)光強度對樣品質量濃度繪制標準工作曲線。

1.3.4 樣品處理

稱取5.0 g樣品置于50 mL具塞離心管中，加入25 mL 甲醇-水提取液渦旋混勻10 min，超聲提取5 min，以4 000 r/min離心5 min，取上清液過WCX柱，1 mL甲醇洗脫，收集后的樣品溶液由去離子水稀釋后經乙酸纖維素濾膜過濾后進樣。

2 結果與分析

2.1 檢測電位對發(fā)光強度的的影響

由圖1可知，不同檢測電位對多抗霉素和丙草胺的電發(fā)光強度影響不同，檢測電位＜0.8 V時，多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度均很弱；檢測電位＞0.8 V后，兩者電化學發(fā)光強度明顯增強，其中檢測電位為1.18 V時，兩者電化學發(fā)光強度最強，丙草胺的電化學發(fā)光強度比多抗霉素高；而高于1.18 V以后兩者電化學發(fā)光強度卻減弱。綜合考慮，選擇1.18 V作為檢測多抗霉素和丙草胺的最佳檢測電位。

圖1 多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光曲線Fig.1 Electrochemiluminescence curves of polyxins and pretilachlor

2.2 檢測池條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測池中PBS濃度和pH的優(yōu)化

由圖2可知，當PBS溶液濃度較低時，離子強度也小，電化學反應受到抑制，多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光強度較弱；PBS溶液濃度越大，多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光強度越強，當PBS溶液濃度為35 mmol/L時，多抗霉素和丙草胺的電化學強度最強，分別為1 802 mIU/L和1 390 mIU/L，故選擇35 mmol/L為最佳檢測緩沖溶液濃度。

圖2 磷酸鹽緩沖液濃度對多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度的影響Fig.2 Effect of phosphate buffer solution concentration on the electrochemiluminescence intensity of polyxins and pretilachlor

由圖3可知，在pH 6.0～8.0的范圍內，發(fā)現多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光強度隨著pH增大而增大；pH8.0時多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光強度最強，分別為1 950 mIU/L和1 630 mIU/L；當pH超過8.0時，兩者的電化學發(fā)光強度隨著pH增大而減小，因此選擇pH8.0為最佳的檢測池緩沖液pH。

圖3 檢測池緩沖液pH值對多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度的影響Fig.3 Effect of pH of buffer solution in detection tank on the electrochemiluminescence intensity of polyoxins and pretilachlor

2.2.2 Ru（bpy）32濃度的優(yōu)化

由圖4可知，在Ru（bpy）32濃度為2～6 mmol/L范圍內，多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光強度隨著Ru（bpy）32濃度升高而升高，且基線穩(wěn)定，峰形良好；Ru（bpy）32濃度為6 mmol/L時，多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光強度最強，分別為1 960 mIU/L和1 780 mIU/L；當Ru（bpy）32濃度超過6 mmol/L時，雖然多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度有所增強，但是背景信號和基線噪音也隨之增加。綜合考慮各因素，選擇Ru（bpy）32濃度為6 mmol/L。

圖4 二氯三聯吡啶釕濃度對多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度的影響Fig.4 Effect of Ru(bpy)32 concentration on the electrochemiluminescence intensity of polyoxins and pretilachlor

2.3 標準曲線的制作

在最佳的條件下，采用CE-ECL對多抗霉素和丙草胺混合標準溶液進行了分離檢測，兩者的電化學發(fā)光曲線如圖5所示。

圖5 多抗霉素和丙草胺的毛細管電泳-電化學發(fā)光曲線Fig.5 Capillary electrophoresis-electrochemiluminescence curves of polyoxins and pretilachlor

多抗霉素和丙草胺兩者的線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限見表1。由表1可知，多抗霉素和丙草胺兩者的線性范圍為0.5～1 000.0 μg/L，線性回歸方程分別為Y=635.6X-11.2和Y=854.2X+67.8，相關系數（R2）分別為0.999 6、0.999 5，檢出限分別為0.05 μg/L、0.01 μg/L，定量限分別為0.20 μg/L、0.05 μg/L。

表1 多抗霉素和丙草胺的線性范圍、線性回歸方程、相關系數、檢出限與定量限Table 1 Linear range,linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantitative limit of polyoxins and pretilachlor

用CE-ECL檢測多抗霉素和丙草胺的檢測結果與用高效液相色譜法和其他方法檢測多抗霉素和丙草胺結果的比較見表2。從表2可見，與其他方法相比，采用CE-ECL方法檢測多抗霉素和丙草胺顯示出更高的靈敏度與較寬的線性范圍。

表2 檢測結果與其他方法的比較Table 2 Comparison between the results of the method and other methods

2.4 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.4.1 不同濃度甲醇溶液提取效果

以青菜樣品為實驗對象并添加多抗霉素和丙草胺的混標溶液，對不同含量（5%、10%、20%、30%、40%、50%）的甲醇水溶液作提取劑進行試驗，結果見圖6。

圖6 不同含量提取劑對多抗霉素和丙草胺電化學發(fā)光強度的影響Fig.6 Effect of different concentrations of extractant on the electrochemiluminescence intensity of polyoxins and pretilachlor

由圖6可知，隨著甲醇含量的增加，提取液中多抗霉素和丙草胺的電化學發(fā)光強度呈現先增加后下降的趨勢，在以30%甲醇作為提取溶液時兩者的電化學發(fā)光強度最高，分別為2 197 mIU/L和2 096 mIU/L；其他含量的甲醇溶液為提取劑時，組分含量分別有不同程度的降幅。

2.4.2 樣品稀釋液的選擇

由于樣品溶液進行分析前要進行前處理，用稀釋液定容，因此稀釋液的選擇也會對兩種目標物的電化學發(fā)光強度有影響。本實驗分別用去離子水和PBS溶液對樣品溶液稀釋配成檢測溶液，電動進樣后分析比較。結果表明，去離子水稀釋的樣品溶液的電化學發(fā)光強度較強，且遠大于用PBS溶液稀釋的樣品溶液的ECL發(fā)光強度。故選擇去離子水作為稀釋液來配比檢測溶液。

2.5 加標回收

以未檢出多抗霉素和丙草胺殘留的青菜樣品為基質，分別加入0.001 mg/L、0.010 mg/L、0.100 mg/L質量濃度的混合標液，進行加標回收實驗。對樣品每一濃度進行重復5次檢測，加標回收率結果見表3。由表3可知，加標回收率在86.5%～103.1%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為3.6%～5.2%，表明該方法能滿足殘留分析的要求。

表3 方法的回收率及相對標準偏差Table 3 Recovery rates and relative standard deviation of the method

3 結論

本研究利用毛細管電泳-電化學發(fā)光聯用法，通過對檢測電位的選擇、檢測條件的優(yōu)化，以及樣品提取液、稀釋液的比較，建立了同時檢測蔬菜中多抗霉素和丙草胺殘留的方法。結果表明，在1.18 V檢測電位、PBS溶液濃度為35 mmol/L、檢測池緩沖液pH 8.0和6 mmol/L Ru（bpy）32+的條件下，兩種目標組分能在0.5～1 000 μg/mL范圍內均具有良好的線性關系，檢出限范圍為0.01～0.05 μg/L，定量限范圍為0.05～0.20 μg/L。樣品加入30%甲醇醇提取后經WCX柱凈化富集后，用去離子水稀釋樣品液進行檢測。樣品的加標回收率能達到86.5%～103.1%，相對標準偏差（RSD）為3.6%～5.2%，所建立的方法能準確快速有效地檢測蔬菜中的多抗霉素和丙草胺殘留量，可為此類的分析和監(jiān)控提供技術支持。