李秀麗,董志民,田向?qū)W,任衛(wèi)科，燕曉翠,李富強,張 莉,鄢明華*

(1.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術天津科學觀測實驗站，天津 300381；3.天津市寧河區(qū)蘆臺第一中學，天津 301500)

豬葡萄球菌(Staphylococcushyicus)是仔豬滲出性皮炎的主要病原，感染后可引起仔豬發(fā)熱、脫水、消瘦和死亡。病豬皮膚發(fā)紅、潰瘍、油性結(jié)痂，呈典型滲出性、濕疹性皮炎病變。豬滲出性皮炎俗稱“油皮病”，哺乳仔豬對該病最易感，斷奶仔豬也可發(fā)病。該病一年四季均可發(fā)生，但溫暖潮濕的夏、秋季節(jié)多發(fā)。臨床上以接觸傳播為主，病豬發(fā)病率為10%～90%，病死率可達70%以上，病程較長的存活仔豬生長緩慢，嚴重者成為僵豬，給豬場造成較為嚴重的經(jīng)濟損失[1-3]。該病在全球分布較廣，丹麥、德國、俄羅斯和日本等許多國家均有該病發(fā)生的報道[2-5]。

在我國，鄧朝陽等[6]報道了廣西某豬場發(fā)生的仔豬滲出性皮炎及其治療情況；殷鳳斌等[7]報道黑龍江省齊齊哈爾市發(fā)生了豬滲出性皮炎臨床病例；睢艷平等[8]、段曉軍等[9]分別報道在北京和河北省永清縣發(fā)現(xiàn)了該??；段玉鵬等[10]報道寧夏海原縣某豬場發(fā)生仔豬葡萄球菌病。李艷等[11]從廣東增城某豬場分離鑒定了1株豬葡萄球菌強毒株，并對其致病性和耐藥特性進行了研究；徐國等[12]、陳亞強[13]分別報道貴州省和重慶市發(fā)生了仔豬滲出性皮炎。以上研究顯示，該病已廣泛分布于我國華南、東北、華北和西南等地區(qū)。在臨床案例中，雖然該病以散發(fā)為主，但對于發(fā)病豬場而言，由于藥物治療效果較差且病死率和淘汰率很高，往往造成較大的經(jīng)濟損失，其危害不容忽視。

本試驗從河北省秦皇島市某豬場具有典型皮炎癥狀的發(fā)病仔豬體內(nèi)分離到1株病原菌，經(jīng)培養(yǎng)特征、生化特性和16S rRNA的檢測與分析，確定為豬葡萄球菌。進一步對該分離株進行了耐藥性、致病力和脫落毒素基因的測定，為深入開展仔豬滲出性皮炎的防治研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病料來源病料取自2017年河北省秦皇島某豬場具有皮炎癥狀8日齡哺乳仔豬。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基哥倫比亞血瓊脂平板，購自比克曼生物科技有限公司；THB培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術有限公司；Gibico胎牛血清，購自上海覓拓生物科技有限公司；葡萄球菌屬微量生化鑒定管，購自杭州天和微生物試劑有限公司；藥敏紙片，購于杭州濱和微生物試劑有限公司；DNA提取試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 試驗動物6周齡BALB/c小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。杜洛克×長白×大白三元8日齡健康哺乳仔豬，購自天津某豬場，試驗前用一次性無菌棉簽在仔豬耳后與后腿內(nèi)側(cè)部位的皮膚分別取樣進行細菌分離，分離菌經(jīng)16S rRNA基因測序鑒定均為豬葡萄球菌陰性。仔豬人工飼喂不含抗生素的奶粉，置于26～28℃環(huán)境中飼養(yǎng)，適應環(huán)境3 d后開始試驗。

1.4 病原菌分離及形態(tài)學觀察無菌采集具有皮炎癥狀病豬的肝臟、肺臟及病變皮膚，接種哥倫比亞鮮血平板，37℃靜置培養(yǎng)18 h，觀察并挑選形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進行革蘭染色、鏡檢。

1.5 生化特性鑒定將分離純化的細菌接種于普通瓊脂平板及哥倫比亞血瓊脂平板，觀察菌落是否產(chǎn)生色素及溶血情況。同時挑取菌落進行觸酶試驗，并接種葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、乳糖、七葉苷、甘露醇等微量生化鑒定管，37℃培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計試驗結(jié)果。

1.6 16S rRNA基因擴增及測序參考文獻[14]委托北京六合華大生物科技有限公司合成細菌16S rRNA 基因通用引物(上游引物P1：AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG；下游引物P2：AAGGAGGTGATCCAGCC。退火溫度為60℃，產(chǎn)物大小為1 411 bp)。用DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為模板，以16S rRNA通用引物進行PCR擴增，反應體系為20 μL：模板0.5 μL，P1、P2各0.5 μL，LA Taq酶10 μL，高壓滅菌水8.5 μL。反應條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 7 min，16℃終止反應。將陽性產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測序，并將結(jié)果用BLAST進行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行遺傳進化分析。

1.7 體外生長曲線測定將分離菌株(菌落總數(shù)為0.5×108CFU/mL)按1%量接種至150 mL THB培養(yǎng)液中，混勻后分裝(5 mL/管)，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)30 h，每隔2 h取出2支試管，做好標記，保存于4℃。對所有時間點樣品一起進行菌落計數(shù)，繪制生長曲線。

1.8 耐藥性測定分離株藥敏試驗參照美國臨床和實驗室標準化委員會標準(CLSI2013)推薦的紙片擴散法進行，判定其對測試藥物敏感性。

1.9 致病性試驗

1.9.1菌液制備 將試驗菌株液體培養(yǎng)物按1%量接種于THB培養(yǎng)液(含5% Gibico胎牛血清)，37℃振蕩培養(yǎng)7 h至對數(shù)生長期，3 500 r/min離心15 min，棄上清，用無菌THB洗滌菌落沉淀2次，然后進行菌落計數(shù)，根據(jù)計數(shù)結(jié)果調(diào)整菌液濃度至1×109CFU/mL備用。

1.9.2小鼠致病性試驗 將10只6周齡BALB/c小鼠隨機分為2組，每組5只，第1組每只腹部皮下注射1×109CFU/mL的分離株菌液，0.5 mL/只；第2組皮下注射相同劑量THB稀釋液作為對照。試驗周期14 d，每天觀察、記錄小鼠臨床癥狀，出現(xiàn)癥狀的小鼠取皮膚樣品進行細菌分離鑒定。

1.9.3仔豬致病性試驗 將7頭12日齡健康仔豬隨機分成2組，試驗組5頭，于耳后、腹部皮下分點注射1×109CFU/mL的試驗菌株菌液，1.0 mL/頭。對照組2頭，每頭接種相同劑量的THB稀釋液。攻菌后逐日觀察仔豬臨床癥狀，7 d后剖殺出現(xiàn)典型癥狀的仔豬，觀察并記錄各臟器組織病變情況。采集肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及皮膚進行細菌分離，同時用4%中性甲醛溶液將組織固定24 h，依次進行石蠟包埋、HE染色，顯微鏡觀察病變。

1.10 脫落毒素基因檢測參考文獻[15-16]報道的6種葡萄球菌表皮脫落毒素基因(ExhA、ExhB、ExhC、ExhD及ShetA、ShetB)的擴增引物(表1)，由北京六合華大生物科技有限公司進行合成。提取試驗菌株基因組DNA，采用PCR方法檢測豬葡萄球菌攜帶的脫落毒素基因。

表1 葡萄球菌脫落毒素基因引物序列、產(chǎn)物長度及退火溫度

2 結(jié)果

2.1 細菌分離及生化鑒定結(jié)果豬場送檢病豬肺臟、肝臟及病變皮膚均分離到白色、光滑、圓形、中等大小菌落，革蘭染色鏡檢可見藍紫色、球形細菌，多呈葡萄串狀分布。該分離菌株不產(chǎn)生色素、不溶血，觸酶陽性，能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和七葉苷，不能分解麥芽糖和甘露醇。

2.2 16S rRNA 的PCR擴增及序列分析分離菌株的基因組DNA進行PCR擴增后獲得了1條特異性條帶，與預期大小(1 411 bp)相符，陰性對照無條帶(圖1)。擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后進行核苷酸序列比對分析，發(fā)現(xiàn)該基因與GenBank中發(fā)布的豬葡萄球菌16S rRNA基因的同源性為99.86%～100.00%(圖2)。因此，判定該菌株為豬葡萄球菌，并命名為437-2株。應用MEGA 7.0軟件對437-2菌株與GenBank中發(fā)布的豬葡萄球菌的遺傳進化關系進一步進行分析，結(jié)果顯示437-2菌株與豬葡萄球菌NCTC10350、ATCC11249、D.Sompolinsky No.1和3RMW21等4個菌株同處一個分支，表明他們之間的進化關系較近，而與2012年天津分離的豬葡萄球菌Z371株的遺傳距離相對較遠(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；1.疑似豬葡萄球菌分離株樣品；2.陰性對照

1.MK015776.1，阿涅蒂斯葡萄球菌PL439 2019年荷蘭分離株；2.CP045927.1，阿涅蒂斯葡萄球菌1379 2020年美國分離株；3.CP031266.1，阿涅蒂斯葡萄球菌12B 2019年巴西分離株；4.CP009623.1，阿涅蒂斯葡萄球菌908 2020年美國分離株；5.MH393510.1，阿涅蒂斯葡萄球菌Fop 193 2018年印度分離株；6.MF678861.1，阿涅蒂斯葡萄球菌DSM 23656 2019年荷蘭分離株；7.JN644511.1,阿涅蒂斯葡萄球菌JB2_A 2011年印度分離株；8.JN64449.1，阿涅蒂斯葡萄球菌BB17 2011年印度分離株；9.KC212040.1,豬葡萄球菌Z371 2012年中國天津分離株；10.LS483304.1,豬葡萄球菌NCTC10350 2018年英國分離株；11.MF678885.1,豬葡萄球菌PCM 2192 2019年荷蘭分離株；12.MK954145.1,葡萄球菌S5 2013年印度分離株；13.CP008747.1,豬葡萄球菌ATCC11249 2014年美國分離株；14.NR_036905.1,豬葡萄球菌D.Sompolinsky No.1 2010年美國分離株；15.437-2,豬葡萄球菌2017年中國天津分離株；16.KJ783382.1,豬葡萄球菌3RMW21 2014年美國分離株

2.3 體外生長曲線測定結(jié)果437-2株接種THB培養(yǎng)液2 h內(nèi)未見明顯增長，此時細菌基本處于靜止期。接種后4 h，細菌含量迅速上升，6 h達到對數(shù)生長期，10 h之后增殖速度放緩，進入平臺期，至20 h達到峰值2.1×109CFU/mL。此后細菌含量緩慢下降，至32 h細菌含量仍然維持在9.7×107CFU/mL。生長曲線見圖3。

圖3 437-2株體外培養(yǎng)生長曲線

2.4 耐藥性測定結(jié)果試驗結(jié)果表明，437-2株對14種臨床常用抗生素中的痢菌凈、氟苯尼考、頭孢曲松鈉、阿米卡星高度敏感(判定標準參考CLSI2013)，但對其他8種藥物均表現(xiàn)有不同程度的耐藥性，抑菌圈直徑見表2。

表2 豬葡萄球菌437-2株對常用抗生素的藥敏試驗結(jié)果

2.5 小鼠致病性試驗用0.5×109CFU/mL的437-2株接種BALB/c小鼠后7 d，試驗組5只小鼠均發(fā)病，表現(xiàn)為接種部位皮膚有炎性滲出物分泌，周圍被毛有脫落，出現(xiàn)硬痂(圖4)；攻菌后14 d，炎癥滲出物增多。用棉簽在傷口擦拭采集樣品進行細菌分離，可分離到葡萄球菌，經(jīng)16S rRNA的PCR擴增和序列分析，結(jié)合細菌形態(tài)和生化特性，鑒定為豬葡萄球菌。

圖4 437-2株感染BALB/c小鼠后接種部位出現(xiàn)硬痂、分泌物增多

2.6 哺乳仔豬致病性試驗攻菌仔豬于接種后2 d發(fā)病，注射部位出現(xiàn)表皮脫落、發(fā)紅、破潰和有炎性滲出,后期破潰處結(jié)黃色的硬痂(圖5A)。眼圈周圍皮膚發(fā)紅，眼角有白色分泌物；攻菌后3～5 d仔豬食欲減退，迅速消瘦(圖5B)，毛少的部位(耳朵、腹部)開始出現(xiàn)紅斑和黃褐色硬痂(圖5C)；攻菌后6～7 d仔豬全身皮膚發(fā)紺，痂皮變硬變厚，1頭死亡。剖殺其余4頭存活試驗仔豬，可見腹股溝淋巴結(jié)腫大，肝臟、脾臟、肺臟均未見明顯病變。將病變處皮膚及肝臟、脾臟、肺臟、腎臟接種哥倫比亞血瓊脂平板，均分離到葡萄球菌。取病變皮膚進行病理學染色觀察，可見局部角質(zhì)層角化過度，表皮棘層顯著增厚，真皮彌漫性炎癥細胞浸潤，纖維組織增生且明顯增厚(圖5D)；有些部位整個皮膚組織表皮完全消失，可見潰瘍性炎癥病變深達真皮，充滿大量炎癥細胞及壞死組織(圖5E)。對照組試驗豬無任何臨床表現(xiàn)，剖殺后無菌采集仔豬組織臟器和皮膚樣品均未分離到細菌。

A.攻菌豬耳后注射部位出現(xiàn)表皮脫落、發(fā)紅、黃色痂皮；B.攻菌仔豬消瘦；C.攻菌豬腹部出現(xiàn)紅斑和黃褐色硬痂；D.表皮棘層顯著增厚，真皮彌漫性炎癥細胞浸潤(100×)；E.皮膚組織表皮完全消失(100×)

2.7 脫落毒素基因檢測應用PCR方法檢測437-2株攜帶的脫落毒素相關基因并測序，結(jié)果顯示該菌株攜帶ExhD和ShetA基因(圖6)。ExhA、ExhB、ExhC和ShetB基因的檢測結(jié)果為陰性。將測序獲得的ExhD和ShetA基因的核苷酸序列分別BLAST比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ShetA基因的核苷酸序列與GenBank中報道的該基因的核苷酸序列同源性為95.89%～100.00%(圖7)，ExhD基因的同源性為96.73%(圖8)。

M.DL2000 DNA Marker；1～12.ShetB陰性、ShetB、ShetA陰性、ShetA、ExhD陰性、ExhD、ExhC陰性、ExhC、ExhB、ExhB陰性、ExhA、ExhA陰性；陰性對照均以高壓滅菌后的去離子水為模板

1.437-2，豬葡萄球菌2017年天津分離株；2.AB036768.1，豬葡萄球菌2000年日本分離株；3.CP031266.1，葡萄球菌2018年巴西分離株,4.CP045927.1，葡萄球菌2019年美國分離株；5.MF399264.1，豬葡萄球菌2017年印度分離株；6.MF383339.1，豬葡萄球菌2017年印度分離株,7.AM901042.1，豬葡萄球菌2007年德國分離株；8.CP008747.1，豬葡萄球菌2014年美國分離株；9.LS483304.1，豬葡萄球菌2018年英國分離株

1.437-2，豬葡萄球菌2017年天津分離株；2.AF515456.1，豬葡萄球菌2002年丹麥分離株；3.AM946621.1，豬葡萄球菌2016年德國分離株；4.AM950188.1，豬葡萄球菌2016年德國分離株；5.JQ728532.1，豬葡萄球菌GC 2012年中國分離株；6.JQ728534.1,豬葡萄球菌HZ-2 2012年中國分離株；7.MF399267.1,豬葡萄球菌2017年印度分離株ExhB基因部分序列；8.JQ728529.1,豬葡萄球菌ZQ-3 2012年中國分離株； 9.JQ728530.1,豬葡萄球菌ZC-2 2012年中國分離株；10.AB036768.1，豬葡萄球菌2000年日本分離株

3 討論

研究表明，豬葡萄球菌接種仔豬后可引起發(fā)病甚至死亡。張曦等[17]報道，健康仔豬皮下分點注射5 mL豬葡萄球菌分離株液體培養(yǎng)物，試驗豬在10 d內(nèi)全部發(fā)病和死亡。李艷等[11]認為，用廣東分離株ZC-4株進行攻毒，3×109CFU/mL頸部肌肉注射3 mL，攻菌48 h后，5頭25日齡健康仔豬全部發(fā)病，病豬表現(xiàn)鼻鏡、耳朵、背部、臀部皮膚形成厚厚的結(jié)痂，腹部皮膚脫落部位形成黃色結(jié)痂，消瘦等癥狀；5 d后試驗仔豬全部死亡。本試驗結(jié)果顯示，豬葡萄球菌437-2株對哺乳仔豬具有較強的致病性。當接種劑量為1×109CFU/頭時，8日齡健康哺乳仔豬的發(fā)病率為100%，且表現(xiàn)出典型的皮炎癥狀及病程，試驗豬病死率為20.0%(1/5)，從病、死豬病變處皮膚及肝臟、脾臟、肺臟、腎臟分離到豬葡萄球菌，證實437-2株可引起仔豬滲出性皮炎。

小鼠因體型小、飼養(yǎng)方便、成本低、省時省力等原因，常用作動物疫病病原的人工模型動物。國內(nèi)外研究表明，多個品系的小鼠均對豬葡萄球菌敏感。楊彩娟等[18]用豬葡萄球菌GZ1株經(jīng)肌肉注射感染裸鼠和BALB/c小鼠，結(jié)果表明兩者均可感染，其中BALB/c鼠更為敏感，感染2～3 d后死亡，死亡前一般無明顯的眼觀病變；裸鼠的敏感性相對較低，于接種細菌后2～3 d，面部和背部皮膚出現(xiàn)大量紅色囊泡，有些地方的皮膚會有炎性滲出，隨著病程的延長，皮膚出現(xiàn)糜爛、結(jié)痂等。本試驗用豬葡萄球菌437-2株接種BALB/c小鼠，結(jié)果顯示接種劑量為0.5×109CFU/只 時，小鼠發(fā)病率為100%，臨床表現(xiàn)為接種部位的皮膚分泌大量炎性滲出物，周圍被毛脫落、結(jié)痂。再次證實BALB/c小鼠可以作為豬葡萄球菌的模型動物。

脫落毒素是豬葡萄球菌感染后引起豬滲出性皮炎的主要毒力因子之一，能否產(chǎn)生脫落毒素，通常作為判定豬葡萄球菌是否有毒力的重要指標[19]。迄今，已有2種類型 6 種脫落毒素被證實，第1種類型是丹麥學者ANDRESEN等[20]鑒定的 Exh 型，包括 A、B、C 和 D 等4 種；第2種類型是日本學者SATO等[21]鑒定的SHET型，分為 A 和 B等2種。FUDABA等[22]對豬葡萄球菌的脫落毒素進行了克隆和表達，并將ExhA、ExhB、ExhC、ExhD和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的 SHETA 和 SHETB分別注入豬體內(nèi),結(jié)果所有毒素均可引起表皮生成大水皰和結(jié)痂。研究還發(fā)現(xiàn),豬葡萄球菌脫落毒素可選擇性消化橋粒蛋白(desmoglein,Dsg)，當正常的豬表皮細胞被脫落毒素感染的時候，覆蓋在細胞表面的Dsg被完全消化，引起仔豬皮膚上出現(xiàn)與滲出性皮炎相類似的病變,純化的脫落毒素可使表皮中的細胞分離，有助于細菌在表皮中快速擴散，造成皮膚脫落并產(chǎn)生大量皮脂分泌物和漿液分泌物[23]。研究表明，不同國家和地區(qū)脫落毒素的類型和不同脫落毒素的檢出率存在差異，其中俄羅斯分離的菌株以分泌ExhD為主，德國分離株以分泌ExhC和ExhD為主，而日本學者對38 個豬場的 424 頭豬的豬葡萄球菌外毒素蛋白的檢測結(jié)果表明，該國的流行株主要產(chǎn)生ExhA型脫落毒素[24]。在我國，陳亞強等[13]應用多重PCR檢測方法對廣東省9株豬葡萄球菌的脫落毒素進行檢測，其中6株產(chǎn)生ExhA、ExhC和ShetA。岑靜等[25]對湖南省岳陽市2個規(guī)?；i場分離的29株含脫落毒素基因的葡萄球菌的檢測結(jié)果顯示，A 場可檢出ExhA、ExhC、ExhD和ShetA，B 場可檢出ExhA、ExhD和ShetA，其中ShetA的檢出率在 2 個豬場中均為最高。本研究對437-2株攜帶的6種脫落毒素相關基因進行檢測并測序，結(jié)果顯示該菌株攜帶ExhD和ShetA基因，表明我國不同地區(qū)豬葡萄球菌流行株攜帶的脫落毒素基因類型存在差異，但ShetA分布范圍較廣。

根據(jù)藥敏試驗結(jié)果篩選敏感藥物用于指導豬場臨床用藥，可以提高用藥的針對性和治療效果，已被養(yǎng)殖戶普遍接受。本試驗結(jié)果顯示437-2株對痢菌凈、氟苯尼考(氟樂泰)、頭孢曲松鈉、阿米卡星等藥物高度敏感，這幾類藥物可作為豬場預防和治療該病的候選藥物。值得注意的是，該菌株對14種獸醫(yī)臨床常用藥物中的8種藥物均具有不同程度的耐藥性，提示養(yǎng)殖戶應科學選擇藥物用于該病的防治，避免盲目用藥。