游敏芳，廖朝美，吳磊，張依裕*，劉若余，蔣會梅，張義玲，向程舉，楊遠清

(1. 貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué)貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3. 貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；4. 畢節(jié)市畜禽遺傳資源管理站，貴州 畢節(jié) 551700)

分泌型卷曲相關(guān)蛋白-5(secreted frizzled-related protein 5, SFRP5)屬于SFRP家族成員，它是脂肪組織分泌的一種炎癥反應(yīng)脂肪因子和Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的拮抗物，還參與胚胎發(fā)育、炎癥發(fā)生和免疫等多種生物學(xué)過程[1-2]。SFRP5含有與卷曲半胱氨酸結(jié)構(gòu)域同源性的類網(wǎng)肽功能域和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，是參與膜卷曲受體競爭的核心區(qū)[3]。小鼠白色脂肪組織信號通路中，SFRP5介導(dǎo)表觀遺傳沉默可能強化脂肪生成，增加對飲食誘導(dǎo)肥胖的易感性[4]。SFRP5能抑制慢性炎癥，提高胰島素敏感性，強化其作為2型糖尿病(T2DM)的一個風(fēng)險因子以及在維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪組織中SFRP5-Wnt5a調(diào)節(jié)軸可能是調(diào)控脂質(zhì)代謝紊亂的一個靶標(biāo)，SFRP5能夠調(diào)控Wnt5a信號的穩(wěn)定，在慢性輕度炎癥中，SFRP5對Wnt5a表現(xiàn)出中和作用[6]。SFRP5能夠加強脂肪細胞脂質(zhì)的累積[7]，肥胖小鼠和人類脂肪組織中SFRP5表達水平升高，在白色脂肪細胞和棕色脂肪細胞分化過程中，SFRP5緩慢誘導(dǎo)表達，成熟脂肪細胞中表達水平最高[8]。SFRP5表達缺乏的小鼠將發(fā)生嚴重的巨噬細胞浸潤，引起葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗以及炎癥性脂肪組織[9]。然而，關(guān)于SFRP5對肥胖影響在不同研究中存在著爭議。Hu等[10]報道肥胖者的SFRP5表達水平低于非肥胖者，且與肥胖指標(biāo)體質(zhì)指數(shù)(BMI)、腰臀比(WHR)、體脂率和血脂相關(guān)。Schulte等[11]指出在肥胖和瘦弱人群中SFRP5表達變化明顯。盡管SFRP5在人類和嚙齒類動物上的研究廣泛，但有關(guān)SFRP5在家禽中的生物學(xué)功能研究極為缺乏。Li等[12]研究顯示，SFRP5基因mRNA表達水平與藏雞(Gallus gallus domesticus)肌肉脂肪密切相關(guān)。本試驗選用的長順綠殼蛋雞已成為國家級畜禽遺傳資源保護的地方家禽，也是全國唯一國家級綠殼蛋雞地方保護品種，因其在貴州的特定自然生態(tài)壞境下，經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育，具有抗病力強、耐粗飼等特點，是肉蛋兼用型雞品質(zhì)。潘周雄等[13]對20只長順綠殼蛋雞公雞和20只母雞進行屠宰性能測定，結(jié)果顯示胸肌的占比分別為16.07%、17.79%，且雞胸肉因其肉質(zhì)細嫩，含有較高的蛋白質(zhì)含量，容易被人體消化吸收等特點而被人們喜愛。覃媛鈺等[14]在SFRP5 基因外顯子3上發(fā)現(xiàn)2個突變位點，且結(jié)果顯示SFRP5 基因的遺傳變異能影響長順綠殼蛋雞胸肌脂肪沉積，然而有關(guān)長順綠殼蛋雞SFRP5 基因外顯子1上的遺傳變異對其胸肌常規(guī)肌肉品質(zhì)的影響的研究較為鮮見，使用本試驗以長順綠殼蛋雞為材料，檢測SFRP5基因外顯子1的SNPs位點，探討其對長順綠殼蛋雞胸部肌肉品質(zhì)的調(diào)控效應(yīng)，為進一步深入研究SFRP5基因在家禽中的分子效應(yīng)機理提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

同批出雛的200只長順綠殼蛋雞母雞飼養(yǎng)于貴州大學(xué)科研雞場，按照1994年NRC頒布的雞營養(yǎng)需要和第28版《中國飼料成分及營養(yǎng)價值表》配制日糧，飼養(yǎng)管理條件一致的條件下飼養(yǎng)至120日齡，淘汰不健康的個體后，隨機抽取165只進行屠宰，取胸肌2份，一份用于基因組DNA提取，一份用于肉質(zhì)測定。動物組織基因組DNA提取試劑盒購自大連TaKaRa公司，離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司， PCR Master Mix、無水乙醇、瓊脂糖、PCR管等常規(guī)試劑及耗材均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)測定

對采取的胸肌于45 min內(nèi)完成肉質(zhì)指標(biāo)的預(yù)處理，按照《豬肌肉品質(zhì)測定技術(shù)規(guī)范》(NY/T821—2004)測定長順綠殼蛋雞胸肌常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)pH值、嫩度、蒸煮損失、失水率和粗脂肪含量。

1.3 DNA提取、引物設(shè)計和PCR擴增

按照動物組織基因組DNA提取試劑盒抽提肌肉中基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合核酸濃度測定儀進行檢測，稀釋成終濃度100 ng/μL備用。根據(jù)雞SFRP5基因序列(NC_006093.5)設(shè)計擴增外顯子1的特異引物，F(xiàn)：5′-CAGCAGCCAGAGCAGATTG-3′，R：5′-CGGTGCTTGTCCCACTTAC-3′，擴增區(qū)域位于基因組g.23251540-23252193。20 μL的PCR反應(yīng)體系：PCR Master Mix 8.0 μL，RNase-Free Water 9 μL，10 μmol/L正、反向引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃ 變性30 s，58.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸8 min，10 ℃保存。

1.4 SNPs鑒定

采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，采用DNAStar軟件MegAlign程序結(jié)合測序峰圖篩查鑒定SNP位點。

1.5 統(tǒng)計分析

運用SHEsis網(wǎng)上在線軟件(http://analysis.bio-x.cn/)計算SNP位點的基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值(χ2)、連鎖不平衡的D′值和r2值；PopGen32 V1.31軟件計算觀察雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)；SPSS 19.0軟件中的廣義線性模型(GLM)分析SNP位點基因型或雙倍型與所測定性狀指標(biāo)的相關(guān)性，模型為Y=μ+G+H+e，Y為性狀觀測值；G為基因型效應(yīng)；H為雙倍型效應(yīng)；μ為群體均值；e為隨機殘差，最小顯著性差異法(LSD)多重比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 SNPs篩查與鑒定

對PCR產(chǎn)物進行直接測序，序列比對結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，共發(fā)現(xiàn)3個SNP變異位點：g.23251706 C>T、g.23251882 C>T和g.23252056 C>T，均處于SFRP5基因外顯子1的CDS區(qū)；通過蛋白翻譯分析結(jié)果表明，3個SNP位點均未能導(dǎo)致編碼的氨基酸發(fā)現(xiàn)改變，均為同義突變。

圖1 序列比對峰圖

2.2 SNPs的遺傳特性分析

對SFRP5基因外顯子1的3個SNP位點在長順綠殼蛋雞群體中的遺傳信息進行分析，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，g.23251706 C>T位點的屬于低度多態(tài)位點，而g.23251882 C>T和g.23252056 C>T位點則為中度多態(tài)位點，3個位點的等位基因C和基因型CC均處于優(yōu)勢地位，等位基因C的頻率均大于0.780，基因型CC的頻率均大于0.640，基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果表明3個SNP位點的基因型分布均未偏離平衡狀態(tài)(P>0.05)，揭示3個SNP位點未受到突變、選擇、遺傳漂變等的影響，或者是受到影響而由于長期的人工選擇并進行大規(guī)模擴群后又重新處于一種新的平衡狀態(tài)。

表1 長順綠殼蛋雞SFRP5基因外顯子1的SNP位點群體遺傳信息分析

2.3 SNPs連鎖不平衡、單倍型和雙倍型分析

對長順綠殼蛋雞SFRP5基因外顯子1中發(fā)現(xiàn)的3個SNP位點進行連鎖不平衡分析，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，3個SNP位點之間的D′值處于0.994～0.999之間，大于0.800；r2值處于0.033～0.060之間，小于0.330。根據(jù)Ardlie等[15]和Slatkin[16]的報道，當(dāng)|D′|>0.8和r2>0.33時認為SNPs位點間存在強連鎖不平衡，揭示了本研究發(fā)現(xiàn)的3個SNP位點間不存在強連鎖不平衡。

對3個SNP位點進行單倍型和雙倍型分析，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，SFRP5基因外顯子1中發(fā)現(xiàn)的3個SNP位點長順綠殼蛋雞群體中共檢測到4種單倍型和10種雙倍型，單倍型H1的頻率最高，其頻率為0.473，為優(yōu)勢單倍型，H4的頻率最低，其頻率為0.133，為劣勢單倍型；雙倍型H1H1的頻率最高，為0.285，為優(yōu)勢單倍型，H4H4的頻率最低，為0.036，為劣勢雙倍型。

表2 SFRP5基因外顯子1的SNPs連鎖不平衡分析

表3 長順綠殼蛋雞SFRP5基因外顯子1的SNPs的單倍型和雙倍型分析

2.4 SNPs與胸肌常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

對長順綠殼蛋雞SFRP5基因外顯子1中發(fā)現(xiàn)的3個SNP位點與胸肌常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)進行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果從表4可知，g.23251706C>T位點對長順綠殼蛋雞胸肌蒸煮損失的影響達到顯著水平(P<0.05)，CC和CT基因型個體顯著高于TT基因型個體(P<0.05)；g.23252056C>T位點則對失水率的影響達到顯著水平(P<0.05)，TT基因型個體顯著低于CC和CT基因型個體(P<0.05)；其他各位點對長順綠殼蛋雞胸肌肉質(zhì)指標(biāo)的影響未能達到顯著性差異(P>0.05)。

表4 長順綠殼蛋雞SFRP5基因外顯子1的SNP位點與肉質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析

2.5 SNPs雙倍型與胸肌常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性分析

對長順綠殼蛋雞SFRP5基因外顯子1中發(fā)現(xiàn)的3個SNP位點組成的雙倍型與胸肌常規(guī)肉品質(zhì)指標(biāo)進行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果從表5可知，雙倍型H3H4和H2H4個體的pH值均顯著高于雙倍型H2H2和H2H3個體(P<0.05)，雙倍型H3H3個體的失水率顯著低于雙倍型H1H2、H1H3、H2H3、H2H4和H4H4個體(P<0.05)，雙倍型H4H4個體的蒸煮損失顯著低于雙倍型H1H2、H1H4和H2H4個體(P<0.05)，雙倍型H2H3個體的嫩度顯著高于雙倍型H2H4個體(P<0.05)，雙倍型H2H2個體的粗脂肪含量顯著高于雙倍型H3H3和H4H4個體(P<0.05)，共他各指標(biāo)各雙倍型間的差異未達到顯著水平(P>0.05)。

表5 SFRP5基因外顯子1的SNPs位點雙倍型與長順綠殼蛋雞常規(guī)肉質(zhì)指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

脂肪是影響畜禽肌肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素，直接影響肉質(zhì)的滋味、口感和風(fēng)味，也與肌肉水分含量、失水率、蒸煮損失和嫩度密切相關(guān)。通過遺傳標(biāo)記選擇具有優(yōu)良肌肉品質(zhì)的種質(zhì)資源群體生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)肉是當(dāng)前乃至今天重要的攻關(guān)方向。SFRP5在調(diào)控生脂基因過程中發(fā)揮重要作用，對畜禽肌肉品質(zhì)有重要影響[17]，但報道缺乏。Li等[12]報道藏雞胸肌、腿肌和脂肪組織中SFRP5 mRNA 表達水與IMF顯著相關(guān)，揭示SFRP5參與雞胸肌IMF的沉積。覃媛鈺等[14]在長順綠殼雞SFRP5基因外顯子3中發(fā)現(xiàn)2個SNP突變位點：g.23253254 G>A和g.23253269 T>G，g.23253254 G>A位點對胸肌粗脂肪含量有顯著影響，2個SNPs位點組成雙倍型對胸肌粗脂肪含量的影響達到顯著水平，揭示g.23253254 G>A和 g.23253269 T>G變異位點可能作為提高長順綠殼蛋雞胸肌脂肪的分子標(biāo)記。本研究對長順綠殼蛋雞SFRP5外顯子1的SNP進行檢測，發(fā)現(xiàn)3個SNP同義突變位點：g.23251706 C>T、g.23251882 C>T和g.23252056 C>T，3個SNP位點的基因型分布均處于Hardy-Weinberg平衡。在任何有限的群體中，基因在配子中的隨機分離和在合子里的隨機重組都會導(dǎo)致一定的誤差，引起基因頻率的變化，即隨機漂變引起基因頻率偏離Hardy-Weinberg平衡[18]。因此，從本研究結(jié)果看，3個SNP位點未受到突變、選擇、遺傳漂變等的影響，或者是受到影響而由于長期的人工選擇并進行大規(guī)模擴群后又重新處于一種新的平衡狀態(tài)。

畜禽基因組的變化特別是功能結(jié)構(gòu)基因的突變會影響其生產(chǎn)性能，其SNP變異位點的連鎖關(guān)系決定群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化。本研究通過對3個SNP進行連鎖不平衡分析，表明SNP間不存在強連鎖不平衡，發(fā)現(xiàn)4種單倍型和10種雙倍型。關(guān)聯(lián)分析表明g.23251706C>T對長順綠殼蛋雞胸肌蒸煮損失有顯著影響，TT基因型有利于降低蒸煮損失，是有利基因型；g.23252056C>T位點對失水率有顯著影響，TT基因型有利于提高肌肉的保水力；3個SNP位點聯(lián)合組成的雙倍型對胸肌的5個常規(guī)肉品質(zhì)指標(biāo)均有不同程度的影響，H3H4個體的pH值最高，H1H2的失水率最高，H1H4的蒸煮損失最高，H2H3嫩度值最大，H2H2粗脂肪含量最高。綜合所有指標(biāo)在雙倍型之間的差異，認為雙倍型H2H2是對長順綠殼蛋雞肌肉品質(zhì)最有利的雙倍型，3個SNP共同對肉質(zhì)的影響效應(yīng)明顯大于單個SNP的影響。前人的研究表明，基因堿基突變可能引起構(gòu)象變化，增加或降低熵值，影響基因的復(fù)制速度、轉(zhuǎn)錄過程中的剪接過程和蛋白質(zhì)翻譯的速度甚至影響其半衰期[19]。由此推測，本研究發(fā)現(xiàn)的3個SNP共同聯(lián)合引起基因結(jié)構(gòu)變化強于單個SNP對基因結(jié)構(gòu)變化的影響，其對肉質(zhì)的調(diào)控作用可能更有效。但是，在雙倍型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析中，部分雙倍型個體數(shù)還是相對較少，如H2H4、H4H4 、H3H3和H3H4等雙倍型個體數(shù)不超過10，統(tǒng)計分析結(jié)果還需要進一步增加測試樣本，進一步驗證本研究的結(jié)果。同時需進一步在開展該基因變異是否引起構(gòu)象變化的研究，深入挖掘更有育種價值的SNP位點或單倍型，推動家禽的育種進展。