趙玉田，王果帥，張雪晴，李賽慧，閔雯嫣，劉宗平，顧建紅*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

鎘是一種不易分解的重金屬環(huán)境污染物，其生物半衰期為10～30年，進(jìn)入環(huán)境后不能被微生物降解，并可通過(guò)食物鏈蓄積在體內(nèi)[1-2]。急性或慢性鎘暴露能引起肝腎及骨骼等多種器官和組織的損傷。因此，鎘的研究愈來(lái)愈廣泛。骨作為鎘毒性作用的主要靶器官之一，接觸高濃度鎘會(huì)降低骨密度(bone mineral density，BMD)，通常表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)炎等癥狀[3]。近年來(lái)，由于工業(yè)的快速發(fā)展，大氣和飼料中的鎘污染日益嚴(yán)重，對(duì)動(dòng)物健康造成了極大的威脅[4]。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一種骨髓多能細(xì)胞，在體內(nèi)處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到各種生理或病理刺激時(shí)能分化為成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞等[5-6]。BMSCs純化需時(shí)短，并可在體外迅速擴(kuò)增，作為骨髓微環(huán)境的重要組成成分，對(duì)于維持正常的骨代謝具有極其重要的作用[7-8]。鎘引起骨質(zhì)疏松的確切機(jī)制尚不清楚[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，氯化鎘可促進(jìn)人BMSCs的成脂分化、抑制其成骨分化[10]。大鼠試驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量的鎘可以通過(guò)RANKL/OPG信號(hào)下調(diào)BMSCs的成骨分化基因[11]，也可通過(guò)Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs的成骨分化[12]。然而，人和大鼠屬于哺乳類(lèi)動(dòng)物，其骨骼與家禽存在差異。禽類(lèi)骨骼中空，壁薄而輕，不僅在支撐機(jī)體中發(fā)揮重要作用，在蛋殼形成中亦發(fā)揮重要作用。目前，鎘對(duì)禽類(lèi)BMSCs成骨分化的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究將在誘導(dǎo)雞胚來(lái)源BMSCs成骨分化基礎(chǔ)上，加入不同濃度的醋酸鎘，觀察其對(duì)雞體外培養(yǎng)BMSCs成骨分化的影響，為禽類(lèi)骨代謝失衡疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雞蛋由山東濟(jì)南鑫盛達(dá)科技有限公司購(gòu)入，在揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室孵化至18日齡。

1.2 雞胚BMSCs的分離與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下，分離雞胚股骨、脛骨，用不含血清的α-MEM培養(yǎng)基沖出骨髓，沖至發(fā)白，300目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心留沉淀于管底的細(xì)胞，用α-MEM培養(yǎng)基(含10%FBS)重懸，以3×106個(gè)/mL密度接種于細(xì)胞瓶，37 ℃、5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

BMSCs在24 h完全貼壁，換液去除未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。α-MEM培養(yǎng)基先于37 ℃水浴加熱15 min，取出細(xì)胞瓶，在超凈臺(tái)內(nèi)緩慢棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)清洗2次，再用預(yù)熱的0.25%胰酶37 ℃消化，在顯微鏡下觀察至細(xì)胞間連接消失時(shí)，加入含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，用膠頭滴管緩慢吹下貼壁細(xì)胞，PBS清洗后用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，以3×106個(gè)/mL接種于細(xì)胞瓶，置于37 ℃，5%CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 雞BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察及成骨分化能力檢測(cè)

取第二代雞BMSCs，以每孔3×105個(gè)接種于六孔板，待長(zhǎng)至75%左右改為成骨誘導(dǎo)液(10%FBS、地塞米松10 nmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸50 μg/mL的DMEM)，誘導(dǎo)7 d時(shí)，進(jìn)行堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色，誘導(dǎo)21 d時(shí)進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色并拍照記錄。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs特異性表面標(biāo)志物

第二代細(xì)胞長(zhǎng)至約80%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入2 mL胰蛋白酶消化30 s，含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)基終止消化，收集細(xì)胞，1 000 r/min，離心10 min，PBS洗2次，用100 μL PBS重懸。對(duì)照組不加任何抗體，實(shí)驗(yàn)組分別加入2 μL 抗體(CD44-FITC、CD45-PE、CD44-FITC和CD45-PE)，冰上孵育30 min后加入1 mL PBS清洗2次，用300 μL PBS重懸細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管，F(xiàn)ACS LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。

1.5 CCK-8法檢測(cè)增殖率

取第二代細(xì)胞，按照上述方法傳至96孔板(接種密度7 500個(gè)/孔)，待其長(zhǎng)至75%左右，改為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(10%FBS、地塞米松10 nmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸50 μg/mL的DMEM)，并加入0，1，2，5，10和20 μmol/L的醋酸鎘處理72 h，按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)，在450 nm處采用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。

1.6 ALP染色測(cè)定ALP活性

取第二代細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板，待長(zhǎng)至75%左右改為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(10%FBS、地塞米松10 nmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸50 μg/mL的DMEM)，并加入0和5 μmol/L的醋酸鎘，處理72 h，按BCIP?/NBT液體底物系統(tǒng)試劑盒操作。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取第二代細(xì)胞以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種至6孔板，待長(zhǎng)至75%左右改為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(10%FBS、地塞米松10 nmol/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L、抗壞血酸50 μg/mL的DMEM)，并加入0、5、10和20 μmol/L的醋酸鎘，處理72 h，TRizol裂解法提取各組總RNA。使用qPCR儀檢測(cè)成骨相關(guān)標(biāo)志分子：Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、ALP、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(osterix，OSX)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、Ⅰ型膠原(type Ⅰ collagen，COL1)；破骨細(xì)胞生成和抑制因子：核因子κB受體活化因子配體(RANKL)和骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)mRNA表達(dá)水平。以GAPDH為參照，按照RT-PCR Kit進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。引物序列見(jiàn)如表1。

表1 成骨相關(guān)基因引物序列

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)值均使用GraphPad Prism軟件分析作圖，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05表示組間差異顯著，P<0.01表示組間差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs形態(tài)觀察及成骨分化能力檢測(cè)

剛接種的原代BMSCs呈圓形，24 h后開(kāi)始貼壁，貼壁細(xì)胞呈梭形，體積增大但混有大量紅細(xì)胞、白細(xì)胞等不貼壁橢圓形或圓形細(xì)胞。傳至第一代，細(xì)胞形態(tài)趨于均一，紡錘形細(xì)胞增多，圓形細(xì)胞減少。傳至第二代細(xì)胞形態(tài)更加均一，紡錘形細(xì)胞占80%以上(圖1)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d ALP染色結(jié)果顯示，細(xì)胞呈紫黑色(圖2)。成骨誘導(dǎo)至21 d時(shí)，茜素紅染色可見(jiàn)橘紅色的礦化結(jié)節(jié)形成(圖3)。

圖1 雞BMSCs形態(tài)(100×)

圖2 雞BMSCs ALP 染色(100×)

圖3 礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色(100×)

2.2 流式檢測(cè)特異性標(biāo)志物

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第二代BMSCs，結(jié)果顯示，CD44(64.9%)為陽(yáng)性(圖4)，CD45(0.5%)為陰性(圖5)，符合基質(zhì)細(xì)胞表型特征。

圖4 CD44-FITC

圖5 CD45-PE

2.3 鎘對(duì)BMSCs增殖率的影響

CCK-8法檢測(cè)不同濃度醋酸鎘處理72 h的細(xì)胞增殖率，以確定醋酸鎘的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，低濃度的鎘對(duì)細(xì)胞的存活率有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)，當(dāng)醋酸鎘濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，可顯著抑制細(xì)胞活力(P<0.05)(圖6)。

注：*表示與空白對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.05)

2.4 鎘對(duì)BMSCs成骨分化過(guò)程中ALP活性的影響

ALP染色法檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶的活性，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞存在大量紫黑色的染色顆粒(圖7A)，醋酸鎘處理組紫黑色面積較少(圖7B)，說(shuō)明鎘處理組ALP活性明顯降低。

A. 空白組；B. 鎘處理組

2.5 RT-PCR檢測(cè)OB相關(guān)基因

熒光定量PCR結(jié)果顯示，OPN、COL1、Runx2、OSX、ALP、OCN和OPG mRNA的表達(dá)量隨著鎘濃度的升高劑量依賴(lài)性降低，除了5 μmol/L鎘組OPN差異不顯著外，其余各組差異均極顯著(P<0.01)(圖8A-H)。RANKL mRNA的表達(dá)量呈濃度依賴(lài)性升高，差異均極顯著(P<0.01)(圖8A～H)。

A. OPN mRNA的相對(duì)表達(dá)；B. COL1 mRNA的相對(duì)表達(dá)；C. Runx2 mRNA的相對(duì)表達(dá)；D. OSX mRNA的相對(duì)表達(dá)；E. ALP mRNA的相對(duì)表達(dá)；F. OCN mRNA的相對(duì)表達(dá)；G. OPG mRNA的相對(duì)表達(dá)；H. RANKL mRNA的相對(duì)表達(dá)。**表示與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)

3 討論

目前報(bào)道BMSCs分離的方法不止一種，包括差速貼壁分離法、密度梯度離心和流式細(xì)胞術(shù)分離法等[13]。王翔毅等[14]發(fā)現(xiàn)體外密度梯度離心法和貼壁靜置可以獲得大量高度均一、表型符合BMSCs的細(xì)胞。根據(jù)BMSCs與其他細(xì)胞貼壁能力、沉降速度的差異，首次換液時(shí)間格外重要，接種后24 h通過(guò)首次全量換液以防止雜細(xì)胞貼壁，傳代時(shí)控制胰酶消化時(shí)間為30 s[15]。目前還沒(méi)發(fā)現(xiàn)BMSCs的特異表面標(biāo)志，主要根據(jù)其可表達(dá)CD44、CD54、CD106等間質(zhì)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志，但不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞標(biāo)志進(jìn)行鑒定[16-18]。本試驗(yàn)采用全骨髓差速貼壁法，接種后24 h全量換液，待其長(zhǎng)至80%時(shí)，傳代培養(yǎng)。原代細(xì)胞可見(jiàn)大量圓形或橢圓形雜細(xì)胞，傳至第一代時(shí)圓形細(xì)胞減少，細(xì)胞呈典型的紡錘形，體積較大，邊緣光亮，可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)第二代BMSCs 7 d細(xì)胞ALP染色陽(yáng)性，培養(yǎng)21 d可形成礦化結(jié)節(jié)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示第二代細(xì)胞CD44陽(yáng)性，CD45陰性，符合BMSCs特征。表明本試驗(yàn)獲得的細(xì)胞為雞BMSCs，可用于下一步試驗(yàn)。

鎘作為重要的環(huán)境重金屬污染物，可增加人和動(dòng)物骨質(zhì)疏松的風(fēng)險(xiǎn)[19]。高劑量的鎘可明顯損害大鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu)[20]。早期研究表明，鎘的骨毒性繼發(fā)于腎損傷，尤其腎小管損傷可致腎小管鈣、磷重吸收障礙；同時(shí)維生素D活化受損，繼發(fā)鈣、磷代謝異常，引發(fā)骨丟失和骨質(zhì)疏松癥狀[21]。最近研究表明，鎘可直接作用于OB，引起骨損傷[22]。然而，鎘是否影響禽BMSCs成骨分化，從而導(dǎo)致骨骼疾病仍不清楚。OB發(fā)育包括活化增殖期、細(xì)胞外基質(zhì)成熟期和基質(zhì)礦化期3個(gè)階段。ALP是OB成熟及活性的標(biāo)志[23]。Runx2是促進(jìn)骨形成的關(guān)鍵調(diào)控因子，為成骨分化早期標(biāo)志物。OSX是Runx2在成骨過(guò)程中的下游靶點(diǎn)，激活COL1A1和OCN的轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)骨形成[24]。OCN由成熟的礦化OB合成，是OB分化中晚期標(biāo)志物，其可通過(guò)與鈣及羥基磷灰石結(jié)合促進(jìn)骨形成[25]。OPN主要表達(dá)于骨形成晚期，調(diào)控礦化組織的重建[26]；此外，表達(dá)于OB或BMSCs的RANKL/OPG信號(hào)是近20年發(fā)現(xiàn)的調(diào)控破骨細(xì)胞生成和骨溶解的關(guān)鍵信號(hào)軸[27]。因此ALP、RUNX2、OSX、COL1A1、OCN、OPN的表達(dá)水平反映著B(niǎo)MSCs的成骨分化能力，RANKL和OPG表示骨吸收能力。本研究在體外誘導(dǎo)雞BMSCs成骨分化過(guò)程中用不同濃度醋酸鎘處理，觀察了鎘對(duì)BMSCs增殖及上述成骨標(biāo)志物表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，低濃度(≤10 μmol/L)鎘顯著促進(jìn)BMSCs增殖，高濃度(大于10 μmol/L)鎘顯著抑制BMSCs增殖；然而，5 μmol/L鎘暴露均可顯著或極顯著下調(diào)成骨相關(guān)指標(biāo)(COL1、OSX、RUNX2、ALP、OCN、OPN)以及OPG的表達(dá)，上調(diào)RANKL基因的表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)效應(yīng)。研究表明，鎘能夠抑制體外培養(yǎng)雞BMSCs向OB的分化，低濃度鎘對(duì)BMSCs增殖的促進(jìn)作用主要是反饋調(diào)節(jié)引起。