張 然，楊 冰,，廖茂梁,，華 潔,，周鈺通,，周福軍,*，張鐵軍,*

1.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070

2.天津藥物研究院，天津 300462

3.天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

4.釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

青蒿素提取分離自黃花蒿Artemisia annuaL.，是一種抗瘧藥物，其特點(diǎn)有療效高、毒性較小等[1]。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是由四氫硼鈉還原青蒿素而得，其結(jié)構(gòu)特征為獨(dú)特的過氧橋，具有多種優(yōu)點(diǎn)，如藥效高、毒性低、在體內(nèi)吸收快、排泄和代謝迅速、分布廣。此外，DHA 的抗瘧作用是青蒿素的4～8 倍[2]。有研究表明，DHA 具有抗瘧、抗腫瘤、抗炎、抗肺纖維化以及抗其他寄生蟲等藥理作用[3-4]。但DHA 在水中溶解度較低，其口服生物利用度會(huì)受到一定影響，其制劑的開發(fā)也受到限制。近年來，研究人員采用增溶技術(shù)，如脂質(zhì)體[5]、環(huán)糊精包合物[6]等改善DHA 的溶解度，但其制備工藝復(fù)雜，工業(yè)化技術(shù)要求較高。因此，為進(jìn)一步提高DHA 的溶解度，應(yīng)開發(fā)制備工藝簡單、易于產(chǎn)業(yè)化的DHA 新劑型。

自微乳給藥系統(tǒng)（self-microemulsion drug delivery system，SMEDDS）是藥物、天然或合成油、乳化劑和助乳化劑的均勻混合體系[7-8]。SMEDDS將疏水性藥物引入油相體系，在水介質(zhì)中適度攪拌和適當(dāng)稀釋后形成O/W 型的乳劑，可以大大提高疏水性藥物口服生物利用度[9-12]。此外，SMEDDS 還具有較高的生物相容性、穩(wěn)定性、控釋性[13]。近年來，偽三元相圖[14-15]作為研究成乳區(qū)域的基礎(chǔ)工具，操作簡單，常與預(yù)測(cè)效果更好的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法（CCD-RSM）[16-17]聯(lián)合用于處方篩選。

因此，為解決DHA 溶解度較差、生物利用度較低等問題，本實(shí)驗(yàn)通過繪制偽三元相圖篩選處方中輔料（油相、乳化劑和助乳化劑）的比例，采用CCD-RSM 確定處方最佳比例，制備DHA 自微乳（DHA-SMEDDS），進(jìn)行評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步研究與開發(fā)DHA 的新劑型提供依據(jù)，實(shí)現(xiàn)提高藥物溶解度、增加口服生物利用度、改善胃腸道吸收的目的[18]。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

犬腎MDCK 細(xì)胞，天津藥物研究院有限公司惠贈(zèng)。

1.2 試藥

DHA 原料藥，昆藥集團(tuán)重慶武陵山制藥有限公司，批號(hào)C01120200501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%；DHA對(duì)照品，中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)100184-201403，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.8%；甲醇、乙腈、無水乙醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；鹽酸、磷酸二氫鉀，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；磷酸氫二鉀，天津市光復(fù)科技有限公司；氫氧化鈉，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；正辛醇、聚乙二醇400（PEG400）、聚乙二醇-12-羥基硬脂酸酯（HS15）、中鏈甘油三酸酯Miglyol 812N、蓖麻油聚烴氧酯（EL35）、聚氧乙烯40 蓖麻油（RH40），北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司；屈臣氏純凈水；1,2-丙二醇，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系合成藥物研究所；辛癸酸甘油酯（MCT），上海佑創(chuàng)實(shí)業(yè)有限公司；油酸乙酯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；肉豆蔻酸異丙酯（IPM），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素、PBS 緩沖液、胰蛋白酶，美國Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma 公司；冰凍4%多聚甲醛溶液、DAPI 工作液（1 mg/mL），北京索萊寶科技有限公司；山羊血清工作液，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；兔抗ZO-1 抗體，美國Invitrogen Corporation 公司；Triton X-100，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Acti-stain 488 phalloidin 熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，美國Cytoskeleton 公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記山羊抗兔IgG，武漢谷歌生物科技有限公司；DiBAC4（3），美國Life Technologies公司；Ca2+-ATP 酶、BCA 蛋白定量試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器

HPLC Agilent 1260 液相色譜儀，美國Agilent公司；THZ-92C 氣浴恒溫振搖器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS224S 型電子天平，Sartorius公司；SB-3200DTN 超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；TG20-WS 型高速離心機(jī)，長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，天津賽盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；NANO-ZS90 型馬爾文粒度分析儀，英國Malvern公司；HT7700 透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；Series Ⅱ型二氧化碳培養(yǎng)箱、Multiskan Go 全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國Thermo 公司；超凈工作臺(tái)，Heal Force；CKX-41 型倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；Scientz-IID 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海市求精生化試劑儀器有限公司；FACS Aira Ⅱ型流式細(xì)胞儀，美國BD 公司；IX73 型倒置熒光顯微鏡，日本奧利巴斯公司；TDL80-2B 型臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corming 公司；激光共聚焦培養(yǎng)皿，上海晶安生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 DHA-SMEDDS 的制備

固定油相、乳化劑與混合助乳化劑總質(zhì)量為10 g，稱取一定量的油相、乳化劑及混合助乳化劑于茄形瓶中，40 ℃下300 r/min 磁力攪拌30 min，得空白自微乳。于5 g 空白自微乳中精密加入50 mg DHA，40 ℃磁力攪拌1 h，得到DHA-SMEDDS。

2.2 DHA 的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Reprosil-Pur Basic C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水；梯度洗脫：0～25 min，40%乙腈；25～40 min，40%～70%乙腈；40～40.1 min，70%～40%乙腈；40.1～50 min，40%乙腈；檢測(cè)波長216 nm；柱溫25 ℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液配制 精密量取適量DHA 對(duì)照品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為2.140 8 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 對(duì)照品溶液配制 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL 于10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到質(zhì)量濃度為535.2 μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液配制 精密量取DHA-SMEDDS 0.5 g 于10 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min，冷卻至室溫后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液得到供試品溶液。同法制備SMEDDS 空白對(duì)照溶液。

2.2.5 專屬性考察 分別取SMEDDS 空白對(duì)照溶液、DHA 對(duì)照品溶液、DHA-SMEDDS 供試品溶液各20 μL，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并記錄圖譜。專屬性實(shí)驗(yàn)表明，DHA 呈現(xiàn)2 個(gè)色譜峰，分別為α-DHA 和β-DHA，實(shí)驗(yàn)樣品不干擾DHA的測(cè)定，色譜圖見圖1。

圖1 SMEDDS 空白對(duì)照 (A)、DHA 對(duì)照品溶液 (B)、DHA-SMEDDS (C) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of blank SMEDDS (A),DHA reference solution (B) and DHA-SMEDDS (C)

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、2.5、3.0、5.0 mL 于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得到質(zhì)量濃度為0.042 8、0.214 1、0.428 2、1.070 4、1.284 5、2.140 8 mg/mL 的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述系列對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以DHA 2 個(gè)色譜峰的峰面積和為縱坐標(biāo)（Y），其質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)（X）作線性回歸，得到回歸方程Y＝503.24X＋1.642 9，r＝0.999 9。結(jié)果表明DHA 在42.8～2 140.8 μg/mL 線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度考察 精密吸取“2.2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定6 次，記錄DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和。經(jīng)計(jì)算，DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和RSD 為0.23%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復(fù)性考察 按“2.2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液6 份，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和。經(jīng)計(jì)算，DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和RSD 為0.36%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 穩(wěn)定性考察 精密吸取“2.2.4”項(xiàng)下適量的供試品溶液，分別于0、8、10、12、21、24 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并記錄DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和。DHA-SMEDDS 供試品溶液的DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和的RSD 為0.43%，結(jié)果表明DHASMEDDS 供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.10 加樣回收率考察 精密量取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的DHA-SMEDDS 9 份，每份0.25 g，置于10 mL量瓶中，分為3 組，采用加樣回收法，分別精密添加相當(dāng)于供試品溶液中DHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%、120%的DHA 對(duì)照品各3 份，加甲醇適量，超聲30 min，冷卻至室溫后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，DHA 的平均加樣回收率為100.12%，RSD 為1.79%?；厥章史弦?。

2.3 不同溶液中DHA 平衡溶解度的測(cè)定

取過量的DHA 原料藥于10 mL具塞離心管中，分別加入水、0.1 mol/L 鹽酸以及不同pH 值（2.0、3.0、4.0、5.0、5.8、6.0、6.8、7.4）的磷酸鹽緩沖液（PBS），放入37 ℃氣浴恒溫振搖器中，110 r/min振搖24 h，取出后用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用甲醇稀釋適宜的倍數(shù)，濾過，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取20 μL，測(cè)定，記錄DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和，計(jì)算其平衡溶解度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DHA 在0.1 mol/L 鹽酸、不同pH 值（2.0、3.0、4.0、5.0、5.8、6.0、6.8、7.4）的PBS 和水中的平衡溶解度分別為120.4、168.9、167.0、167.8、150.6、141.1、125.8、112.7、46.8、148.1 μg/mL，見表1。

表1 37 ℃下DHA 在不同溶液中的平衡溶解度Table 1 Equilibrium solubilities of DHA in different solution at 37 ℃

2.4 不同溶液中DHA 的表觀油水分配系數(shù)（P）的測(cè)定

取DHA 適量，溶于25 mL 水飽和的正辛醇中，用甲醇稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)后，濾過，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取20 μL，測(cè)定，記錄DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和，計(jì)算其初始質(zhì)量濃度（C0）為4.198 7 mg/mL。分別精密吸取上述正辛醇溶液各2 mL，共5 份，置于10 mL 離心管中，分別加入正辛醇飽和的水相（水、0.1 mol/L 的鹽酸溶液以及pH 5.8、6.8、7.4 的PBS）各2 mL，放入氣浴恒溫振搖器中，在37 ℃下，110 r/min 振蕩24 h，取出，3500 r/min 離心10 min，靜置分層，精密吸取上層正辛醇相1 mL 至5 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密吸取20 μL，測(cè)定，記錄DHA 2 個(gè)色譜峰峰面積和，外標(biāo)法計(jì)算其質(zhì)量濃度（C油），進(jìn)而計(jì)算DHA 的P，計(jì)算公式為P＝C油/(C0－C油)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，DHA 在0.1 mol/L 鹽酸，pH 5.8、6.8、7.4 的PBS 以及水中的P的lgP值均大于1，提示藥物的脂溶性較好。

表2 37 ℃下DHA 在不同溶液中的PTable 2 P of DHA in different media at 37 ℃

2.5 DHA-SMEDDS 處方篩選

2.5.1 DHA 在不同輔料中的飽和溶解度試驗(yàn) 稱取過量的DHA 原料藥于10 mL 具塞離心管中，分別加入不同的油相（Miglyol 812N、橄欖油、MCT、IPM 和油酸乙酯）和助乳化劑（無水乙醇、1,2-丙二醇和PEG400）各10 g，渦旋混勻，40 ℃、110 r/min恒溫振蕩24 h。達(dá)到平衡后，10 000 r/min 離心10 min，吸取適量的上清液并用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液用甲醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，濾過，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定續(xù)濾液中DHA 的含量。計(jì)算DHA 在不同油相和助乳化劑中的溶解度。結(jié)果顯示，DHA 在不同油相中的飽和溶解度大小依次為Miglyol 812N＞MCT＞橄欖油；在助乳化劑中的飽和溶解度大小依次為無水乙醇＞PEG 400＞丙二醇。DHA 在Miglyol 812N 和MCT 溶解度較好，均可用作油相，考慮到MCT 成本較低，易于獲得，故選用溶解度較高的MCT 作為油相。DHA 在無水乙醇和PEG400 溶解度較好，均可用作助乳化劑。結(jié)果見表3。

2.5.2 乳化劑的篩選 為了進(jìn)一步考察輔料的相容性，篩選出乳化效果好的乳化劑，分別將油相與RH40、EL35、HS15 按1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1 的比例在40 ℃磁力攪拌充分混勻后觀察其在純化水中的分散情況，取適量上述基質(zhì)，用純化水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，輕輕振搖使其充分乳化，觀察自微乳液的情況，從而選出乳化效果較好的乳化劑。

表3 40 ℃下DHA 在不同輔料中的溶解度Table 3 Solubility of DHA in different accessories at 40 ℃

將自乳化情況按照以下3 個(gè)級(jí)別進(jìn)行評(píng)定：（a）溶液透明澄清，無色或者淡藍(lán)色；（b）溶液略渾濁，顯藍(lán)白色乳光；（c）不透明黏稠液體[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)MCT 與RH40 的比例為1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1 時(shí)，自乳化情況分別為a、a、a、b 和b；當(dāng)MCT 與EL35 的比例為1∶2 時(shí)，自乳化情況為a，當(dāng)其比例為1∶1.5、1∶1、1.5∶1 時(shí)，自乳化情況均為b，當(dāng)比例為2∶1 時(shí)，自乳化情況為c；MCT 與HS15 配伍時(shí)，乳化情況與EL35 相同?？紤]到乳化劑具有較低的毒性，在制備SMEDDS 時(shí)應(yīng)盡可能少的使用乳化劑，因此選擇用量少且乳化效果好的RH40 為乳化劑。

2.5.3 助乳化劑的考察 采用PEG400 為助乳化劑，先固定油相與乳化劑的比例為1∶2，考察油相與PEG400 配比為2∶8、2∶4、2∶2、4∶2、8∶2時(shí)在40 ℃磁力攪拌充分混勻后觀察其在純化水中的分散情況，取適量上述基質(zhì)，用純化水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，輕輕振搖使其充分乳化，觀察自微乳液是否澄清，以及SMEDDS 在24 h 內(nèi)是否出現(xiàn)分層情況。評(píng)級(jí)方法同“2.5.2”項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以上比例基質(zhì)的自乳化情況均為a，但SMEDDS 經(jīng)放置后，24 h 內(nèi)出現(xiàn)分層現(xiàn)象。為了增加SMEDDS 的穩(wěn)定性、提高載藥量，故加入適量的無水乙醇，制成混合助乳化劑。

2.5.4 混合助乳化劑比例的考察 為確定混合助乳化劑比例，先固定油相、乳化劑、混合助乳化劑的比例為2∶4∶4，考察PEG400 與無水乙醇的比例分別為3∶1、3∶5、3∶9 時(shí)，在40 ℃磁力攪拌，充分混勻后觀察其在純化水中的分散情況，取適量上述基質(zhì)，用純化水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，輕輕振搖，使其充分乳化，觀察自微乳液是否澄清，以及SMEDDS 在24 h 內(nèi)是否出現(xiàn)分層情況。評(píng)級(jí)方法同“2.5.2”項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEG400 與無水乙醇的比例為3∶9、3∶1 時(shí)，自乳化情況均為a，但兩者配比為3∶1 時(shí)SMEDDS 經(jīng)放置后，24 h 內(nèi)出現(xiàn)分層現(xiàn)象；而當(dāng)PEG400 與無水乙醇的比例為3∶5 時(shí)，SMEDDS 乳化后的乳液澄清，乳化效果好且在24 h 內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象。因此，確定混合助乳化劑中PEG400 與無水乙醇的比例為3∶5。

2.5.5 偽三元相圖的繪制 將乳化劑與混合助乳化劑按照質(zhì)量比（Km）為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1 混合后，再與油相按照比例為1∶9～9∶1 進(jìn)行混合，固定總量為5 g，分別稱取相應(yīng)的MCT、RH40 和混合助乳化劑（PEG400 和無水乙醇），40 ℃水浴磁力攪拌混合30 min，形成均勻透明狀液體，稱取0.1 g 空白自微乳加純化水稀釋100 倍，觀察SMEDDS 的乳化情況，以及在24 h 內(nèi)是否發(fā)生分層。選取自乳化后的溶液透明澄清，呈現(xiàn)無色或者淡藍(lán)色的成乳區(qū)域，將偽三元相圖的3 個(gè)頂點(diǎn)設(shè)置為MCT、RH40、混合助乳化劑，使用Origin 2018 繪制空白SMEDDS 的偽三元相圖，確定有效自微乳化區(qū)域。由圖2可知，當(dāng)油相、乳化劑和混合助乳化劑分別為MCT、RH40、PEG400 與無水乙醇（3∶5）時(shí)，各相所占比例分別為10%～30%、27%～81%、7%～63%。所篩選的DHA 空白自微乳加純化水稀釋100 倍后溶液呈澄清或微泛藍(lán)色，并且在24 h 內(nèi)不會(huì)發(fā)生分層現(xiàn)象。結(jié)果見圖2。

2.6 CCD-RSM 優(yōu)化DHA-SMEDDS 的處方

2.6.1 CCD-RSM 確定最優(yōu)處方 選擇自變量時(shí)應(yīng)考慮該因素是否對(duì)SMEDDS 的形成有顯著性影響，因此，選定油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、乳化劑與混合助乳化劑的質(zhì)量比（Km，X2）為自變量。選擇評(píng)價(jià)SMEDDS 體系的平均粒徑（Y1）和SMEDDS 處方載藥量（Y2）為處方評(píng)價(jià)的因變量。按處方比例精密稱取油相、乳化劑、混合助乳化劑，40 ℃磁力攪拌30 min 后加入過量DHA，混勻，10 000 r/min 離心10 min，取上清液即得DHA-SMEDDS。取適量DHA-SMEDDS，加純化水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，搖勻，移取適量上清液，采用馬爾文激光粒度儀測(cè)定平均粒徑。精密稱取上述DHA-SMEDDS 1 g 置于10 mL量瓶中，加純化水稀釋至刻度，10 000 r/min 離心15 min，用0.22 μm 的濾膜濾過，吸取續(xù)濾液5 mL至10 mL 量瓶中，加甲醇適量超聲30 min，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定SMEDDS 中DHA 含量，計(jì)算載藥量。

實(shí)驗(yàn)采用2 因素5 水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)法（CCD）安排試驗(yàn)，結(jié)合偽三元相圖，確定油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)（X1）、Km（X2）的范圍分別為10%～25%、0.67～1.5。使用Design Expert 10.0 軟件對(duì)各成分進(jìn)行多元線性回歸和2 項(xiàng)式的擬合，根據(jù)擬合方程繪制三維效應(yīng)面，表示各指標(biāo)與各成分之間的關(guān)系。使用Design Expert 10.0 軟件，以平均粒徑（Y1）、載藥量（Y2）為因變量，X1和X2為自變量，經(jīng)過對(duì)上述因素進(jìn)行多元線性回歸和2 項(xiàng)式方程擬合后，得到擬合方程Y1＝32.04＋19.28X1－8.02X2－10.04X1X2＋9.12X12＋0.18X22，R2＝0.971 1，P＜0.000 1；Y2＝13.9＋0.31X1＋0.59X2＋0.12X1X2＋0.7X12＋1.01X22，R2＝0.804 5，P＝0.02；由上述方程可知，P均小于0.05，具有顯著性差異，平均粒徑和載藥量均符合多元線性方程，擬合度良好，相關(guān)系數(shù)較高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

圖2 DHA 空白自微乳的偽三元相圖Fig.2 Pseudo-ternary phase diagram of blank DHA-SMEDDS

根據(jù)上述回歸模型，繪制3D 效應(yīng)面圖。結(jié)果見圖3。其中任一變量保持中央水平不變，其他2個(gè)變量在優(yōu)化水平范圍內(nèi)變化時(shí)，油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)、Km之間對(duì)于平均粒徑而言相互影響較小。平均粒徑隨油相比例的增加而逐漸增大。而平均粒徑因Km條件變化的變化趨勢(shì)則受油相的影響。油相比例較小時(shí)，平均粒徑隨Km條件的增加而持續(xù)增大；油相比例較大時(shí)，平均粒徑隨Km條件的增加而持續(xù)減小。油相、Km之間的相互影響對(duì)于載藥量而言較大。載藥量隨油相比例、Km的增加而先減后增。

表4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Experimental results of central composite design

圖3 平均粒徑和載藥量三維效應(yīng)面圖Fig.3 Three-dimensional response surface of average particle size and drug loading

根據(jù)自微乳制劑的特點(diǎn)，比表面積和藥物溶出與吸收的速度隨粒徑的減小而增大；載藥量越高，實(shí)際口服劑量越小[20]。因此，綜合考慮乳化劑毒性、無水乙醇含量對(duì)臨床應(yīng)用的影響，以粒徑≤30 nm為限制條件，油相在15%～25%、Km在0.9～1.2，根據(jù)Design Expert 10.0 軟件的預(yù)測(cè)，綜合考慮載藥量和平均粒徑2 個(gè)指標(biāo)對(duì)SMEDDS 質(zhì)量的影響，得到理論最佳處方為油相15%，Km＝1.2，即MCT 15%、RH40 46.4%、PEG400 14.48%、無水乙醇24.12%。

2.6.2 最優(yōu)處方驗(yàn)證 按照最優(yōu)處方制備3 批DHA-SMEDDS 制劑，取一定量的DHA-SMEDDS制劑用水稀釋適宜倍數(shù)后，分別測(cè)定其粒徑與載藥量，觀察實(shí)測(cè)的載藥量和平均粒徑與預(yù)測(cè)的載藥量和平均粒徑之間的偏差[偏差＝(預(yù)測(cè)值－實(shí)測(cè)值)/預(yù)測(cè)值]。預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值偏差結(jié)果表明，實(shí)際的最優(yōu)處方的平均粒徑和載藥量與軟件預(yù)測(cè)結(jié)果之間偏差的絕對(duì)值較小。結(jié)果見表5。

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) (±s,n=3)Table 5 Verification experiment of central composite design and response surface optimization method (±s,n=3)

表5 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) (±s,n=3)Table 5 Verification experiment of central composite design and response surface optimization method (±s,n=3)

評(píng)價(jià)指標(biāo) 預(yù)測(cè)值 實(shí)測(cè)值 偏差/%平均粒徑/nm 23.72 24.92±0.22 ?5.06載藥量/(mg·g?1) 13.77 14.33±0.06 ?4.07

2.6.3 處方藥物加入量的確定 根據(jù)“2.6.1”項(xiàng)下最優(yōu)自微乳處方配制自微乳基質(zhì)，分別制成含藥量為10、12、15 mg/g 的DHA-SMEDDS，加37 ℃純化水稀釋10 倍，觀察是否有藥物析出。當(dāng)DHA 的加入量大于10 mg/g 時(shí)，加水乳化后的溶液放置時(shí)間在8 h 內(nèi)有藥物析出，其原因可能是載藥量超過了自微乳體系可形成穩(wěn)定的界面膜時(shí)的最大承載量，自微乳經(jīng)乳化后，藥物可能沒有全部包封在自微乳滴中，有少量藥物溶解在乳化劑組成的膠團(tuán)中，藥物超過了乳化劑的溶解能力[20]，DHA 結(jié)晶析出。因此，將處方中DHA 加入量調(diào)整為10 mg/g。

2.6.4 DHA-SMEDDS 的制備 精密稱取MCT 3 g，RH40 9.28 g，無水乙醇4.82 g，PEG400 2.90 g 于茄形瓶中，40 ℃下300 r/min 磁力攪拌30 min，得空白自微乳。于空白自微乳中精密加入200 mg DHA，40 ℃磁力攪拌1 h，得到DHA-SMEDDS。

2.7 DHA-SMEDDS 的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.7.1 外觀觀察 DHA-SMEDDS 在25 ℃存放時(shí)為透明油狀液體，流動(dòng)性較好。加純化水稀釋100倍后形成的微乳液為淡藍(lán)色澄清透明溶液，具有很好的流動(dòng)性。

2.7.2 微觀形態(tài)觀察 取DHA-SMEDDS 適量，加純化水稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，取少量微乳液滴到測(cè)試用有支持膜的銅網(wǎng)上，靜置5 min 后，用濾紙吸去多余液體，滴加2%磷鎢酸溶液，負(fù)染2 min，烘干，于TEM 下觀察并記錄圖像。DHA-SMEDDS 經(jīng)稀釋處理后的乳滴在TEM 下為大小基本相同且分散均勻無粘連的圓球形。TEM 結(jié)果見圖4。

2.7.3 粒徑分布與 Zeta 電位考察 取 DHASMEDDS 適量，加37 ℃純化水稀釋100 倍，制得澄清透明的DHA 微乳液。取微乳液適量，采用馬爾文激光粒度分布儀測(cè)定DHA-SMEDDS 的平均粒徑、多分散性指數(shù)（PDI）和Zeta 電位。測(cè)定結(jié)果表明，DHA-SMEDDS 平均粒徑為（24.55±0.18）nm（n＝3），PDI 為0.092±0.028（n＝3），Zeta 電位為（?3.16±0.14）mV（n＝3）。結(jié)果見圖5。

圖4 DHA-SMEDDS 的TEM 圖Fig.4 TEM of DHA-SMEDDS

圖5 DHA-SMEDDS 的粒徑分布 (A) 和Zeta 電位 (B)Fig.5 Particle size distribution (A) and Zeta potential (B)of DHA-SMEDDS

2.7.4 載藥量和包封率 精密取DHA-SMEDDS 0.5 g（W0）于10 mL 量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min，冷卻至室溫后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定DHA-SMEDDS 中DHA 質(zhì)量（W1）。精密取DHA-SMEDDS 1 g 于10 mL 量瓶中，加37 ℃純化水稀釋至刻度，搖勻，制成微乳液，轉(zhuǎn)移至離心管中，10 000 r/min 離心15 min，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL 至10 mL 量瓶中，加甲醇適量超聲30 min，冷卻至室溫后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，按“2.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定DHA質(zhì)量（W2），根據(jù)公式計(jì)算載藥量和包封率。

載藥量＝W1/W0

包封率＝W2/W1

經(jīng)計(jì)算，DHA-SMEDDS 載藥量為（9.64±0.01）mg/g（n＝3），包封率為（99.67±0.10）%（n＝3）。結(jié)果顯示，DHA 的載藥量和包封率均較好。

2.7.5 乳化時(shí)間考察 精密稱取DHA-SMEDDS 0.5 g，滴入于300 r/min 磁力攪拌下的50 mL 37 ℃純化水中進(jìn)行乳化，測(cè)定形成淡藍(lán)色澄清透明溶液所用時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DHA-SMEDDS 完全乳化成澄清透明的淡藍(lán)色微乳液所需時(shí)間為（13.90±0.10）s，自乳化時(shí)間小于2 min，乳化效率高。

2.8 DHA-SMEDDS 穩(wěn)定性初步研究

2.8.1 高速離心實(shí)驗(yàn) 取DHA-SMEDDS 適量，用37 ℃純化水稀釋100 倍，乳化后形成DHA 微乳液，取該微乳液5 mL，10 000 r/min 高速離心15 min，觀察微乳液是否分層。結(jié)果表明，DHA-SMEDDS的微乳液經(jīng)高速離心后依然澄清透明，沒有產(chǎn)生油水分離及藥物析出現(xiàn)象。

2.8.2 強(qiáng)光照實(shí)驗(yàn) 分別取DHA-SMEDDS 0.5 g，置于常溫（25 ℃）、強(qiáng)光照（4500±500）lx 條件下保存，于第0、5、10 天觀察外觀，測(cè)定平均粒徑及DHA 的藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果如表6所示，放置10 d 后，DHA-SMEDDS 及其乳化后的溶液仍澄清透明，微乳液粒徑無明顯變化，但藥物含量下降了15.35%。因此DHA-SMEDDS 應(yīng)避光保存。

2.8.3 溫度對(duì)DHA-SMEDDS 穩(wěn)定性的影響 將DHA-SMEDDS 分別置于4、25 ℃避光保存，于第0、5、10 天觀察外觀，測(cè)定平均粒徑及DHA 的藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果如表7所示，4、25 ℃避光放置5、10 d 后，自微乳及其乳化后的溶液仍澄清透明，微乳粒徑以及藥物含量均無明顯變化。因此，DHASMEDDS 應(yīng)常溫避光保存。

表6 強(qiáng)光照對(duì)DHA-SMEDDS 穩(wěn)定性的影響 (n=3)Table 6 Effects of intense illumination on stability of DHA-SMEDDS (n=3)

表7 溫度對(duì)DHA-SMEDDS 穩(wěn)定性的影響 (n=3)Table 7 Effects of temperature on stability of DHA-SMEDDS (n=3)

2.9 DHA-SMEDDS 在MDCK 細(xì)胞模型中促滲機(jī)制研究

2.9.1 DHA-SMEDDS 對(duì)緊密連接蛋白的影響 將MDCK 細(xì)胞按照1×105個(gè)/cm2的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)24 h。設(shè)置如下分組：DHA 組（DHA 5 μg/mL）、空白自微乳2000 倍培養(yǎng)基稀釋組、DHA-SMEDDS 2000 倍培養(yǎng)基稀釋組（DHA 5 μg/mL）、培養(yǎng)基組作為對(duì)照組。按分組給藥孵育4 h，棄去藥液，每皿加入1.0 mL 冰凍4%多聚甲醛，置于4 ℃環(huán)境中固定30 min，每皿中加入100 μL 山羊血清工作液，室溫封閉60 min；棄去封閉液，每皿加90 μL 兔抗ZO-1（按比例為1∶80 進(jìn)行稀釋），在4 ℃孵育14 h。分別在每皿中加入90 μL FITC 標(biāo)記山羊抗兔IgG（按比例為1∶100 進(jìn)行稀釋），室溫孵育2 h。

F-actin 蛋白染色：采用上述固定方法進(jìn)行固定后，PBS 溶液清洗3 次，每皿加入1 mL 1% Triton X-100，在室溫中孵育10 min，細(xì)胞打孔后每皿加入90 μL Acti-stain 488 Phalloidin 熒光標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（按比例為1∶80 進(jìn)行稀釋），室溫孵育30 min。緊密連接蛋白染色后每皿滴加90 μL 質(zhì)量濃度為10 μg/mL 的DAPI 工作液，室溫染色10 min，上述每步操作間均用PBS 清洗3 次，最終加入0.5 mL PBS溶液，結(jié)果如圖6所示。

對(duì)照組ZO-1 蛋白邊緣清晰，形態(tài)完整，熒光強(qiáng)度高；F-actin 呈環(huán)狀分布于細(xì)胞周圍清晰明亮，熒光較強(qiáng)。與對(duì)照組相比，DHA 作用前后ZO-1 和F-actin 緊密連接蛋白表達(dá)無顯著性差異，空白自微乳與DHA-SMEDDS 作用后，ZO-1 蛋白熒光強(qiáng)度顯著降低，部分條帶斷裂；F-actin 蛋白熒光強(qiáng)度明顯減弱，緊密連接發(fā)生斷裂。上述結(jié)果表明，DHA-SMEDDS 可以減少ZO-1 和F-actin 緊密連接蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DHA 在MDCK 細(xì)胞旁路被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖6 DHA 及DHA-SMEDDS 對(duì)MDCK 細(xì)胞單層緊密連接蛋白 (ZO-1 和F-actin) 表達(dá)的影響 (標(biāo)尺50 μm)Fig.6 Effects of DHA and DHA-SMEDDS on expression of tight junction proteins (ZO-1 and F-actin) in MDCK cell monolayers (scale 50 μm)

2.9.2 DHA-SMEDDS 對(duì)細(xì)胞膜電位的影響 將匯合至90%的MDCK 細(xì)胞按照1×105個(gè)/cm2的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)24 h。分組和給藥同“2.9.1”項(xiàng)，按分組給藥孵育4 h，棄去藥液，胰酶消化并離心收集細(xì)胞，棄去上清，以PBS 重懸并洗滌細(xì)胞2 次，離心收集細(xì)胞，每管加入1 mL 質(zhì)量濃度為5 μg/mL的熒光染料探針DiBAC4（3），重懸細(xì)胞，在室溫下避光染色30 min，離心收集細(xì)胞，棄去上清后以PBS 重懸并洗滌細(xì)胞3 次并調(diào)整細(xì)胞密度約為l×106個(gè)/mL。細(xì)胞懸液采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，設(shè)置儀器發(fā)射波長為488 nm，激發(fā)波長為530 nm，采用未標(biāo)記熒光的空白細(xì)胞管調(diào)零。結(jié)果見表8。由表8可知，DHA-SMEDDS 組的MDCK 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度相比于對(duì)照組顯著增加（P＜0.05），DHA 組和空白自微乳組雖然與對(duì)照組相比沒有顯著性差異，但表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)。DHA 作用于MDCK 細(xì)胞后可以使細(xì)胞膜電位降低，降低細(xì)胞膜的黏滯性，增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，SMEDDS 包裹DHA 后可以進(jìn)一步加強(qiáng)上述作用，使細(xì)胞去極化，增加細(xì)胞通透性，促進(jìn)藥物的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

表8 DHA 及DHA-SMEDDS 對(duì)MDCK 細(xì)胞膜電位的影響(±s,n=3)Table 8 Effects of DHA and DHA-SMEDDS on MDCK membrane potential (±s,n=3)

表8 DHA 及DHA-SMEDDS 對(duì)MDCK 細(xì)胞膜電位的影響(±s,n=3)Table 8 Effects of DHA and DHA-SMEDDS on MDCK membrane potential (±s,n=3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group

組別 膜電位 (相對(duì)熒光強(qiáng)度)對(duì)照 3 832.3±315.5 DHA 4 242.3±178.4空白自微乳 4 252.0±53.5 DHA-SMEDDS 4 744.3±159.0*

2.9.3 DHA-SMEDDS 對(duì)Ca2+-ATP 酶活性的影響將匯合至90%的MDCK 細(xì)胞按照5×104個(gè)/cm2的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)24 h。分組和給藥同“2.9.1”項(xiàng)，按分組給藥孵育4 h，棄去藥液，胰酶消化并離心收集細(xì)胞，棄去上清，收集細(xì)胞，每管加0.2～0.3 mL 生理鹽水制成細(xì)胞懸液，使用超聲粉碎器破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎懸液采用定磷法測(cè)定Ca2+-ATP酶活性。嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。DHA 與DHA-SMEDDS 作用后MDCK 細(xì)胞Ca2+-ATP 酶活力單位的變化見表9。如表9所示，與對(duì)照組相比，DHA、各組自微乳給藥4 h 后，Ca2+-ATP 酶活性均顯著提高（P＜0.05），DHA-SMEDDS 作用后，Ca2+-ATP 酶活性進(jìn)一步提高，提示該制劑可以增強(qiáng)Ca2+-ATP 酶活性，促進(jìn)藥物跨細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

表9 DHA 及DHA-SMEDDS 對(duì)MDCK 細(xì)胞Ca2+-ATP 酶活性的影響 (±s,n=3)Table 9 Effects of DHA and DHA-SMEDDS on Ca2+-ATPase activity of MDCK cells (±s,n=3)

表9 DHA 及DHA-SMEDDS 對(duì)MDCK 細(xì)胞Ca2+-ATP 酶活性的影響 (±s,n=3)Table 9 Effects of DHA and DHA-SMEDDS on Ca2+-ATPase activity of MDCK cells (±s,n=3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05*P ＜ 0.05 vs control group

組別 Ca2+-ATP 酶/(U·mg?1)對(duì)照 2.601±0.164 DHA 4.076±0.107*空白自微乳 4.481±0.114*DHA-SMEDDS 5.014±0.039*

2.9.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) “2.9.2”“2.9.3”項(xiàng)下所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行處理，各組樣本與對(duì)照組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

DHA 是青蒿素的衍生物，其包含獨(dú)特過氧橋的七元環(huán)結(jié)構(gòu)，抗瘧活性比青蒿素好，但其水溶性差，穩(wěn)定性不佳，易受光照、濕熱的影響[21]。因此，提高藥物的穩(wěn)定性、溶解度和生物利用度是開發(fā)新制劑的研究方向。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA 在水的平衡溶解度為148.1 μg/mL，屬于微溶性藥物；在不同pH 值中的平衡溶解度研究發(fā)現(xiàn)，在pH 5 左右的環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定；DHA 在堿性環(huán)境下會(huì)轉(zhuǎn)化成其他異構(gòu)體，因此在制劑的過程中應(yīng)注意pH 值的控制。

DHA 表觀油水分配系數(shù)研究顯示，DHA 表觀油水分配系數(shù)P為12.238 0（lgP為1.087 7），DHA的脂溶性較強(qiáng)。一般認(rèn)為，適宜的水溶性和脂溶性將有利于藥物吸收，使藥物有效透過生物膜脂質(zhì)雙分子層[22]。SMEDDS 經(jīng)口服入胃液后，形成小乳滴，可以有效增加藥物的溶解度，提高難溶性藥物在體內(nèi)的吸收速度和程度，并具有避免肝首過效應(yīng)的作用，同時(shí)其制備工藝簡單，適應(yīng)于產(chǎn)業(yè)化[23]，因此，考慮將DHA 制成SMEDDS 制劑，以期提高其溶解度和生物利用度。

SMEDDS 制劑中主要包括油相、乳化劑與助乳化劑等處方影響因素，而其乳化效果主要受油相種類的影響，同時(shí)，其粒徑大小及穩(wěn)定性主要由乳化劑決定。助乳化劑的加入可以明顯起到增加SMEDDS 對(duì)藥物的溶解性和穩(wěn)定性的作用，調(diào)節(jié)親水親油平衡值[24]。本研究將 DHA 制成 DHASMEDDS，首先通過溶解度實(shí)驗(yàn)篩選出具有良好溶解性能、成本適宜的MCT 作為油相。通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇具有較好乳化作用的RH40 作為乳化劑。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)僅采用PEG400 為助乳化劑時(shí)，SMEDDS 的穩(wěn)定性較差，易產(chǎn)生分層現(xiàn)象，而采用無水乙醇與PEG400 混合助乳化劑時(shí)，明顯提高了SMEDDS 的穩(wěn)定性。并對(duì)混合助乳化劑的配比進(jìn)行了系統(tǒng)考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEG400 與無水乙醇配比在3∶5～3∶9 時(shí)均具有良好的穩(wěn)定性。

實(shí)驗(yàn)中SMEDDS 粒徑為重要的評(píng)價(jià)指標(biāo)，其測(cè)定方法將影響結(jié)果的判斷，本課題采用單因素實(shí)驗(yàn)考察了稀釋倍數(shù)、溫度等對(duì)制劑自乳化粒徑的影響，結(jié)果顯示，采用37 ℃純化水分別稀釋10、50、100 倍，粒徑測(cè)定無顯著影響；采用25 ℃和37 ℃的純化水稀釋同樣的倍數(shù)，粒徑測(cè)定無顯著影響。

在自微乳初步穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，DHASMEDDS 的微乳液在高速離心實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定；強(qiáng)光照射使得DHA-SMEDDS 的藥物含量下降，SMEDDS不能改變DHA 的光穩(wěn)定性，儲(chǔ)存時(shí)應(yīng)避光；溫度影響實(shí)驗(yàn)表明25 ℃及4 ℃對(duì)DHA-SMEDDS 的穩(wěn)定性無顯著影響，因此，該制劑應(yīng)常溫避光保存。

緊密連接蛋白是調(diào)控細(xì)胞旁路的主要載體，能夠選擇性地調(diào)節(jié)離子、水和水溶性物質(zhì)通過細(xì)胞旁通路的被動(dòng)擴(kuò)散[25]。當(dāng)緊密連接蛋白表達(dá)發(fā)生改變時(shí)，單層膜通透性隨之變化，影響藥物在細(xì)胞旁路的被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)[26]。DHA-SMEDDS 作用后胞質(zhì)附著蛋白ZO-1[27]部分條帶斷裂；細(xì)胞骨架蛋白F-actin[28]緊密連接發(fā)生斷裂、重排，細(xì)胞間隙變大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DHA-SMEDDS 可以下調(diào)MDCK 細(xì)胞的緊密連接蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞的通透性增加，進(jìn)而促進(jìn)DHA 的吸收。

膜電位是細(xì)胞產(chǎn)生的一種促進(jìn)離子、營養(yǎng)物質(zhì)等跨膜運(yùn)輸?shù)碾娢?。?xì)胞膜電位發(fā)生改變時(shí)，通常細(xì)胞膜蛋白結(jié)構(gòu)及其特性例如通透性、黏滯性也會(huì)改變，對(duì)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生影響[29]。DiBAC4（3）是測(cè)量細(xì)胞膜電位的敏感慢響應(yīng)負(fù)離子熒光探針，DiBAC4（3）進(jìn)入細(xì)胞，熒光強(qiáng)度越大，細(xì)胞膜電位越低，細(xì)胞去極化[30]。DHA-SMEDDS 作用后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度升高，細(xì)胞膜電位降低，使細(xì)胞通透性增加，促進(jìn)藥物被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

Ca2+是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信使，可以調(diào)控多種細(xì)胞的生理功能，細(xì)胞內(nèi)外Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)速度以及濃度受Ca2+-ATP 酶影響，Ca2+-ATP 酶參與細(xì)胞調(diào)節(jié)，使細(xì)胞發(fā)揮正常功能[31]。MDCK 細(xì)胞Ca2+-ATP 酶活性影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DHA 能夠增加Ca2+-ATP酶活性，DHA-SMEDDS 能夠加強(qiáng)該作用，若DHA與主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物連用制成SMEDDS 制劑，可以促進(jìn)藥物跨細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)。

本研究利用SMEDDS 技術(shù)制備了載藥量高、粒徑小的DHA-SMEDDS，相比于雙氫青蒿素脂質(zhì)體[5]，SMEDDS 制備工藝更加簡單，易于產(chǎn)業(yè)化；與環(huán)糊精包合物[6]相比，本研究中制劑的包封率更高，更利于促進(jìn)藥物在體內(nèi)的吸收，從而提高其口服生物利用度，為該品種的后續(xù)研究與開發(fā)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突