呂瑩，郝堯坤，張照蘭（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽病科，鄭州 450000）

細(xì)胞凋亡是程序性細(xì)胞死亡，具有壞死的生化和形態(tài)學(xué)特征，細(xì)胞凋亡不僅可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而且在導(dǎo)致受損組織的級聯(lián)反應(yīng)中起重要作用[1]。肝細(xì)胞凋亡是肝臟疾病的重要影響因素，并參與正常肝細(xì)胞的發(fā)育和控制肝臟疾病的發(fā)展[2]。槲皮苷（quercitrin），即槲皮素-3-鼠李糖苷，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，是一種遍布植物體內(nèi)的生物大分子，為側(cè)柏[3]、魚腥草[4]、桑寄生[5]等傳統(tǒng)中藥材的主要藥物成分，其藥效作用備受人們的重視。近幾年研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷發(fā)揮多種生物學(xué)作用，包括抗腫瘤[6]、抑制破骨細(xì)胞形成[7]、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[8]、促進(jìn)牙周再生[9]、抑制巨噬細(xì)胞炎癥[10]等。本實驗采用過氧化氫（H2O2）處理肝細(xì)胞損傷進(jìn)行體外實驗研究，觀察槲皮苷對肝細(xì)胞L-02 損傷的保護(hù)作用和抗凋亡機(jī)制。

1 材料

正常人肝細(xì)胞L-02（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所），槲皮苷（純度≥98%）、7'-dichloroflurescin diacetate（DCFH-DA）試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司），噻唑藍(lán)（MTT）（貨號：M2128）、二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國GIBCO 公司），異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶（Annexin Ⅴ-FITC/PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（貨號：KGA108）（江蘇凱基生物公司），核轉(zhuǎn)錄因子E2 相關(guān)因子（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase-3）抗體（美國Cellular Signaling Technology 公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（北京中杉金橋有限公司），TNF-α（貨號：E-EL-H0109c）、IL-6（貨號：E-ELH0102c）酶聯(lián)免疫（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司），超氧化物歧化酶（SOD）（貨號：S0109）、丙二醛（MDA）（貨號：S0131）檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）。

2 方法

2.1 L-02 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

L-02 細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。將生長狀態(tài)良好的L-02 細(xì)胞分為空白組：正常培養(yǎng)的L-02 細(xì)胞；H2O2組：使用0.6 mmol·L－1H2O2處理1 h；槲皮苷處理組：L-02細(xì)胞分別使用25、50、100、200、400、800、1600、3200 μmol·L－1槲皮苷預(yù)處理3 h 后，使用0.6 mmol·L－1H2O2處理1 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實驗。于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2 MTT 檢測L-02 細(xì)胞增殖

各組L-02 細(xì)胞接種于96 孔板中，密度為1×105個·mL－1，培養(yǎng)48 h 后，每孔細(xì)胞加入5 mg·mL－1的MTT 溶液20 μL，37℃培養(yǎng)4 h，加入DMSO 150 μL，37℃搖床振蕩培養(yǎng)10 min，于酶標(biāo)儀測定L-02 細(xì)胞在490 nm 處的吸光（OD）值，細(xì)胞存活率（%）＝實驗組OD值/對照組OD值×100%。

2.3 DAPI/PI 檢測L-02 細(xì)胞凋亡

各組L-02 細(xì)胞培養(yǎng)24 h（接種密度1×105個·mL－1），加入多聚甲醛固定，用DAPI 和PI染液染色15 min，染色后，加入甲醇洗滌，棄去甲醇，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核染色情況，進(jìn)行DAPI/PI 雙染細(xì)胞計數(shù)并計算細(xì)胞凋亡率。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測L-02 細(xì)胞凋亡

L-02 細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個·mL－1，參照細(xì)胞凋亡率檢測試劑盒說明書的步驟，使用500 μL 緩沖液懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL 混勻，加入PI 5 μL 混勻，室溫遮光反應(yīng)15 min，置流式細(xì)胞儀檢測L-02 細(xì)胞凋亡。

2.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS、SOD 和MDA 的檢測

收集各組L-02 細(xì)胞上清液，分別按照ROS、SOD 和MDA 的檢測試劑盒說明書的步驟進(jìn)行檢測。

2.6 ELISA 法檢測炎癥因子TNF-α 和IL-6 水平

收集各組L-02 細(xì)胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測TNF-α和IL-6 水平。

2.7 Western blot 檢測Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)

使用RIPA 裂解液提取各組L-02 細(xì)胞的總蛋白，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入目的蛋白一抗（Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3 均為1∶1000 稀釋），4℃孵育過夜，次日用Tris-HCl-Tween 緩沖鹽溶液（TBST）洗膜10 min×3次，加入二抗（1∶800稀釋），室溫孵育1 h，TBST 洗膜10 min×3 次，顯色、曝光，以β肌動蛋白（β-actin）作為內(nèi)參蛋白，分析目的蛋白表達(dá)。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。多組間數(shù)據(jù)比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02存活率的影響

與空白組比較，H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 存活率降低；與H2O2組比較，50 ～1600 μmol·L－1的槲皮素增加人肝細(xì)胞L-02 存活率，3200 μmol·L－1的槲皮素促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L-02存活率降低（見表1）。其中槲皮苷100、200、400 μmol·L－1條件下的H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 存活率相對較高，800 μmol·L－1濃度下的存活率與100 μmol·L－1濃度差異不大，故選用槲皮苷100、200、400 μmol·L－13 個濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.2 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 凋亡的影響

肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，與空白組比較，H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 膜粗糙，部分膜破裂，透光度低；與H2O2組比較，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1濃度組細(xì)胞形態(tài)明顯得到改善。DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色顯示，與空白組（2.15±0.46）%比較，H2O2處理的L-02 染色質(zhì)濃縮、凝聚、斷裂，細(xì)胞凋亡（27.46±3.67）%顯著增多（P＜0.05）。與H2O2組比較，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1濃度組[（22.12±2.88）%、（16.87±2.34）%、（13.34±1.72）%]細(xì)胞凋亡顯著減少。其中槲皮苷 400μmol·L－1效果最佳（見圖1）。

表1 不同濃度的槲皮苷對H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 增殖的影響(± s，n ＝9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

表1 不同濃度的槲皮苷對H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 增殖的影響(± s，n ＝9)Tab 1 Effect of different concentrations of quercetin on the proliferation of hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 細(xì)胞存活率/%空白組 100.84±3.13 H2O2 組 59.29±3.71*H2O2 ＋槲皮苷25 μmol·L－1 組 62.05±4.75 H2O2 ＋槲皮苷50 μmol·L－1 組 68.88±5.86#H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 73.12±4.63#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 77.44±5.26#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 84.19±3.44#H2O2 ＋槲皮苷800 μmol·L－1 組 74.08±3.35#H2O2 ＋槲皮苷1600 μmol·L－1 組 66.39±3.11#H2O2 ＋槲皮苷3200 μmol·L－1 組 52.21±4.34#

3.3 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 凋亡和凋亡蛋白的影響

與空白組比較，H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量明顯升高，Bcl-2 蛋白水平顯著降低，Bax/Bcl-2 比率顯著升高（P＜0.05，見表2和圖2）。與H2O2組比較，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明顯減少H2O2誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02 凋亡率、Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量，顯著提高Bcl-2 蛋白水平，降低Bax/Bcl-2 比率，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見表2和圖2）。

3.4 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 氧化應(yīng)激的影響

與空白組比較，H2O2處理后人肝細(xì)胞L-02 中ROS 含量和MDA 水平顯著升高，SOD 活性明顯降低（P＜0.05，見表3）。與H2O2組比較，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明顯降低H2O2損傷的L-02 細(xì)胞的ROS 和MDA 水平，顯著提高SOD 活性，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見圖3和表3）。

3.5 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 炎癥因子分泌的影響

與空白組比較，H2O2組人肝細(xì)胞L-02 中TNF-α和IL-6 水平顯著升高（P＜0.05）。與H2O2組比較，100、200、400 μmol·L－1槲皮苷明顯降低H2O2處理的人肝 細(xì) 胞L-02 的TNF-α和IL-6 水平，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見表4）。

3.6 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 Nrf2/HO-1 通路的影響

圖1 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 凋亡的影響（DAPI，×200）Fig 1 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 treated with H2O2 （DAPI，×200）

圖2 槲皮苷對人肝細(xì)胞L-02 凋亡（A）和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（B）的影響Fig 2 Effect of quercetin on the apoptosis of human hepatocytes L-02 （A）and expression of apoptosis-related proteins（B）

圖3 探針法檢測人肝細(xì)胞L-02 中ROS 熒光強(qiáng)度（×100）Fig 3 Fluorescence intensity of human hepatocyte L-02 ROS detected by probe method（×100）

與空白組比較，H2O2處理人肝細(xì)胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，槲皮苷100、200、400 μmol·L－1濃度組Nrf2 和HO-1 蛋白水平顯著升高，并呈濃度依賴性（P＜0.05，見圖4及表5）。

4 討論

表2 槲皮苷對H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 凋亡和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(x±s，n ＝9)Tab 2 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 apoptosis and apoptosis-related protein expression (x±s，n ＝9)

表3 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 中ROS 熒光強(qiáng)度、SOD 和MDA 水平的影響(± s，n ＝9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity，SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

表3 槲皮苷對H2O2 處理人肝細(xì)胞L-02 中ROS 熒光強(qiáng)度、SOD 和MDA 水平的影響(± s，n ＝9)Tab 3 Effect of quercetin on ROS fluorescence intensity，SOD and MDA levels in human hepatocytes L-02 treated with H2O2 (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 ROS 熒光強(qiáng)度（UFI） SOD 活性/（U·mL－1） MDA 含量/（μmol·L－1）空白組 493.38±78.83 32.40±1.26 2.34±0.67 H2O2 組 1305.59±102.80* 11.31±1.77* 9.57±0.85*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 1155.47±92.73# 16.98±1.35# 6.23±0.63#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 989.52±82.12# 21.34±1.49# 5.36±0.47#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 795.65±73.40# 24.55±1.18# 4.62±0.59#

表4 槲皮苷對H2O2 誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影響(± s，n ＝9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s，n ＝9)

表4 槲皮苷對H2O2 誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞L-02 中TNF-α 和IL-6 分泌的影響(± s，n ＝9)Tab 4 Effect of quercetin on the secretion of TNF-α and IL-6 in human hepatocytes L-02 induced by H2O2 (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 TNF-α 含量/（ng·L－1）IL-6 含量/（ng·L－1）空白組 16.54±2.92 10.26±1.05 H2O2 組 52.33±5.45* 26.64±3.08*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 44.65±4.03# 22.15±2.60#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 37.25±4.68# 20.56±2.23*H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 31.06±3.97# 15.22±2.18#

圖4 槲皮苷對人肝細(xì)胞L-02 Nrf2/HO-1 蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of quercetin on the expression of L-02 Nrf2/HO-1 proteins in human hepatocytes

在肝細(xì)胞損傷過程中，ROS 與細(xì)胞內(nèi)大分子（蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等）以及細(xì)胞膜、細(xì)胞器結(jié)合破壞其生物活性，誘發(fā)肝細(xì)胞凋亡，在多種肝臟疾病發(fā)生起重要作用[11]。目前關(guān)于肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的病理機(jī)制尚未完全闡明，既往研究顯示抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷及肝細(xì)胞凋亡可有效保護(hù)肝細(xì)胞免受氧自由基損傷[12-13]，本研究主要探討槲皮苷對肝細(xì)胞H2O2損傷的作用機(jī)制，為研發(fā)抗H2O2損傷的新型藥物提供新方向。

表5 槲皮苷對H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)的影響(± s，n ＝9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s，n ＝9)

表5 槲皮苷對H2O2 處理肝細(xì)胞L-02 中Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)的影響(± s，n ＝9)Tab 5 Effect of quercetin on H2O2-treated hepatocyte L-02 Nrf2 and HO-1 protein expression (± s，n ＝9)

注：與空白組比較，*P ＜0.05；與H2O2 組比較，#P ＜0.05。Note：Compared with the blank group，*P ＜0.05；compared with the H2O2 group，#P ＜0.05.

組別 Nrf2 蛋白 HO-1 蛋白空白組 0.21±0.02 0.14±0.02 H2O2 組 0.33±0.04* 0.24±0.03*H2O2 ＋槲皮苷100 μmol·L－1 組 0.45±0.03# 0.41±0.05#H2O2 ＋槲皮苷200 μmol·L－1 組 0.49±0.06# 0.46±0.05#H2O2 ＋槲皮苷400 μmol·L－1 組 0.66±0.07# 0.71±0.07#

槲皮苷具有抗氧化、抗炎和改善藥物代謝等作用，國內(nèi)外研究顯示槲皮苷通過降低ROS 含量和細(xì)胞毒性發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[14]。細(xì)胞凋亡過程受到多種基因調(diào)控，研究表明caspase-3 可參與肝細(xì)胞凋亡過程，活化成Cleaved caspase-3 時可發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[15-16]。本研究通過使用H2O2處理L-02 細(xì)胞模擬其在體內(nèi)環(huán)境，細(xì)胞增殖率降低，Cleaved caspase-3、Bax 的蛋白水平升高，Bcl-2 的蛋白水平降低，細(xì)胞凋亡率升高；槲皮苷可促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制H2O2誘導(dǎo)L-02 細(xì)胞凋亡，降低Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)量，升高Bcl-2 蛋白水平。

機(jī)體在應(yīng)對氧自由基損害時，形成完善的氧化應(yīng)激應(yīng)答防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)受抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）位于抗氧化保護(hù)基因的上游調(diào)控區(qū)域調(diào)控[17]。氧化應(yīng)激是肝細(xì)胞損傷的重要原因之一，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時ROS 水平升高，可加重肝細(xì)胞凋亡，MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時促使MDA 水平升高從而進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激損傷，SOD 屬于抗氧化酶類且具有清除氧自由基能力[18-20]。研究表明，IL-6、TNF-α水平降低可減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)從而減弱細(xì)胞損傷程度[21]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷可顯著升高SOD 活性，降低ROS、MDA、TNF-α、IL-6 水平。

Nrf2/HO-1 途徑是參與機(jī)體氧化應(yīng)激調(diào)控的重要信號通路，ROS 的大量產(chǎn)生可刺激Nrf2 表達(dá)，促進(jìn)下游HO-1 等抗氧化基因表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力[22-23]。Nrf2/HO-1 途徑已被證實在H2O2誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中激活，其激活是啟動細(xì)胞內(nèi)源性抗氧化途徑之一[24]。本研究發(fā)現(xiàn)槲皮苷處理組Nrf2 和HO-1 表達(dá)水平顯著高于H2O2，提示槲皮苷可能通過激活Nrf2/HO-1 途徑進(jìn)而對H2O2誘導(dǎo)L-02 細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，研究表明槲皮苷對H2O2損傷的肝細(xì)胞具有保護(hù)作用，抑制肝細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能為槲皮苷通過抑制H2O2引起的氧化應(yīng)激和炎癥因子分泌，與Nrf2/HO-1 通路激活密切相關(guān)。