楊睿，李娟，龍健，廖洪凱，王顯，李宜蓉

1.貴州師范大學(xué)/貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550001；2.貴州師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550001

貴州喀斯特地區(qū)地形地貌復(fù)雜，地表植被覆蓋率低，土壤侵蝕退化造成水土流失嚴(yán)重，大面積巖石裸露，形成大量的溶溝、石芽、石縫，加之人為活動(dòng)干擾，石漠化愈發(fā)嚴(yán)重且有蔓延趨勢，這已經(jīng)成為巖溶地區(qū)最大的生態(tài)問題（孫建等，2019）。花江喀斯特大峽谷隸屬于貴州省關(guān)嶺縣板貴鄉(xiāng)，該區(qū)域?qū)俚湫涂λ固厣?，為改善生態(tài)環(huán)境和增加農(nóng)民收入，該地區(qū)于 1999年種植 328 hm2花椒（Zanthoxylumbungeamun）林，從開始發(fā)展至今長達(dá) 20余年。在長期生產(chǎn)經(jīng)營過程中土壤性質(zhì)有朝鹽堿化、板結(jié)、土壤中毒、生物活性變化等方向發(fā)展的趨勢（王程等，2019；王宏，2018），地力衰退影響植物養(yǎng)分供給平衡，同時(shí)引起土壤微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化。根際是指受植物根系活動(dòng)影響，在物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)上不同于土體的那部分微域土區(qū)（鄭毅等，2003），根區(qū)土壤環(huán)境對植物根系有效地吸收水分和養(yǎng)分有著積極的意義，根際微生物在改善植物根際微生態(tài)平衡方面的巨大潛力已經(jīng)得到充分認(rèn)可（葉雯等，2018）。根際土壤中的細(xì)菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)中貢獻(xiàn)最大的類群，它們對環(huán)境改變特別敏感，特別是少數(shù)高豐度物種與多數(shù)低豐度物種比整個(gè)微生物群體更容易受土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的影響（蔣景龍等，2018）。有研究表明三葉赤楠（Syzygiumgrijsii）根際細(xì)菌多樣性隨著種植時(shí)間的增加而增加（劉瑋等，2010）；還有研究表明獼猴桃（Kiwifruitorchards）細(xì)菌群落多樣性隨著種植年限增加而顯著降低（朱海云等，2019）；油用牡丹（Paeoniaostia）根際細(xì)菌菌群豐度和多樣性隨著種植年限增加而降低（郭麗麗等，2017）；也有研究表明寧夏枸杞（Lyciumbarbarum）根際細(xì)菌多樣性隨著種植年限的增加而降低（肖龍敏等，2018），基于以上研究可知種植年限會(huì)對不同植物細(xì)菌群落產(chǎn)生不同的影響。

花椒是蕓香科花椒屬落葉灌木或小喬木（喻陽華等，2018）。由于植株較小，根系分布淺，保水固土能力好，常用于鈣質(zhì)土山地造林（王鈺等，2007）。目前關(guān)于花椒生長狀況、土壤理化指標(biāo)的研究主要集中在表層土壤多種形態(tài)有機(jī)碳的含量變化（張文娟等，2015；廖洪凱等，2015；龍健等，2018）、根系分布抗旱特征（容麗等，2007）、土壤酶活性變化（劉姣姣等，2019）等方面，并取得了一些成果。但對花椒不同種植年限根際土壤理化指標(biāo)變化情況、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異及二者的關(guān)系尚未明確。

因此，本研究基于花椒的不同生長年限，測定花椒根際土壤理化指標(biāo)，并采用高通量 16S rRNA測序技術(shù)測定根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，分析土壤理化指標(biāo)與細(xì)菌豐富和稀有類群的關(guān)系，以期找出影響花椒根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要因子及預(yù)測隨著生長年限變化花椒土壤環(huán)境致病菌的演替規(guī)律，為解決花椒林地力衰退和指導(dǎo)貴州喀斯特地區(qū)花椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于貴州省安順地區(qū)關(guān)嶺縣花江干熱河谷小流域（25°39.8′—25°40.0′N，105°39.3′—106°39.7′E），海拔 600—1200 m。該地區(qū)碳酸巖鹽廣布，水熱充沛，降水分布不均勻，5—10月降水量達(dá)全年降水量的83%，氣候垂直變化明顯，多以熱帶河谷氣候?yàn)橹?。該區(qū)域白云質(zhì)和泥質(zhì)灰?guī)r較多，土壤類型大部分是黑色和棕黃色石灰土。土壤結(jié)構(gòu)不良、質(zhì)地粘重、且富含較高的鈣質(zhì)。該地區(qū)植被總體覆蓋率＜3%，巖石裸露率為70%以上，植被郁閉度低，生境干旱顯著，非耕地資源豐富。當(dāng)?shù)氐幕ń芳兞謴?992年開始有規(guī)模種植，1995年開始成熟，至 2000年左右進(jìn)入豐產(chǎn)期，主要是選擇溝穴或石穴種植，多為一穴一株，單株花椒具有相對獨(dú)立的生長空間，除花椒（Zanthoxylumbungeanum）外，還有少量草本植物伴生，如蒲公英（Taraxacummongolicum）、仙人掌（Opuntia dillenii）、扭黃茅（Heteropogoncontortus）等。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集與分析

于2019年4月在貴州省關(guān)嶺花江地區(qū)選取5、10、20、30 a生長狀況相近，管理措施相同的健康花椒3株，采集其根際土。土樣采集過程為：去除地表凋落物，選取細(xì)根比較發(fā)達(dá)的地方，利用根鉆按五點(diǎn)取樣法采集各范圍內(nèi)0—10 cm深土壤2 kg，取樣后按四分法混勻，共獲得 12個(gè)土壤樣品。將采集到的土壤樣品分兩份，一份用保鮮袋封裝，用于土壤理化因子分析；另一份裝于無菌采樣袋用于土壤細(xì)菌群落的測定。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)分析參考鮑士旦《土壤農(nóng)化分析》第3版（鮑士旦，2000）。其中pH值測定采用玻璃電極法，有機(jī)質(zhì)測定采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法，含水率（SMC）測定采用烘箱(105±2) ℃烘干法，有效磷測定采用鹽酸-氟化銨提取-鉬銻抗比色法，銨態(tài)氮測定采用靛酚藍(lán)比色法，硝態(tài)氮測定采用氯化鉀浸提-紫外分光光度法。

1.2.3 土壤微生物分析

DNA提取及質(zhì)量檢測：根據(jù) E.Z.N.A soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S）說明書取0.5 g土壤進(jìn)行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

文庫制備：338F 5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCAG-3′和 806R 5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′引物對 16S rRNA V3—V4區(qū)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增（PCR儀：ABIGene Amp?9700型），擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增體系為 20 μL，4 μL 5×FastPfu 緩沖液，2 μL 2.5 mmol·L?1d NTPs，0.8 μL5 mmol·L?1引物，0.4 μL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板，滅菌dd H2O補(bǔ)足 20 μL。

Illumina Miseq測序：使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用 AxyPrep DNA GelExtraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluorTM-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illu-mina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE2×300的文庫。構(gòu)建文庫步驟：（1）連接“Y”字形接頭；（2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；（3）利用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富集；（4）氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

土壤細(xì)菌16S rRNA數(shù)據(jù)處理：（1）基于usearch、vsearch軟件處理下機(jī)序列，主要利用unoise3去除嵌合體并經(jīng)后續(xù)處理[https://github.com/torognes/vsearch/releases，http://www.drive5.com/usearch/]，獲得代表序列和OTU表。（2）采用樸素貝葉斯算法訓(xùn)練特征分類器（基于Silva 132版本數(shù)據(jù)庫），利用代表序列和特征分類器進(jìn)行進(jìn)一步訓(xùn)練，得到物種注釋文件。（3）基于Unoise方法，將OTU表與注釋文件進(jìn)行匹配，即得到物種的分類水平。（4）利用QIIME2插件“qiime diversity core-metrics-phylogenetic”、“qiime diversity alpha”計(jì)算多樣性指數(shù)（Vázquez et al.，2013）。

式中，Sobs為實(shí)際測量出的OTU數(shù)目；ni為含有i條序列的OTU數(shù)目；N為所有的序列數(shù)

式中，Schao1為估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs為觀測到的OTU數(shù)；n1為只有一條序列的OTU數(shù)目；n2為只有兩條序列的OTU數(shù)目。

Simpson為隨機(jī)取樣的兩個(gè)個(gè)體屬于不同種的概率；Observed_otus為樣本優(yōu)化序列得到的 OUT數(shù)目。

（5）刪掉 reads＜20的 OTU，將相對豐度在所有樣本中≥0.01和在所有樣本中≥0.0001并且在某些樣本中＞0.01的OTU劃為豐富類群，相對豐度在所有樣本中＜0.0001和在一些樣本中＜0.0001并都＜0.01的OTU劃為稀有類群。將篩選的豐富類群、稀有類群用于分析物種在進(jìn)化過程中與環(huán)境因子的關(guān)系（Dai et al.，2017）。（6）基于 QIIME1.91使用“pick_closed_reference_otus.py”分析，獲得的OTU表的biom文件用于BugBase預(yù)測，參考OTU預(yù)先計(jì)算的基因組含量預(yù)測生物樣品中每個(gè) OTU的性狀覆蓋率。在所有生物樣品不同覆蓋閾值下，計(jì)算特質(zhì)豐度。這些豐度估計(jì)值用于標(biāo)識覆蓋率閾值，從而提供跨樣本的最高方差。數(shù)據(jù)集中的OTU通過16S拷貝數(shù)進(jìn)行歸一化，并預(yù)測每種性狀的微生物組表型，并將其繪制為每種樣品的性狀相對豐度（表型相對豐度）。

以最小顯著差異法（LSD）檢驗(yàn)不同年限根際土壤理化因子的差異情況，vegan包c(diǎn)mdscale函數(shù)作PCoA分析，并以adonis函數(shù)對群落顯著性差異進(jìn)行檢驗(yàn)，RDA函數(shù)做冗余分析。以 indicspecies包strassoc函數(shù)尋找花椒不同種植年限指示種，然后用pheatmap包繪制熱圖。用ggtree包繪制進(jìn)化樹熱圖，系統(tǒng)發(fā)育樹是使用鄰接法構(gòu)建的，可以分配給科級別的分類單元顯示為科，否則顯示為 OTU ID。K值是使用“picante”R包中的“multiPhylosignal”函數(shù)計(jì)算得出的進(jìn)化信號。K值描述了在基于布朗運(yùn)動(dòng)的系統(tǒng)發(fā)生信號強(qiáng)度度量中，分類單元與系統(tǒng)發(fā)生的相關(guān)程度如何。K值接近零表示進(jìn)化的隨機(jī)或收斂模式，而K值大于1表示強(qiáng)烈的系統(tǒng)發(fā)生信號和性狀保守性。其余圖采用ggplot 2包繪制，上述數(shù)據(jù)處理過程和圖的繪制均在R語言（4.0版本）中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同年限花椒林根際土壤理化性質(zhì)

如表1所示，隨著年限增加花椒根際土壤含水率呈現(xiàn)上升趨勢，不同種植年限間出現(xiàn)差異，但未達(dá)到顯著水平（P＞0.05）。pH隨著年限增加則出現(xiàn)先升高后降低的趨勢，30 a與其他3個(gè)年限均未出現(xiàn)顯著差異（P＞0.05）。有效磷含量隨著年限增加其含量先降低后升高，在10 a達(dá)到最低值。有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量隨著年限增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，均在20 a達(dá)到最低值。

表1 不同種植年限花椒根際土壤理化因子Table 1 Physicochemical factors of rhizosphere soil of Zanthoxylum bungeanum in different planting years

2.2 不同年限花椒林根際土壤細(xì)菌α多樣性分析

在97%分類水平下，不同年限Observed_otus、Chaol、Shannon和Simpson指數(shù)存在差異，但均未達(dá)到顯著水平（P＞0.05，圖1）。Shannon指數(shù)可以同時(shí)反映群落豐富度以及均勻度，其值隨著種植年限的增加而升高，即 5 a＜10 a＜20 a＜30 a。Simpson指數(shù)可以指示優(yōu)勢物種相對豐度高低，其在5 a達(dá)到最低值，30 a達(dá)到最高值。Observed_otus、Chao1指數(shù)用來估計(jì)群落中實(shí)際存在的物種數(shù)，10 a花椒根際土壤樣本的Chao 1指數(shù)和Observed_otus指數(shù)與其他3個(gè)種植年限相比最小，說明種植年限影響細(xì)菌的豐富度和多樣性，但其影響程度在不同年限間差異較大。

圖1 不同種植年限花椒根際土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Fig.1 Bacterial community α diversity index of different planting years in the rhizosphere soil of Zanthoxylum bungeanum

2.3 不同種植年限花椒根際土壤細(xì)菌群落差異分析

本研究利用主坐標(biāo)（PCoA）分析，通過分析不同樣本群落組成，反映樣本間的差異和距離（圖2a），第一、二主軸共解釋了樣本信息的63.79%。10、20、30 a在0.95置信水平下，置信橢圓有重疊，說明隨著種植時(shí)間的增加，根際細(xì)菌群落組成漸趨于相似。5 a與其他年限樣本橢圓無重疊，說明它與其他年限細(xì)菌群落組成差異較大，Adonis檢驗(yàn)結(jié)果說明4種年限細(xì)菌群落組成差異顯著（r2=0.65，P＜0.001）。為進(jìn)一步探索細(xì)菌隨花椒種植年限變化的潛在規(guī)律，通過指示種分析（圖2b）得出，5 a差異指示種為 Firmicutes，10 a為 Cyanobacteria，20 a為Planctomycetes，30 a為 Entotheonellaeota。相對豐度圖（圖 3）也驗(yàn)證了隨著種植年限的增加，F(xiàn)irmicutes相對豐度在 5 a較其他年限高，Cyanobacteria逐漸消失，Planctomycetes在20 a比較突出，30 a 則Entotheonellaeota相對豐度高于其他年限。

圖2 不同種植年限根際土壤細(xì)菌門水平PCoA分析（a）和熱圖分析（b）Fig.2 PCoA analysis (a) and heatmap analysis (b) of rhizosphere soil bacterial phylum levels in different planting years

圖3 不同種植年限根際土壤細(xì)菌差異指示種相對豐度圖Fig.3 Relative abundance of difference indicator species in different planting years

不同年限花椒根際土壤細(xì)菌綱水平統(tǒng)計(jì)分析（圖4）發(fā)現(xiàn)：Actinobacteria（放線菌綱）、Bacilli（芽孢桿菌綱）、Saccharimonadia、Subgroup 25隨年限增加相對豐度逐漸下降；Thermoleophilia（嗜熱菌綱）、Chloroflexia（綠彎菌綱）、Blastocatellia（Subgroup 4）、Acidimicrobiia（酸微菌綱）、Gemmatimonadetes（芽單胞菌綱）、MB-A2-108、NC10、TK10、Acidobacteriia（酸桿菌綱）、KD4-96、JG30-KF-CM66、Verrucomicrobiae（疣微菌綱）隨著年限增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。其中Thermoleophilia、Chloroflexia、Blastocatellia（Subgroup 4）、Gemmatimonadetes、NC10、Acidobacteriia、Verrucomicrobia在10 a達(dá)到最高值，Acidimicrobiia、MB-A2-108、TK10、KD4-96、JG30-KF-CM66在20 a達(dá)到最高值。

圖4 不同種植年限根際土壤細(xì)菌綱水平相對豐度圖Fig.4 Relative abundance of bacteria at class level in rhizosphere soils of different years

2.4 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

RDA分析表明，第一、二主軸共解釋了細(xì)菌門水平組成方差的56.35%（P＜0.05，圖5）?？傮w上，有機(jī)質(zhì)是影響整個(gè)群落分布的首要因子。不同的菌門與各個(gè)環(huán)境因子相關(guān)性不同，環(huán)境因子與物種之間夾角為銳角，說明存在正相關(guān)關(guān)系，反之，鈍角則為負(fù)相關(guān)關(guān)系。用篩選出的豐富類群（OTU）和稀有類群（OTU）分別做進(jìn)化分析和潛在性狀相關(guān)性分析（圖6），放線菌為豐富、稀有類群中的優(yōu)勢菌門，并且總體上與潛在性狀呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。此外，豐富分類群獨(dú)有己科河菌門和硝化螺旋菌門，稀有類群特有厚壁菌門和Patescibacteria?？傮w上豐富類群與 SOM 呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，稀有類群與AP呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，豐富類群與潛在性狀的顯著相關(guān)性較稀有類群多。通過計(jì)算K值發(fā)現(xiàn)稀有類群較豐富類群具有更強(qiáng)的發(fā)育信號（圖7），說明稀有細(xì)菌比豐富細(xì)菌對農(nóng)田生態(tài)環(huán)境偏好具有較強(qiáng)的系統(tǒng)發(fā)育保守性。

圖5 基于門水平下土壤不同菌門與理化因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of different bacteria and physical and chemical factors in soil based on phylum level

圖6 豐富類群與稀有類群的系統(tǒng)發(fā)育分布及其與環(huán)境因子的相關(guān)性分析Fig.6 The phylogenetic distribution of abundant taxa and rare taxa and their correlation analysis with environmental factors

圖7 豐富和稀有類群的系統(tǒng)發(fā)生信號（布郎伯格K值）Fig.7 Phylogenetic signals of abundant and rare taxa (Blomberg’s K)

2.5 BugBase細(xì)菌表型預(yù)測分析

BugBase細(xì)菌表型預(yù)測結(jié)果表明，好氧細(xì)菌隨著年限的增加呈現(xiàn)上升趨勢（圖 8），厭氧細(xì)菌隨著年限的增加大體呈現(xiàn)下降趨勢，酸桿菌門占主體地位（圖9）。氧化脅迫耐受細(xì)菌總體看在20、30 a大于5、10 a，大部分取決于放線菌門的作用（圖10），5、10 a致病潛力細(xì)菌高于20、30 a，主要是由酸桿菌門驅(qū)使的，歸因于變形菌門豐度差異（圖11）。

圖8 不同種植年限根際土壤好氧菌的表型相對豐度Fig.8 Phenotypic relative abundance of aerobic bacteria in rhizosphere soil of different planting years

圖9 不同種植年限根際土壤厭氧菌的表型相對豐度Fig.9 Phenotypic relative abundance of anaerobic bacteria in rhizosphere soil of different planting years

圖10 不同種植年限根際土壤氧化耐受脅迫菌的表型相對豐度Fig.10 Phenotypic relative abundance of oxidative stress-tolerant bacteria in rhizosphere soil of different planting years

圖11 不同種植年限根際土壤致病菌的表型相對豐度Fig.11 Phenotypic relative abundance of pathogenic bacteria in rhizosphere soil of different planting years

3 討論

中國西南喀斯特是巖溶發(fā)育最強(qiáng)烈的地區(qū)，由于碳酸鹽巖的風(fēng)化溶蝕和地表徑流的沖刷過程逐漸形成石槽、石溝、石坑等微地貌造成喀斯特地區(qū)土層厚度不均、分布不勻，農(nóng)業(yè)可持續(xù)利用的土地少之又少（黃鈺鈴等，2006），花椒作為當(dāng)?shù)鼗謴?fù)退化喀斯特生態(tài)環(huán)境的重要物種，研究根區(qū)土壤環(huán)境對花椒的生長發(fā)育有著積極的意義。本研究對土壤理化性質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn)，隨種植年限的增加根際土壤含水率、pH、有效磷含量呈現(xiàn)上升趨勢，這可能與花椒根系擴(kuò)散速率提高，大量根毛利用地表淺層水能力上升有關(guān)（牛曉麗等，2014）。此外花椒屬于喜鈣物種，易吸收鈣鎂等離子，使得根際凝聚大量鹽基離子導(dǎo)致pH升高（車家驤等，2008）。隨著pH的增加，磷元素易被土壤黏粒和陽離子（Fe3+、Ca2+和Al3+等）吸附、固定（秦昌鮮等，2019），此時(shí)植株會(huì)誘導(dǎo)根系分泌更多磷酸酶或植酸酶，進(jìn)而有效地促使難溶性磷水解轉(zhuǎn)化成植物根系直接利用的磷，提高了根際磷素的利用效率（李慧敏等，2020）。本研究還發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，是因?yàn)殡S著花椒生長，根系分泌酸類、多聚物類和碳水化合物質(zhì)增多（羅永清等，2019），從而影響微生物大量繁殖，種間競爭加速了有機(jī)質(zhì)的分解（李艷春等，2019；張強(qiáng)等，2009）。而土壤氮素水平與有機(jī)質(zhì)密切相關(guān)，間接促進(jìn)了土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的供給。

植物-土壤之間的相互作用影響著微生物群落變化，而土壤細(xì)菌群落多樣性水平對保持農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定和功能恢復(fù)起決定性的作用（王秋紅等，2018）。有研究發(fā)現(xiàn)，植被群落多樣性提高，有助于促進(jìn)地下部分有益拮抗菌的聚集生長（Latz et al.，2012），本研究中隨著年限增長，花椒根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性逐漸提高，但在發(fā)育初期細(xì)菌群落優(yōu)勢物種相對豐度低于發(fā)育后期，可能是因?yàn)楦低ㄟ^向土壤中分泌大量有機(jī)碳和抗菌等物質(zhì)“招募”對其生長發(fā)育有益的根際促生菌在根系周圍聚集，使得發(fā)育初期和后期細(xì)菌組成出現(xiàn)差異（葛藝等，2019）。還有研究表明，藥用植物懷牛膝（Achyranthesbidentata）在長期種植后，根際土壤微生物中養(yǎng)分循環(huán)相關(guān)微生物增加，其品質(zhì)、產(chǎn)量等得到提高（于佳月，2019），推測花椒長期種植吸引了更多參與土壤養(yǎng)分物質(zhì)循環(huán)的物種導(dǎo)致多樣性提高。其次，不同年限根際土壤中出現(xiàn)差異物種，是因?yàn)橹参锞哂懈H選擇作用且不同階段對微生物的喜好不同（Hartmann et al.，2009）。本研究中5 a根際土壤中厚壁菌門作為差異指示種，可能是因?yàn)樵诨ń钒l(fā)育初期土壤中像有機(jī)質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)較高，吸引發(fā)酵和固氮性物種聚集。到中后期光合作用的增強(qiáng)，根系分泌的光同化物產(chǎn)物的增多影響了不同物種對資源的利用傾向（田平雅等，2020；Pérez et al.，2019）導(dǎo)致光合放氧，生物固氮的Cyanobacteria（藍(lán)藻菌門）和在缺氧環(huán)境下能利用亞硝酸鹽（NO2?）、氧化銨離子（NH4+）生存的Planctomycetes（浮霉菌門）的富集（陸玉芳等，2020）。但隨著發(fā)育時(shí)間的增加群落結(jié)構(gòu)組成會(huì)逐漸相似。大量研究報(bào)道了土壤理化性質(zhì)也是影響土壤細(xì)菌群落組成的重要因素（陳海濱等，2016；Pei et al.，2016；Zhalnia et al.，2015）。本研究中隨著種植時(shí)間的增加根際含水率呈上升趨勢，而腸桿菌對含水率比較敏感且它的纖毛對植物根的粘附能力很強(qiáng)導(dǎo)致在 30 a其相對豐度增加。隨著年限增加，放線菌綱、芽孢桿菌綱呈現(xiàn)下降趨勢，而綠彎菌綱、嗜熱菌綱、芽單胞菌綱、酸桿菌綱在10 a出現(xiàn)最高值，酸微菌綱在20 a出現(xiàn)最高值，說明隨著種植時(shí)間的增加，進(jìn)行化學(xué)循環(huán)細(xì)菌的改變可能會(huì)影響土壤肥力變化?；谵r(nóng)業(yè)土壤細(xì)菌群落，有研究發(fā)現(xiàn)豐富類群會(huì)競爭性地利用多種資源并得到很好的適應(yīng)（Pedrós-Alió et al.，2006），而稀有類群的競爭能力較低，生長會(huì)受到限制（Ramiro et al.，2015）。本研究中與豐富類群相比，稀有類群具有更強(qiáng)的系統(tǒng)發(fā)生信號，表明花椒根際土壤環(huán)境可能更適應(yīng)稀有類群，稀有類群作為微生物的“種子庫”，它們可以在適當(dāng)條件下成為優(yōu)勢種，從而增加抗環(huán)境干擾的能力。（Jiao et al.，2020）。對不同年限根際土壤的BugBase預(yù)測得到，種植時(shí)間越長土壤好氧細(xì)菌豐度越高，相反，厭氧細(xì)菌的生長就會(huì)受到抑制。酸桿菌門喜歡厭氧和微氧環(huán)境，根際較低pH值（分泌有機(jī)酸）有利于酸桿菌某些亞群的生長，但根際的高營養(yǎng)環(huán)境又不適于酸桿菌的生存，因此根際微環(huán)境的差異導(dǎo)致不同年限根際酸桿菌不一致（王光華等，2016）。致病菌在前期比例較高，表明花椒在發(fā)育初期受病原菌侵染的風(fēng)險(xiǎn)較高，隨著一定時(shí)間發(fā)育根際氧化脅迫耐受菌增加使得花椒抗病原菌侵染的能力上升。耐受菌大部分屬于革蘭氏陽性菌，而致病菌多屬于革蘭氏陰性菌，一般認(rèn)為酸桿菌門和硝化螺旋菌門不具有致病性，所以推測花椒潛在致病菌來源于變形菌門。有研究發(fā)現(xiàn)放線菌門具有抗壓和抗病原菌感染的能力（Vries et al.，2020），在本研究中放線菌門作為稀有和豐富類群中主要菌門，因此它可能在花椒適應(yīng)環(huán)境脅迫中具有重要潛能。研究表明土壤中致病菌豐度較高導(dǎo)致作物發(fā)病，其分泌有毒有害物質(zhì)會(huì)造成植株矮黃、生長不良、根系分叉多等不良影響，最終導(dǎo)致作物減產(chǎn)（周文杰等，2016）。因此建議在花椒發(fā)育前期進(jìn)行合理有機(jī)栽培管理，適當(dāng)翻耕，以促進(jìn)微生物與植物互作，提高作物抗性。

4 結(jié)論

長期種植花椒導(dǎo)致根際土壤有效磷、有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮含量先降低后升高，表明花椒長期種植在一定程度上改善了土壤質(zhì)量，對喀斯特生態(tài)環(huán)境恢復(fù)有促進(jìn)作用。測序結(jié)果表明，花椒根際細(xì)菌群落多樣性隨種植年限增加而增加，豐富度在10 a時(shí)顯著降低（與種植5 a和20、30 a花椒相比），表明花椒根際土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性受種植年限影響較大。對微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，在不同種植年限花椒根際土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。RDA分析結(jié)果表明土壤有機(jī)質(zhì)是影響花椒根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的重要因子。表型預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)隨著種植時(shí)間的增加，花椒根際抗脅迫耐受物種的增加降低了潛在致病風(fēng)險(xiǎn)。