匡宇明 張繼榮 賀秀玲

黑龍江省傳染病防治院藥劑科，黑龍江哈爾濱 150500

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在藥學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、化工等許多領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，可以對體內(nèi)藥物及代謝產(chǎn)物、藥物合成中間體、基因工程產(chǎn)品等進(jìn)行定性鑒定和定量測定，解決單純用液相色譜或質(zhì)譜不能解決的許多問題。超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）理論認(rèn)為提高色譜柱的效能就能增加儀器的解析度，而運(yùn)用粒徑低于2 μm 的小顆粒無疑是增加效能的好方法。但減小固定相的粒度以增加色譜柱效能一直是色譜儀器科學(xué)的瓶頸，因?yàn)樾☆w粒不僅要求系統(tǒng)能承受高于目前極限壓力，需要更小的系統(tǒng)體積，并且需要能適應(yīng)可能只有幾秒峰寬的高速檢測器[1-6]。與傳統(tǒng)的高效液相色譜相比，UPLC 具有以下優(yōu)勢：高分離度，高速度，靈敏度。過去對于提高靈敏度的研究大都集中于檢測器上，不論是光學(xué)檢測器還是質(zhì)量檢測器。但是，其實(shí)運(yùn)用UPLC 也能提高分析的靈敏度。目前，UPLC 多應(yīng)用于代謝組學(xué)分析及其他一些生化領(lǐng)域，在分析化學(xué)和藥物分析的分析方面運(yùn)用也逐漸興起，因?yàn)樵谶@些領(lǐng)域深入研究需要更高的分析精度。使用UPLC 質(zhì)譜檢測器連接，對樣品分析，特別是中藥研究領(lǐng)域的發(fā)展將是一個極大的促進(jìn)[7-11]。

當(dāng)前對于氨基酸測定有許多種方法，其中主要有高效液相色譜法、氨基酸分析法和高效液相色譜質(zhì)譜法三類。前兩個方法對樣品需要衍生化，分析效率低，分析時間長，樣品中的其他氨基酸容易影響谷氨酰胺的分離，這使得難以準(zhǔn)確量化，也會帶來定量誤差[12-16]。運(yùn)用UPLC-串聯(lián)質(zhì)譜方法（UPLC-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測氨基酸，充分運(yùn)用高效液相色譜法可分離復(fù)雜樣品的能力和質(zhì)譜檢測法的高選擇性和靈敏度特點(diǎn)，在生物樣品中的應(yīng)用具有優(yōu)勢[17-19]。本研究采用UPLC-MS/MS 對谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺含量進(jìn)行測定，為此類產(chǎn)品質(zhì)量控制和安全性評價提供方法。

1 儀器與試劑

LCMS-8050 島津三重四級桿質(zhì)譜儀[島津企業(yè)管理（中國）有限公司/島津（香港）有限公司]，配備電噴霧離子源；LC-30A 島津超高效液相色譜儀（上海皖寧精密科學(xué)儀器有限公司）；色譜柱AtiantisT3 柱（1100mm×2 mm，3 μm）；SIL-30AC 自動進(jìn)樣；CTO-20AC 柱溫箱；CBM-20A 系統(tǒng)控制器。谷氨酰胺對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量99.7%）；乙腈（色譜純）；甲酸（色譜純）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Atiantis T3 柱（1100 mm×2 mm，3 μm），柱溫38℃，流動相以0.1%甲酸水溶液∶乙腈，流速0.30 mL/min，進(jìn)樣量：1 μL，保留時間（tR）=1.3 min，理論塔板數(shù)N=2×104，分離度R=2。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式對谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺含量進(jìn)行測定。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；離子檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；離子極性：負(fù)離子；電噴霧離子源，離子源接口電壓：-3.0 kV；霧化氣：氮?dú)猓?.0 L/min；干燥氣：氮?dú)猓?0 L/min；加熱氣：空氣，10 L/min；碰撞氣：氬氣；接口溫度：300℃。谷氨酰胺質(zhì)譜分析條件參數(shù)如下：成分，谷氨酰胺；定量離子（m/z），146.10>128.26；Q1 Prerod bias（V），26；CE（V），15.0；Q3 Prerod bias（V），31.0。

2.3 對照品和供試品溶液制備

2.3.1 對照品溶液制備 谷氨酰胺對照品配制成濃度為0.1238、1.2380、4.9510、12.3800、19.7800、24.7700 μg/mL的對照品系列溶液。取樣品300 μL，加500 μL 乙腈沉淀蛋白，混勻后，上清液中谷氨酰胺濃度若不在對照品系列溶液濃度范圍內(nèi)，加水稀釋。

2.3.2 供試品溶液制備 精密稱取供試品適量，加流動相適量，超聲處理20 min 使溶解，用流動相定量稀釋成每毫升中含0.32 mg 的溶液，精密量取該溶液與內(nèi)標(biāo)溶液各5 mL，置25 mL 量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即為供試品溶液。

3 結(jié)果

3.1 專屬性實(shí)驗(yàn)

采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，色譜柱為Atiantis T3 柱（1100 mm×2 mm，3 μm），柱溫38℃。流動相以0.1%甲酸水溶液∶乙腈，流速0.30 mL/min，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式，按照“2.1 色譜條件”和“2.2 質(zhì)譜條件”對谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺含量進(jìn)行測定。

分別取空白溶液、對照品溶液和供試液各1 μL注入實(shí)驗(yàn)儀器，根據(jù)上述儀器條件進(jìn)行檢測，分別記錄總離子流圖。谷氨酰胺的保留時間為1.3 min，供試液中谷氨酰胺沒有受到其他成分的干擾。見圖1。

圖1 谷氨酰胺UPLC-MS/MS 總離子流圖

3.2 線性范圍和檢測限

分別取“2.3.1 項”下的谷氨酰胺對照品溶液，根據(jù)對照品濃度，取0.1238、1.2380、4.9510、12.3800、19.7800、24.7700 μg/mL 的對照品系列溶液進(jìn)樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸方程Y=4×10-6X+0.1336，相關(guān)系數(shù)為0.9998。谷氨酰胺在0.1232～24.7100 μg/mL 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

檢測限測定：分別取“2.3.1 項”下的谷氨酰胺對照品溶液用水稀釋，記錄谷氨酰胺濃度，確定檢測限為9.8 ng/mL。

3.3 加樣回收率試驗(yàn)

分別取“2.3.2 項”下的谷氨酰胺樣品溶液6 份，按照“2.1 項”條件進(jìn)樣測定，依據(jù)谷氨酰胺峰面積，計算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.6%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果如表1，當(dāng)理論濃度為61.86 μg/mL，平均加樣回收率為108.3%，RSD=2.2%。當(dāng)理論濃度為123.68 μg/mL，平均加樣回收率為102.8%，RSD=3.2%。當(dāng)理論濃度為206.16 μg/mL，平均加樣回收率為108.9%，RSD=4.8%。測得濃度為65.32 μg/mL，加樣回收率為105.5%。谷氨酰胺常用量在0.5～1.0 mmol/L 之間，加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法能夠滿足谷氨酰胺測定的需要。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.4 樣品測試

分別取“2.3.2 項”下的谷氨酰胺膠囊樣品制備供試液6 份，按照“2.1 項”和“2.2 項”儀器條件進(jìn)行測試，谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺平均含量為110.8 μg/mL。結(jié)果顯示，谷氨酰胺在范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，RSD 為2.2%～4.8%，谷氨酰胺定量限為9.8 ng/mL。

4 討論

谷氨酰胺是白色結(jié)晶或晶性粉末，能溶于水，不溶于甲醇、乙醇、醚、苯、丙酮、氯仿和乙酸乙酯，無臭，稍有甜味。在中性溶液中不穩(wěn)定，在醇、堿或熱水中易分解成谷氨醇或丙酯化為吡咯羧醇，無臭，有微甜味。谷氨酰胺不是必需氨基酸，其在人體內(nèi)可由谷氨酸、纈氨酸、異亮氨酸合成。在疾病、營養(yǎng)狀態(tài)不佳或高強(qiáng)度運(yùn)動等應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體對谷氨酰胺的需求量增加，以致自身合成不能滿足需要。谷氨酰胺是體內(nèi)重要的氨基酸，谷氨酰胺膠囊為硬膠囊，內(nèi)容物為白色或類白色顆粒狀粉未，用于改善胃潰瘍和十二指腸潰瘍的癥狀[20-22]。

目前，醫(yī)院使用高劑量的谷氨酰胺補(bǔ)劑來治療疾?。好刻?0 g 的劑量用于治療大腸炎、節(jié)段性回腸炎和腹瀉，每天40 g 的劑量用于艾滋病患者、進(jìn)行化療的癌癥患者和燒傷患者。目前，許多醫(yī)院已經(jīng)開始對使用谷氨酰胺以縮短住院時間的效果進(jìn)行研究，并且相信使用其作為出生體重較輕嬰兒的營養(yǎng)補(bǔ)充劑是安全的。研究表明[23]，糖尿病患者應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎使用谷氨酰胺作為補(bǔ)劑，因?yàn)樗麄儗劝滨０返拇x過程異于常人。對癌癥患者使用谷氨酰胺作為補(bǔ)劑也有爭議。原因是谷氨酰胺有促進(jìn)細(xì)胞快速分裂的作用，而細(xì)胞快速分裂正是腫瘤的特征。通過減慢身體代謝消耗并增強(qiáng)衰弱的免疫系統(tǒng)，谷氨酰胺能延長癌癥患者的壽命。谷氨酰胺對孕婦是否安全尚無統(tǒng)一定論，羊水中的谷氨酰胺水平很高，但并不知道母乳中的谷氨酰胺水平是否也較高。谷氨酰胺已靜脈輸予早產(chǎn)兒，并未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)。供給動物谷氨酰胺，可使母牛的產(chǎn)奶量增加一倍。如果一位孕婦要求用谷氨酰胺治療，那么保健人員就應(yīng)對其進(jìn)行評價，評估出恰當(dāng)?shù)膭┝?。谷氨酰胺是體內(nèi)重要的氨基酸，盡管如此，服用過量氨基酸均會引起副作用的可能，谷氨酰胺也不例外，其應(yīng)在保健人員的指導(dǎo)下服用。在保健人員的監(jiān)護(hù)下，每天服用40～50 g 的人在數(shù)周的時間內(nèi)尚未有不良反應(yīng)[23-25]。

使用超高性能的液相色譜三重四級棒質(zhì)譜法，分析谷氨酰胺膠囊中的谷氨酰胺含量，其特點(diǎn)為分離所需時間短，特異性強(qiáng)。即便谷氨酰胺不能在色譜柱中與其他氨基酸徹底分離，谷氨酰胺也不會受到檢測器中其他氨基酸的影響。對不含氨基酸需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)處理，要簡化操作過程，提高定量精度，可顯著縮短實(shí)驗(yàn)檢測時間。因此，建立了UPLC-MS/MS 測定谷氨酰胺含量，用于改善胃潰瘍和十二指腸潰瘍的癥狀，本方法操作簡單。

5 小結(jié)

作為腸動力的主要來源，谷氨酰胺對腸道內(nèi)膜的疾病有輔助療效。另外，其能逆轉(zhuǎn)由非類固醇抗炎藥對腸道所造成的損害。谷氨酰胺具有保護(hù)大腦防止氨中毒的功能，所以人們正在研究其對神經(jīng)變性疾病的功效。由于其沒有明顯的副作用，應(yīng)對其予以足夠重視。谷氨酰胺具有保護(hù)大腦的功能，作為大腦的一種能量來源，谷氨酰胺能改善心情，增強(qiáng)智力，并有益于長期與短期記憶。

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析是一種高效互補(bǔ)的分離鑒定技術(shù)，使分離混合物、探索未知物及鑒定新化合物的在線聯(lián)用成為現(xiàn)實(shí)。本研究采用UHPLC-MS/MS 測定了谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺的含量，對該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，為此類產(chǎn)品的質(zhì)量控制和安全評價提供了一種檢測方法。本實(shí)驗(yàn)建立了谷氨酰胺膠囊中谷氨酰胺的含量測定方法，結(jié)果顯示，本方法具有專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確，靈敏，易于操作等優(yōu)點(diǎn)。本方法操作較簡單，方法專屬性、準(zhǔn)確性及靈敏度良好，且測試時間短，可試用于藥物和生物樣品中谷氨酰胺含量的測定。