邵 佩 莊 虎 謝 超 陳 勝

(1. 武漢黃鶴樓香精香料有限公司，湖北 武漢 430040；2. 湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040)

紅豆(VignaangularisW.)，屬豆科豇豆屬，又名紅小豆、小豆、赤小豆、赤豆，在中國(guó)陜西、江蘇、廣西等地方分布較廣[1]。紅豆藥用價(jià)值高，具有良好的健脾止瀉、解毒消腫、預(yù)防肝硬化等功效[2]。其食用價(jià)值也極高，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物，還含有多酚、多糖、黃酮等多種生物活性成分[3]。

試驗(yàn)擬以紅豆為原料，采用超聲輔助提取法，以料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為考察因素，采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，經(jīng)脫蛋白、醇沉、透析工藝處理后，評(píng)價(jià)紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性，以期提高紅豆多糖提取率，為紅豆的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與儀器

紅豆：湖北恩施生產(chǎn)；

透析袋：西安優(yōu)博生物科技有限公司；

葡萄糖：標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司;

乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、冰乙酸、三氯化鐵、30%雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)硫酸鉀等試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)：標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；

胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；

金黃色葡萄球菌(6538)、大腸桿菌(25922)：美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心；

沙門氏菌、枯草芽孢桿菌：由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高速粉碎機(jī)：DFY-300型，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；

電子分析天平：AL204型，梅特勒—托利多儀器上海有限公司；

超聲波清洗機(jī)：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1750型，日本島津公司；

手提式壓力蒸汽滅菌鍋：TX-24LDJ型，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；

超凈工作臺(tái)：VD-1320型，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SHP-250型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理 紅豆樣品粉碎打粉后過(guò)60目篩，紅豆粉用80%乙醇溶液回流4 h以脫色并除去小分子多糖等，抽濾后將濾渣用無(wú)水乙醇、丙酮和乙醚分別清洗，粉末置于室溫下24 h陰干，得紅豆粉末待用[16-17]。

1.2.2 紅豆多糖的提取工藝流程

紅豆粉末→超聲波處理浸提→抽濾除渣→離心(8 000 r/min，10 min)→取上清液→在上清液中加入5%三氯乙酸至提取液不混濁(除蛋白)[18]→離心(8 000 r/min，20 min)→取上清液60 ℃下旋蒸至其體積的1/4左右→加入3倍體積的95%乙醇靜置24～48 h→抽濾→濾渣離心(8 000 r/min，20 min)后取沉淀→用無(wú)水乙醇洗滌并收集沉淀→將沉淀溶于蒸餾水透析48 h→冷凍干燥→得紅豆粗多糖

1.2.3 紅豆多糖含量的測(cè)定 采用苯酚—硫酸分光光度法[16]。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=5.286x-0.017,R2=0.999 2。

取2 mL稀釋提取液，加入體積分?jǐn)?shù)5%苯酚溶液1 mL 和濃H2SO45 mL，充分混勻，室溫靜置30 min，于490 nm處測(cè)定吸光度，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅豆多糖含量[19]。按式(1)計(jì)算多糖提取率。

(1)

式中：

Y——多糖提取率，%；

V——多糖溶液的體積，mL；

c——葡萄糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；

n——稀釋倍數(shù)；

m——紅豆粉的質(zhì)量，g。

1.2.4 紅豆多糖提取單因素試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5 g紅豆粉末，用蒸餾水作溶劑，在100 W下進(jìn)行超聲提取，測(cè)定紅豆多糖提取率。

(1) 料液比：固定超聲溫度40 ℃，超聲時(shí)間90 min，考察料液比[m紅豆∶V水分別為1∶8，1∶16，1∶24，1∶32，1∶40 (g/mL)]對(duì)紅豆多糖提取率的影響。

(2) 超聲溫度：固定料液比(m紅豆∶V水)1∶24 (g/mL)，超聲時(shí)間90 min，考察超聲溫度(20，30，40，50，60 ℃)對(duì)紅豆多糖提取率的影響。

(3) 超聲時(shí)間：固定料液比(m紅豆∶V水)1∶24 (g/mL)，超聲溫度40 ℃，考察超聲時(shí)間(30，60，90，120，150 min)對(duì)紅豆多糖提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)超聲波輔助提取的試驗(yàn)方法，選取料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間為影響因素，以紅豆多糖提取率作為試驗(yàn)設(shè)計(jì)的響應(yīng)值，根據(jù)Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化超聲波輔助提取紅豆多糖工藝參數(shù)。

1.2.6 紅豆多糖體外抗氧化活性評(píng)價(jià) 根據(jù)文獻(xiàn)[20]進(jìn)行，測(cè)定紅豆多糖的總還原能力，以及對(duì)·OH和ABTS+·的清除率。

1.2.7 紅豆多糖抑菌活性的測(cè)定

(1) 菌種活化：取各待測(cè)菌株于TSA培養(yǎng)基上37 ℃下倒置培養(yǎng)24 h，用生理鹽水洗斜面上的菌，充分震蕩使菌懸液的濃度為108CFU/mL，備用[21]。

(2) 抑菌活力的測(cè)定：采用文獻(xiàn)[21]中牛津杯法測(cè)定紅豆多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性。將熔化并冷卻的TSA培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)約15 mL，待凝固后加入100 μL的108CFU/mL菌懸液采用涂布法涂布均勻，在平板標(biāo)記處放置牛津杯，并于每個(gè)牛津杯中吸入200 μL經(jīng)0.22 μm過(guò)濾器過(guò)濾的10 mg/mL多糖溶液(每組3個(gè)平行)。于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑作為抑菌活性的測(cè)定指標(biāo)。

(3) 最低抑菌濃度(MIC)的測(cè)定：參照李彥坡等[22]的方法并根據(jù)實(shí)際情況有所調(diào)整。將紅豆多糖分別制成0.625，1.250，2.500，5.000，10.000，20.000 mg/mL 6個(gè)濃度梯度，采用涂布法測(cè)定，將1 mL不同濃度多糖溶液與25 mL培養(yǎng)基混勻，待培養(yǎng)基凝固后，加入4種供試菌的菌懸液100 μL，涂布均勻后，倒置培養(yǎng)24 h，每組試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 采用Excel 2010處理數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.0進(jìn)行繪圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，以P<0.05表示差異顯著且具有統(tǒng)計(jì)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆多糖的提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 由圖1可知，料液比(m紅豆∶V水)選擇1∶16～1∶32 (g/mL)較合適；超聲溫度選擇40～60 ℃較合適；超聲時(shí)間選擇60～120 min比較合適。

圖1 3個(gè)因素對(duì)紅豆多糖提取率的影響

2.1.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用軟件Design-Expert 8.0.6中的Box-Behnken模式對(duì)料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示。

2.1.3 回歸模型及方差分析 由表2可知，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合[23]，得到紅豆多糖提取率對(duì)料液比、超聲溫度、超聲時(shí)間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=9.85+0.52A+0.39B+0.19C-0.45AB-0.06AC-0.17BC-0.81A2-1.40B2-0.65C2。

(2)

2.1.4 因素交互作用分析 由圖2可知，料液比和超聲溫度的交互作用極顯著(P<0.01)，料液比和超聲時(shí)間、超聲溫度和超聲時(shí)間的交互作用不顯著(P>0.05)，該結(jié)論與方差分析結(jié)果一致。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

2.1.5 最佳工藝條件的確定 利用Design-Expert 8.0.6軟件分析得到紅豆多糖的最佳提取工藝條件為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26.33 (g/mL)，超聲溫度50.84 ℃，超聲時(shí)間93.69 min，此條件下預(yù)測(cè)的最佳提取率為9.95%。雖然表2中試驗(yàn)號(hào)3和6提取率>10%，但考慮到試驗(yàn)樣品的隨機(jī)性，以及預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)號(hào)3和6提取率值無(wú)顯著性差異(P>0.05)，故以Design-Expert 8.0.6軟件分析得出的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)?？紤]到實(shí)際情況，將工藝條件適當(dāng)調(diào)整為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26 (g/mL)，超聲溫度51 ℃，超聲時(shí)間94 min，在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，紅豆多糖提取率平均值為(9.92±0.04)%，與預(yù)測(cè)最佳提取率基本一致，說(shuō)明該模型優(yōu)化結(jié)果可靠。

表2 紅豆多糖響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 回歸方程各項(xiàng)的方差分析?

2.2 紅豆多糖的抗氧化活性

2.2.1 總還原能力 由圖3可知，紅豆多糖的總還原能力與多糖濃度之間均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL時(shí)，隨著濃度升高，多糖的總還原能力顯著增加，與李粉玲等[13]的結(jié)論一致。當(dāng)紅豆多糖質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，總還原能力最強(qiáng)，吸光值達(dá)(0.486±0.007)。表明紅豆多糖有較好的抗氧化能力，但顯著弱于維生素C的抗氧化能力(P<0.05)。

圖2 響應(yīng)面及等高線圖

圖3 紅豆多糖總還原能力

2.2.2 清除·OH能力 由圖4可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1～5 mg/mL時(shí)，隨著濃度升高多糖對(duì)·OH清除率逐漸增大。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)·OH清除率達(dá)(90.25±1.38)%，顯著低于同濃度下維生素C對(duì)·OH清除率(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果顯著高于李粉玲等[13]研究的紅豆多糖和鐘葵等[26]研究的綠豆多糖在同質(zhì)量濃度下的·OH清除率，表明紅豆多糖對(duì)·OH有較強(qiáng)的清除能力。

2.2.3 清除ABTS+·能力 由圖5可知，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度低于1.5 mg/mL時(shí)，多糖對(duì)ABTS+·清除能力存在量效關(guān)系，隨著濃度升高，多糖對(duì)ABTS+·清除能力增大；當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為1.5～2.0 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率的增長(zhǎng)趨緩。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，紅豆多糖對(duì)ABTS+·清除能力達(dá)到最大值(96.20±3.25)%，與維生素C的ABTS+·清除能力無(wú)顯著性差異(P>0.05)。許海燕等[27]研究顯示樺菌芝多糖在2.0 mg/mL時(shí)對(duì)ABTS+·清除率為90%，低于試驗(yàn)結(jié)果，表明一定質(zhì)量濃度下紅豆多糖對(duì)ABTS+·有較強(qiáng)的清除能力。

2.3 紅豆多糖的抑菌活性

2.3.1 抑菌圈直徑 由表4可知，紅豆多糖對(duì)金黃葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌具有不同程度的抑制作用，其中，紅豆多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，抑菌直徑為(9.54±0.22) mm，與許海燕等[27]樺菌芝多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑接近；對(duì)沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑制較弱，抑菌圈直徑分別為(8.24±0.06)，(8.19±0.17) mm。紅豆多糖對(duì)4種供試菌的抑制作用強(qiáng)弱順序?yàn)榻瘘S色葡萄球菌>大腸桿菌>沙門氏菌>枯草芽孢桿菌，表明紅豆多糖具有良好的抑菌效果。

圖4 紅豆多糖對(duì)·OH清除率的影響

圖5 紅豆多糖對(duì)ABTS+·清除率的影響

2.3.2 最小抑菌濃度 由表5可知，紅豆多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的MIC值分別為2.500，5.000，10.000，10.000 mg/mL，說(shuō)明紅豆多糖金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)沙門氏菌和枯草芽孢桿菌的抑菌活性最弱。結(jié)果表明紅豆多糖的抑菌活性隨著濃度增大而增強(qiáng)，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌。

表4 紅豆多糖對(duì)4種供試菌的抑菌圈直徑?

表5 紅豆多糖對(duì)4種供試菌的MIC?

3 結(jié)論

通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)確定了紅豆多糖的最佳提取工藝條件為：料液比(m紅豆∶V水)1∶26 (g/mL)，超聲溫度51 ℃，超聲時(shí)間94 min，此條件下多糖提取率為(9.92±0.04)%。對(duì)紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性結(jié)果顯示：① 紅豆多糖具有較強(qiáng)的總抗氧化活性，但總還原能力及對(duì)羥基自由基、ABTS+自由基清除能力均低于維生素C；② 紅豆多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用，且對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)。此外，目前關(guān)于紅豆多糖的相關(guān)報(bào)道較少，后期研究可以從以下方面入手：① 試驗(yàn)初探了紅豆多糖的抗氧化及抑菌活性，后面可對(duì)紅豆多糖抗氧化活性成分構(gòu)效關(guān)系及抑菌機(jī)理展開(kāi)研究；② 試驗(yàn)提取的紅豆多糖為粗多糖，純度為62%，后續(xù)可對(duì)紅豆多糖進(jìn)一步分離純化，提高多糖純度。