陳德焱

廣東省陽江市中醫(yī)醫(yī)院骨一科，廣東陽江 529500

中藥和天然產物通常是藥物發(fā)現(xiàn)的最佳來源[1]。柚皮苷又名柚甙、柑橘甙、異橙皮甙，是一種天然化合物，其分子結構如圖1。柚皮苷是中藥骨碎補、枳實、枳殼、橘紅的主要活性成分。柚皮苷是一種天然雙氫黃酮類化合物，得益于其A 環(huán)和B 環(huán)之間不存在共軛關系，其在282 nm 存在強烈的紫外線吸收峰，表現(xiàn)出豐富的生物學活性以及藥理作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，柚皮苷具有保護軟骨組織、促進成骨細胞增殖與分化、抗氧化、抗炎等藥理學作用[2-7]。對于像柚皮苷這樣的天然化合物，關于其毒性和藥物性質的了解往往早于對其作用目標靶點或作用機制的研究及精確了解。因此，關于柚皮苷藥理作用機理、分子靶點的認識，亟須進一步探討。

網絡藥理學是從分子、網絡、細胞，到組織、器官等各個水平上研究藥物治療疾病時引起機體功能變化機制，從微觀（分子、生化網絡水平）到宏觀（組織、器官、整體水平）建立藥物對機體的作用機制的一門學科。采用網絡藥理學的方法探討藥物的分子機制，已經成為當今主流，越來越受到科研工作者們的青睞，因為通過這樣的研究方法可以節(jié)省時間、金錢和精力[8-9]。通過網絡藥理學的方法，可以推斷分子作用靶點及調控通路，有助于藥物的發(fā)現(xiàn)和改善藥物的設計過程，從而解決未滿足的醫(yī)療需求[10]。Ye 等[11-12]通過網絡藥理學的方法，分別明確了辣椒素（capsaicin）和丹參酮Ⅱa（tanshinone Ⅱa）的潛在靶點。作為一種來自于傳統(tǒng)中藥的活性化合物，柚皮苷同樣適合這種類型的分析。因此，本研究借助網絡藥理學的方法，從分子機制探討柚皮苷的分子作用機制。

圖1 柚皮苷的分子結構

1 材料與方法

1.1 柚皮苷的藥理和分子性質評價

從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中獲取柚皮苷吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME）性質評價相關信息，如口服利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（drug-likeness，DL）、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）、分子量（molecular weight，MW）、脂水分配系數(shù)（fractional water accessible surface area of all atoms with negative partial charge，AlogP）、氫鍵供體數(shù)（Hbond donor，Hdon）、拓撲分子極性表面積（topological polar surface A，TPSA）、氫鍵受體數(shù)（Hbond acceptor count，Hacc）、可旋轉鍵（rotating bond，RBN）等。DL 是藥物設計的一種定性概念，用于評估一種化合物的類藥程度，有助于優(yōu)化藥物代謝動力學和藥物性能[13]。TCMSP 和分析平臺收集《中華人民共和國藥典》（2015年版一部）中499 味草藥及其化合物成分的數(shù)據(jù)，還可以提供每個化合物的人體ADME 性質評價數(shù)據(jù)[13]。

1.2 柚皮苷藥物作用靶點查詢

從GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索獲取柚皮苷潛在靶標候選物，根據(jù)評分≥2.0，候選靶點為人類進行靶點篩選。GeneCards 是一個綜合數(shù)據(jù)庫，基本覆蓋了幾大數(shù)據(jù)庫對于基因的分析數(shù)據(jù)，其可以提供簡明的基因組、蛋白質組、轉錄、遺傳和功能上所有已知和預測人類基因。并和Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫進行比對篩選。Uniprot是一個收錄蛋白質序列最廣泛、功能注釋最全面的一個集中收錄蛋白質資源的數(shù)據(jù)庫，并且其能和其他不同功能的數(shù)據(jù)庫相互聯(lián)系。

1.3 GeneMANIA 分析

GeneMANIA（http://www.genemania.org）是一個靈活的、用戶友好的web 界面，用于生成關于基因功能的假設、分析基因列表和為功能分析確定基因的優(yōu)先級[14]。輸入既定的基因列表，GeneMANIA 使用可用的基因組學和蛋白質組數(shù)據(jù)識別功能相似的基因擴展該列表[14]。GeneMANIA 還報告了用于查詢的每個選定數(shù)據(jù)集預測值的權重[14]。

1.4 基因本體論（gene ontology，GO）分析、通路分析及可視化網絡的構建

GO 是描述基因產物功能，廣泛應用在生物信息學領域的一個本體[15]。作為一個廣泛應用于基因功能分類的系統(tǒng)，其涵蓋生物學的三個方面：細胞組分、分子功能、生物功能[15]。GO富集分析應用分子注釋系統(tǒng)（Molecule Annotation System 3.0，MAS 3.0）進行。該系統(tǒng)可以幫助理解基因表達數(shù)據(jù)之間的關系，并提供全面、可視化的有關目標基因的信息。通過MAS 3.0 可以收集到柚皮苷的GO 富集信息和KEGG 通路信息。獲得相關信息后，通過Cytoscape 3.6.1 軟件進行網絡的構建和分析[16]。主要方法及路線見圖2。

圖2 柚皮苷藥理作用機制研究的主要方法及路線

2 結果

2.1 柚皮苷的藥理和分子性質

DL 是用于評估一種化合物類藥程度的指標，有助于優(yōu)化藥物代謝動力學和藥物性能，化合物的DL值≥0.18 被認為篩選中藥生物活性化合物的合適標準[13，17-18]。通過TCMSP 得到的柚皮苷的藥理及分子性質：MW 為580.59，AlogP 為-0.46，Hdon 為8，Hacc 為14，OB 為6.92，BBB 為-3.00，TPSA 為225.06，RBN 為6，DL 為0.78。值得注意的是柚皮苷的DL 值為0.78，遠高于0.18 水平，因此表明柚皮苷可能是一種富有良好前景的藥物。

2.2 靶點預測結果

從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中篩選出Score≥2.0 靶點共19 個，并和Uniprot 數(shù)據(jù)庫比對篩選，其中3 個未找到匹配信息予以剔除，2 個靶點Uniprot 數(shù)據(jù)庫中對應物種非人類。其余靶點及基因如表1所示。

2.3 GeneMANIA 分析結果

在14 個靶標及其相互作用蛋白中，65.18%表現(xiàn)出相似的共表達特征（Co-expression），17.30%存在共同的通路（Pathway），12.39%有著共同的蛋白質域（Shared protein domains），其余結果如物理交互（Physical interactions）、協(xié)同定位（Co-localization）如圖3（封三）所示。

圖3 GeneMANIA 分析結果（見內文第14 頁）

表1 靶點預測結果

2.4 GO 富集和通路分析以及網絡構建

為了進一步研究篩選得到的14 個目標基因，使用MAS 3.0 對交互作用網絡進行分析研究，結果如表2和圖4（封三）所示。前五項功能分別是細胞過程（GO:0009987 cellular process）、生理過程（GO:0007582 physiological process）、生物調節(jié)（GO:0065007 biological regulation）、生物進程的調節(jié)（GO:0050789 regulation of biological process）、發(fā)育過程（GO:0032502 developmental process），共約占46%。KEGG 通路分析排行前25 的通路見表3?；诎悬c及其通路分析結果，通過Cytoscape 3.6.1 進行可視化網絡的構建，如圖5（封三）所示。

圖4 基于MAS 3.0 分析結果（見內文第14 頁）

圖5 柚皮苷-靶點-通路可視化網絡圖（見內文第14 頁）

3 討論

一種化合物的藥物代謝動力學特性及藥物毒性不符合藥物研發(fā)的要求是導致藥物開發(fā)后期失敗的重要原因，越來越多的學者認為這些方面的因素應該在藥物發(fā)現(xiàn)過程中得到優(yōu)先考慮[19]。通過網絡藥理學的方法，可以提高預測和模擬藥代動力學、代謝過程和毒性終點的能力，從而達到簡化和加速藥物發(fā)現(xiàn)過程的目的[19]。

在有機小分子藥物設計中，很多小分子候選化合物往往具有很好的體外活性，但是一旦進入下一步動物實驗的時候，在體的藥理活性常常得不到很好的結果。當出現(xiàn)這種情況的時候往往涉及到藥代動力學范疇，資深藥物化學家克里斯多夫·里賓斯基[20-21]提出篩選類藥分子的五規(guī)則：①化合物的分子量小于500 道爾頓；②化合物結構中的Hdon（包括羥基、氨基等）不超過5 個；③化合物結構中的Hacc 不超過10 個；④化合物的AlogP 在-2～5 之間；⑤化合物中RBN 的數(shù)量不超過10 個。符合里賓斯基無規(guī)則的化合物會有更好的藥代動力學性質，在生物體內代謝過程中會有更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物。在藥物研發(fā)領域，該規(guī)則被應用于對化合物的初篩，以達到摒除那些不適合成為藥物的分子，縮小篩選范圍并降低藥物研發(fā)成本[22]。在長期的實踐過程中，五規(guī)則被簡化為“四規(guī)則”和“三規(guī)則”，“四規(guī)則”去掉了關于RBN 的數(shù)量限制；“三規(guī)則” 則進一步去掉了對Hacc 量的限制[21]。柚皮苷的分子屬性基本能符合“三規(guī)則”。

表2 潛在靶點的GO 富集分析

DL 這一概念是通過對現(xiàn)有小分子藥物和（或）候選藥物物理化學性質和或結構特征的分析而建立起來的，并且被廣泛應用于化合物的篩選，通過DL 可以過濾掉那些藥物代謝動力學性質較差的化合物[23]?；衔锏腄L 值≥0.18 被認為篩選中藥生物活性化合物的合適標準[13，17-18]。

靶標識別是藥物發(fā)現(xiàn)的第一步，越來越多的藥物或活性化合物的作用方式呈現(xiàn)出多靶點的特點[24]。通過網絡藥理學的方法可以預測藥物或活性化合物的作用靶點[24-25]。本研究中，通過這樣的方法得到了柚皮苷的14 個潛在靶標。從通路富集分析結果可知，柚皮苷預測靶點基因主要和癌癥、骨代謝、抗炎、抗氧化等通路相關。其中，柚皮苷可能主要通過Wnt 信號通路、TGF-β 信號通路、MAPK 信號通路、破骨細胞信號通路（Osteoclast differentiation）等直接影響骨代謝，通過P13K-Akt、VEGF 信號通路等間接調節(jié)骨代謝，具有抗骨質疏松的作用。其抗癌機制預測結果主要通過影響內分泌抑制信號通路（Endocrine resistance）、癌癥途徑（Pathways in cancer）、癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等信號通路，抗炎抗氧化機制主要通過干預MAPK 信號通路、TOLL 樣受體信號通路等。目前，柚皮苷的部分靶點相關研究已經明確。Li 等[26]通過實驗證明載柚皮苷殼聚糖底物能通過激活Smad 受體（TGF-β 信號通路中）而激活成骨蛋白Smad 的信號傳導，并證實了柚皮苷能促進成骨蛋白的表達，包括Ⅰ型膠原蛋白、骨唾液酸蛋白以及骨鈣蛋白。這和本研究得到柚皮苷前5 個通路中的膠原分解代謝過程和SMAD 蛋白通路的結果一致。同時研究也證實了柚皮苷能增加成骨細胞標志蛋白（如骨鈣蛋白、骨形成蛋白、骨橋蛋白等）的表達，并且能夠抑制RANKL[re-ceptor activator of nuclear factor-kappa B（NF-κB）ligand]通路，抑制破骨細胞形成，而達到延緩骨質疏松，促進成骨的作用[27-28]。李風波等[29]研究指出，柚皮苷可以下調破骨細胞分化過程中RANK、TRAP、MMP-9、NFATc1、mRNA 以及上調C-fos mRNA 的表達，進而影響破骨分化和骨吸收作用。Song 等[30]通過動物實驗推斷出柚皮苷能通過調節(jié)VEGF/VEGFR-2 通路來激發(fā)血管再生。研究也證實了柚皮苷在抗炎、調脂、抗氧化等的作用機制[31-35]。因此，通過網絡藥理學的方法可預測得到柚皮苷的作用機制呈現(xiàn)多靶點的特性，GeneMANIA分析結果提供了共表達和共同蛋白質域的信息，提示靶標及其相互作用可能具有相同或類似功能。通過對現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘，得到的信息進行整理和分析后得出與臨床實踐和藥理研究結論相似，并且結果更為詳實、可靠。本研究通過MAS 3.0 進行GO 和Pathway 分析，并應用Cytoscape 構建可視化網絡，直觀地展示了得到的結果。

表3 KEGG 通路富集結果

中藥具有多成分的特點，其化合物作用機制也呈現(xiàn)多靶點特性。網絡藥理學的提出和應用，從整體水平以及分子水平為其研究提供了科學的理論和方法，有助于研究中藥天然化合物及新藥的研發(fā)，并且對促進中醫(yī)中藥理論的發(fā)展和中西醫(yī)藥的結合具有深遠的意義。綜合運用網絡藥理學的方法有助于快速全面地預知化合物的藥理作用機制，并為下一步實驗驗證提供指導。