陳子萱 胡宇 田福平 劉新星 李忠旺

摘要：以全葉苦苣菜種子和植株為材料，進行外植體的滅菌、植株再生體系建立研究。結(jié)果表明，全葉苦苣菜的種子和莖段經(jīng)過滅菌，接種到1/2MS培養(yǎng)基上可獲得無菌苗。用于愈傷組織誘導最佳的材料為無菌苗下胚軸，最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L BA +1.5 mg/L 2，4-D，愈傷組織分化最佳培養(yǎng)基為MS+ZT 2.0 mg/L +IAA 0.5 mg/L，分化出的不定芽在培養(yǎng)基1/2MS+IAA 0.2 mg/L上生根效果較好，可以獲得健壯再生植株。試管苗移栽到溫室，成活率可達到95%以上。移栽后植株的植物學性狀和野生植株基本一致。

關(guān)鍵詞：全葉苦苣菜;無菌苗;愈傷組織;再生體系

中圖分類號：S647? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2021）01-0009-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.01.003

Abstract： The seeds and plants the wild resources of Sonchus transcaspicus Nevski were used as materials to do the reseach on sterilization of explants， establishment of plant regeneration system. The results demonstrated that the seeds and stems of Sonchus transcaspicus Nevski are sterilized and inoculated on 1/2MS medium to obtain sterile seedlings. The most suitable material for callus induction is hypocotyl， and the ideal medium is MS+0.5 mg/L BA +1.5 mg/L 2，4-D. The ideal medium for callus differentiation is MS+ZT 2.0 mg/L + IAA 0.5 mg/L， The differentiated cluster buds can be proliferated and cultured by stem cutting. The differentiated adventitious buds have a better rooting effect on the medium 1/2MS+IAA 0.2 mg/L and healthy regenerated plants can be obtained. When the test-tube seedlings are transplanted into a nutrient bowl in greenhouse， the survival rate can reach more than 95%. The tube seedlings stable planted maintained all botany characteristics of the wild Sonchus transcaspicus Nevski.

Key words：Sonchus transcaspicus Nevski;Sterile seedling;Callus;Regeneration system

全葉苦苣菜（Sonchus transcaspicus Nevski）俗稱苦菜、苦苣菜，菊科苦苣菜屬多年生草本植物?？嘬牟藢僦参镌谑澜缟瞎灿?0種，我國有8種[1 ]。全葉苦苣菜莖葉柔嫩多汁，嫩莖葉含水量高達90%，無刺、無毛、稍有苦味，其嫩莖葉是人們喜食的野菜，也是一種良好的青綠飼料和藥用植物[2 ]。我國苦苣菜屬植物藥用歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》都有記載，其性味苦寒，具有清熱解毒，消腫排膿，涼血化瘀，消食和胃，清肺止咳，益肝利尿之功效，用于治療急性痢疾、腸炎、痔瘡腫痛等癥，還具有抗腫瘤作用，它們當中有些長期被作為我國民間傳統(tǒng)中藥[3 ]。長期以來，采摘全葉苦苣菜使其野生資源遭到嚴重破壞，致使野生全葉苦苣菜大量減少?？嘬牟藢倨渌N植物的組織培養(yǎng)和再生體系的研究已有報道[4 - 8 ]，但未見到全葉苦苣菜的相關(guān)報道。全葉苦苣菜種子繁育比較困難，為滿足大眾對苦苣菜日益增長的需求，我們進行了全葉苦苣菜再生體系研究，以實現(xiàn)全葉苦苣菜的快速繁殖，解決種苗短缺等問題，為全葉苦苣菜的繁育、種質(zhì)的保存、轉(zhuǎn)基因研究等奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1? ?材料和方法

1.1? ?試驗材料

供試材料為全葉苦苣菜種子和健壯的植株，均采自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所蘭州綜合試驗站試驗地。

1.2? ?培養(yǎng)條件

MS培養(yǎng)基中均添加0.5%瓊脂和3.0%蔗糖，1/2MS培養(yǎng)基添加0.5%瓊脂和1.5%蔗糖，pH為5.8。培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中高溫121 ℃，滅菌20 min。培養(yǎng)溫度均為25 ℃，每天光照/黑暗為14 h/10 h，光照強度2 500 lx，相對濕度40%～ 60%。

1.3? ?無菌苗獲得

1.3.1? ? 種子滅菌? ? 將種子去掉絨毛，挑選籽粒飽滿的種子，先用流水沖洗2 h，然后在超凈工作臺進行滅菌處理。用75%乙醇溶液滅菌60 s，再用10%過氧化氫溶液分別滅菌10、15、20 min，最后用0.1%氯化汞溶液分別滅菌5、10 min，滅菌后用無菌水沖洗3～5遍。

1.3.2? ? 植株滅菌? ? 采集的全葉苦苣菜植株帶回實驗室清洗泥沙，修剪成3 cm左右的帶根莖段，流水沖洗2 h以上，以沖洗掉體外的泥污和雜菌。將沖洗好的外植體在超凈工作臺進行滅菌處理。先用無菌水沖洗3遍，再用75%乙醇溶液滅菌30 s，再用10%過氧化氫溶液分別滅菌10 、15 min，然后用0.1%氯化汞溶液分別滅菌5、10、15 min，滅菌后用無菌水沖洗3～5遍。

1.3.3? ? 無菌苗培養(yǎng)? ? 滅完菌的種子和莖段接種到1/2MS培養(yǎng)基誘導萌發(fā)。每個三角瓶接種40粒種子或5個莖段，種子均勻平鋪在培養(yǎng)基表面，莖段將下端插入培養(yǎng)基中，誘導新芽萌發(fā)。

1.4? ?植株再生

1.4.1? ? 愈傷組織誘導? ? 將具有2片真葉的全葉苦苣菜無菌苗根部和上部剪掉，保留子葉以下的下胚軸，切成1 cm左右的段接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基附加KT、6-BA和2，4-D，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導情況。篩選出最佳愈傷誘導培養(yǎng)基后，將具有5～6個葉片試管苗的莖剪成1 cm的小段、葉片剪成0.5 cm2的塊狀接種到該培養(yǎng)基，每個三角瓶接種5個，共10瓶，以下同。30 d后統(tǒng)計不同材料愈傷組織誘導情況。

1.4.2? ? 不定芽的誘導? ? 將愈傷組織切成0.3～0.5 cm2的塊，接種到分化培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基附加KT、ZT、IBA和IAA，30 d后統(tǒng)計愈傷組織分化情況。先用下胚軸愈傷組織篩選最佳分化培養(yǎng)基，然后將莖段和葉片的愈傷組織接種到該培養(yǎng)基，30 d后統(tǒng)計不同愈傷組織分化情況。

1.4.3? ?生根培養(yǎng)? ?將不定芽接種到生根培養(yǎng)基1/2MS、1/2MS+IBA 0.5 mg/L、1/2MS+IAA 0.2 mg/L上，10 d后觀察生根情況， 30 d后統(tǒng)計生根和植株生長情況。

1.4.4? ? 增殖培養(yǎng)? ?剪取試管苗單葉莖段，扦插到1/2MS培養(yǎng)基上，7 d后觀察和統(tǒng)計腋芽生長情況。試管苗除了誘導植株再生，還可以莖段扦插的方式進行增殖培養(yǎng)。

1.4.5? ? 試管苗移栽? ? 將培養(yǎng)健壯的試管苗移至溫室在自然光下煉苗，3 d后取出試管苗，洗去根部培養(yǎng)基，移栽到裝有園土、草炭土和蛭石等量混合基質(zhì)的營養(yǎng)缽中，適量澆水，搭小拱棚保濕，7 d后可正常管理，15 d后統(tǒng)計成活率。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同滅菌方法對全葉苦苣菜種子和莖段滅菌效果的影響

由表1可以看出，種子的滅菌相對較容易，依次用75%乙醇溶液滅菌60 s、10%過氧化氫溶液浸泡10、15、20 min、0.1%氯化汞溶液滅菌5、10 min，污染率均在13%以下。75%乙醇和0.1%氯化汞的組合是普遍用于植物外植體的消毒[9 ]，10%過氧化氫溶液對種皮有一定的軟化作用，可加快種子萌發(fā)，提高萌發(fā)率。種子萌發(fā)率低。除了滅菌劑毒害作用外，種子本身發(fā)芽率較低也是一個主要因素。

全葉苦苣菜植株從田間采集，且莖間距極短，根莖部分完全接觸土壤，攜帶雜菌較多，滅菌較為困難。從表1看出，用75%乙醇、0.1%氯化汞、10%過氧化氫等消毒劑進行種子滅菌，最佳處理為流水沖洗2 h，75%乙醇滅菌30 s，10%過氧化氫滅菌10 min，0.1%氯化汞滅菌15 min，污染率為20.0%，萌發(fā)率為16.7%，可獲得無菌莖段。

滅菌過程中發(fā)現(xiàn)，用0.1%氯化汞滅菌時間少于10 min，培養(yǎng)初期植株成活率較高，但后期霉菌細菌污染嚴重，不能利用;滅菌時間超過10 min，污染率較低，但外植體大多褐化死亡。植株葉片和莖較為幼嫩，容易被消毒劑毒害褐變死亡，75%乙醇和10%過氧化氫滲透性較強，但殺菌力較弱;0.1%氯化汞滲透性差，但表面滅菌力較強，復合使用有利于更好地滅菌且減少對外植體的傷害。由于野外環(huán)境差異較大，植株的生長狀態(tài)不同，還需根據(jù)具體情況調(diào)整滅菌方案。

將滅菌后的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基，10 d左右種子開始萌發(fā)，萌發(fā)后可得實生無菌苗（圖1）。莖段接種到1/2MS培養(yǎng)基上，可誘導從生長點長出新芽（圖2），新芽長到3～4片葉時從基部剪下，接種到1/2MS培養(yǎng)基，7 d左右可生根，長成完整植株。

2.2? ?不同培養(yǎng)基對下胚軸愈傷組織誘導培養(yǎng)的影響

從表2可知，將全葉苦苣菜下胚軸接種于不同激素濃度和配比的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上均可誘導出顆粒狀愈傷組織， 其中以培養(yǎng)基MS+BA 0.5 mg/L +2，4-D 1.5 mg/L誘導率最高，長勢良好，為最佳誘導培養(yǎng)基。

由表3可知，以試管苗為材料進行增殖培養(yǎng)時，莖段和葉片愈傷組織也可用于愈傷組織誘導，以獲取再生植株，從而實現(xiàn)植株增殖。將試管苗莖段和葉片接種到MS+BA 0.5 mg/L +2，4-D 1.5 mg/L培養(yǎng)基上，誘導率均在60%以上，與莖段和葉片相比，下胚軸的愈傷組織的誘導率最高且長勢最好。

2.3? ?不同培養(yǎng)基對愈傷組織的增殖和分化的影響

從表4可知，全葉苦苣菜下胚軸在分化培養(yǎng)基MS+ZT 2.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L上誘導效果較好，可分化出不定芽數(shù)量最多，且長勢良好。

將試管苗莖段和葉片誘導形成的愈傷組織分別接種到愈傷組織分化培養(yǎng)基MS+ZT 2.0 mg/L+ IAA 0.5 mg/L上觀察到的分化結(jié)果見表5、圖3。愈傷組織誘導分化率以下胚軸最高且長勢最好，莖段次之;葉片愈傷組織較難分化且易形成畸形苗。這可能是因為下胚軸相對分化程度較低，更易于脫分化和再分化。

2.4? ?全葉苦苣菜不定芽生根培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)

將培養(yǎng)30 d左右、長勢旺盛的不定芽切下，接種到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，30 d后全葉苦苣菜不定芽在3種培養(yǎng)基上的生根率均達到95%以上，并可形成完整的再生植株（圖4）。全葉苦苣菜是較易生根的植物，將芽接種在1/2MS培養(yǎng)基上，不添加任何激素，10 d左右也可生根，與添加生長素IBA 0.5 mg/L 和IAA 0.2 mg/L相比生根率差異不大。添加生長素后生根時間可提前3～5 d，添加IAA后根量較多。

全葉苦苣菜的快速增殖可以試管苗莖段和葉片為材料，通過植株再生的方式進行增殖培養(yǎng)，也可以通過試管苗單葉莖段扦插誘導腋芽的離體快繁方式進行增殖培養(yǎng)。單葉莖段接種后7 d左右腋芽萌發(fā)，10 d左右生根，30 d腋芽可長到5 cm左右，具有8～10片葉，繼續(xù)增殖培養(yǎng)可剪成6～8個外植體，短期內(nèi)也可獲得大量全葉苦苣菜無菌苗。圖5為莖段扦插后腋芽萌發(fā)及莖段下端生根情況。

2.5? ?煉苗和移栽

將試管苗移栽到園土、蛭石和草炭土等量混合配制的基質(zhì)中，前期保濕遮陰，避免陽光直射，移栽成活率可達到95%以上。直接定植到土壤中，成活率達85%以上。圖6、7為全葉苦苣菜田間生長和移栽不同階段的生長狀態(tài)，可以看出，移栽試管苗的植物學性狀和野生苗基本一致，可正常開花結(jié)實。

3? ?小結(jié)與討論

本研究獲得的全葉苦苣菜再生植株， 移栽后基本上保持了野生植株的植物學性狀， 說明用全葉苦苣菜下胚軸、莖段和葉片誘導愈傷組織，并通過愈傷組織分化成再生植株的組織培養(yǎng)技術(shù)是全葉苦苣菜野生資源保護和利用的一條新途徑。

全葉苦苣菜的種子依次用75%乙醇溶液滅菌60 s，10%過氧化氫溶液浸泡10、15、20 min，0.1%氯化汞溶液滅菌5、10 min;莖段依次用75%乙醇溶液滅菌30 s，10%過氧化氫溶液滅菌10 min，0.1%氯化汞溶液滅菌15 min，可達到較好的滅菌效果，將其接種到萌發(fā)培養(yǎng)基1/2MS獲得無菌苗。75%乙醇和0.1%升汞的組合是普遍用于植物外植體的消毒[9 ]，10%過氧化氫溶液的使用對種皮有一定的軟化作用，可加快種子萌發(fā)，提高萌發(fā)率。種子萌發(fā)率低，除了滅菌劑毒害作用外，種子本身發(fā)芽率較低也是一個主要因素。由于全葉苦苣菜植株從田間采集，且莖間距極短，根莖部分完全接觸土壤，攜帶雜菌較多，滅菌較為困難。

滅菌過程中發(fā)現(xiàn)，用氯化汞滅菌時間少于10 min時，培養(yǎng)初期植株成活率較高，但后期霉菌細菌污染嚴重，不能利用;滅菌時間超過10 min，污染率較低，但外植體大多褐化死亡。植株葉片和莖較為幼嫩，容易被消毒劑毒害褐變死亡，乙醇和過氧化氫滲透性較強，但殺菌力較弱，升汞滲透性差，但表面滅菌力較強，合理的復合使用有利于更好地滅菌且減少對外植體的傷害。由于野外環(huán)境差異較大，植株的生長狀態(tài)不同，還需根據(jù)具體情況調(diào)整滅菌方案。

用于愈傷組織誘導最佳的材料為無菌苗下胚軸，其次為試管苗嫩莖。愈傷組織誘導的最佳培養(yǎng)基為MS+BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L，愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+ZT 2.0 mg/L +IAA0.5 mg/L，分化出的不定芽在培養(yǎng)基1/2MS+IAA 0.2 mg/L上的生根效果較好，IAA有利于根數(shù)量的增加，這與杜澤宇[10 ]的研究結(jié)果相似。

全葉苦苣菜的快速繁殖可用植株再生和離體快繁兩種方式進行增殖培養(yǎng)。前者需通過愈傷組織誘導、愈傷組織分化和植株再生，后者是基于試管苗在生長過程中莖間伸長，剪成單葉莖段后，扦插到培養(yǎng)基中誘導腋芽萌發(fā)，莖段的下端生根，形成新的植株。兩種增殖方式都能使無菌苗快速增殖，短期內(nèi)可獲得大量的試管苗。前者可為基因工程研究奠定基礎(chǔ)，后者為工廠化種苗繁育提供技術(shù)支撐。

健壯試管苗經(jīng)過煉苗移栽到溫室，在營養(yǎng)缽中，成活率可達到95%以上;直接移栽到土壤中成活率也在85%以上。

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（本文責編：楊? ? 杰）