杜嘉玲，廖昌軍，馬婧，簡銳（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610083）

甘露飲出自《太平惠民和劑局方》，為傳統(tǒng)中藥方劑，臨床上主要用來治療各種口腔疾病，如口腔潰瘍、齒齦腫爛等[1-7]，目前臨床應(yīng)用以湯劑為主。由于湯劑煎煮麻煩、不方便攜帶，導(dǎo)致患者依從性差，已經(jīng)不能滿足患者的用藥需求[8-11]。中藥顆粒劑作為一種常用中藥劑型，具有攜帶方便、穩(wěn)定性好、吸收快的優(yōu)點。

星點設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化法是由析因設(shè)計加軸點和中心點組成的方法，近年來在藥學(xué)制劑工藝優(yōu)化和處方篩選中的應(yīng)用十分廣泛[12-13]。本研究旨在通過結(jié)合藥效學(xué)實驗篩選甘露飲的提取工藝路線，并在此基礎(chǔ)上以噴干粉的粉末得率為指標(biāo)，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，并通過高效液相色譜法（HPLC）測定噴干粉中有效成分的轉(zhuǎn)移率，從而保證制劑的質(zhì)量和藥效，為甘露飲顆粒劑研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；DZTW 型電子調(diào)溫電熱套（天津市工興電器廠）；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（IKA 科技有限公司）；B290 型噴霧干燥器（瑞士步琦實驗室儀器公司）；KH3200E 型超聲清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；十萬分之一電子天平、千分之一電子天平（北京賽多利斯有限公司）。

1.2 試藥

生地黃（批號：1812205）、熟地黃（批號：18122504）、麥門冬（批號：181128）、天門冬（批號：18072302）、石斛（批號：18031307）、茵陳（批號：180713）、枳殼（批號：18081002）、蜜制枇杷葉（批號：18030609）、甘草（批號：180201）[四川禾一天然藥業(yè)有限公司，經(jīng)檢驗質(zhì)量均符合2015年版《中國藥典》一部各藥材項下規(guī)定]；熊果酸（批號：180926，純度：99.6%）、柚皮苷（批號：181119，純度：99.8%）、甘草酸（批號：180202，純度：99.2%）、綠原酸（批號：181010，純度：99.8%）、麥角甾苷（批號：181113，純度：99.3%）、黃芩苷（批號：180921，純度：99.9%）對照品（四川省食品藥品檢定研究所）。甲醇（色譜純，格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），氫氧化鈉、無水乙醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.3 動物

SPF 級SD 大鼠25 只，其中雌鼠13 只，雄鼠12 只，體質(zhì)量180 ～220 g（成都達(dá)碩實驗動物有限公司），動物許可證號：SCXK（川）2020-030。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥效學(xué)結(jié)合初步篩選甘露飲提取工藝路線

2.1.1 甘露飲處方組成 甘露飲出自《太平惠民和劑局方》，方劑組成：生地黃、熟地黃、麥門冬、天門冬、石斛各15 g，枳殼、茵陳、蜜制枇杷葉各10 g，甘草片6 g，處方中藥飲片總質(zhì)量為121 g。

2.1.2 甘露飲提取工藝路線設(shè)計與提取物制備中藥方劑經(jīng)過上千年的臨床應(yīng)用，已經(jīng)證明其配伍的合理性，甘露飲方劑目前臨床主要用于口腔潰瘍的治療，口腔潰瘍的形成必然伴有炎癥，因此溶劑對方劑中抗炎成分的提取率會直接影響藥效。通過前期預(yù)實驗，共設(shè)計4 條提取工藝路線，提取時間均為2 h，提取次數(shù)為2 次，提取完成后，將各組提取液旋蒸濃縮至以生藥計含量為1 g·mL－1，詳細(xì)提取工藝路線設(shè)計見表1。

表1 甘露飲提取工藝路線Tab 1 Extraction route of Ganluyin

2.1.3 動物分組及造模 SD 大鼠隨機分為5 組：模型組、工藝Ⅰ、工藝Ⅱ組、工藝Ⅲ組、工藝Ⅳ組（n＝5），實驗前稱重并對各組大鼠進(jìn)行編號。造模前大鼠禁食12 h，各組大鼠經(jīng)腹腔注射約0.5 mL 10%水合氯醛（300 mg·kg－1）麻醉后，均在左側(cè)黏膜接受氫氧化鈉片灼燒，灼燒時間約35 s，氫氧化鈉片大小約為3 mm×3 mm。氫氧化鈉燒灼口腔內(nèi)壁黏膜導(dǎo)致口腔內(nèi)壁黏膜破損進(jìn)而形成潰瘍，待潰瘍形成后，各組均采用灌胃給藥，劑量為10 mL·kg－1（人每日給藥劑量為2 g·kg－1，按照人與大鼠給藥劑量進(jìn)行換算大鼠給藥劑量），模型組灌胃給予10 mL·kg－1蒸餾水，不同提取工藝組給予10 mL·kg－1提取濃縮液，同時注意在給藥灌胃時小心避免灌胃針刮蹭到口腔潰瘍面，導(dǎo)致潰瘍加重影響實驗。以上各組大鼠每日給藥1 次，連續(xù)給藥直至所有組別的大鼠潰瘍愈合。各組大鼠自造模之日起和給藥后每日觀察大鼠口腔潰瘍愈合情況，記錄各組大鼠愈合天數(shù)，并在給藥前后給藥后第2、5、7、10日對大鼠稱重，并采取尾靜脈采血法收集大鼠全血約0.3 mL于EP 管中。血樣先室溫靜置30 min，然后3000 r·min－1離心15 min，收集上層血清[6]。按照ELISA 試劑盒的指導(dǎo)說明，采用全波長酶標(biāo)儀在450 nm 條件下檢測各組大鼠血清炎癥因子含量。各組大鼠觀察和檢測所得數(shù)據(jù)均采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行描述，使用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 21.0 進(jìn)行單因素方差分析[14]。

2.1.4 口腔潰瘍藥效實驗結(jié)果 大鼠在接受氫氧化鈉片灼燒復(fù)制口腔潰瘍后，均能耐受至實驗結(jié)束。造模前大鼠口腔黏膜光滑平整無破損，造模后大鼠口腔黏膜呈紅腫或破損，隨著潰瘍逐漸形成，潰瘍處變黃，到最后逐漸痊愈形成瘢痕。20 d 左右所有組別的大鼠口腔潰瘍基本痊愈。各組痊愈天數(shù)、體質(zhì)量變化、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等變化結(jié)果見表2～4。

表2 各組痊愈天數(shù)比較分析結(jié)果 (n ＝5，± s)Tab 2 Recovery days in each group (n ＝5，± s)

表2 各組痊愈天數(shù)比較分析結(jié)果 (n ＝5，± s)Tab 2 Recovery days in each group (n ＝5，± s)

注（Note）：與模型組比較，*P ＜0.05；與工藝Ⅰ組比，#P ＜0.05； 與工藝Ⅱ組比，&P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05；compared with the groupⅠ，#P ＜0.05； compared with the group Ⅱ，&P ＜0.05）。

組別 平均痊愈天數(shù)/d模型組 20.2±0.83工藝Ⅰ 15.2±0.83工藝Ⅱ 14.8±0.83工藝Ⅲ 9.8±0.80*#&工藝Ⅳ 9.8±0.83*#&

表3 各組口腔潰瘍大鼠體質(zhì)量變化 (n ＝5，± s)Tab 3 Mass changes in canker sores of rats in each group(n ＝5，± s)

表3 各組口腔潰瘍大鼠體質(zhì)量變化 (n ＝5，± s)Tab 3 Mass changes in canker sores of rats in each group(n ＝5，± s)

注（Note）：與模型組比較，*P ＜0.05；與工藝Ⅰ組比，#P ＜0.05；與工藝Ⅱ組比，&P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05；compared with the groupⅠ，#P ＜0.05； compared with the group Ⅱ，&P ＜0.05）。

組別 ΔW/g第2日 第5日 第7日 第10日模型組 7.18±0.23 5.10±0.25 9.02±0.27 10.94±0.89工藝Ⅰ 6.86±0.50 5.90±0.12 10.96±0.69 17.96±0.28工藝Ⅱ 7.34±0.30 6.34±0.33 12.5±0.50 18.81±0.22工藝Ⅲ 7.10±0.15 7.78±0.36 18.32±0.54 29.88±0.68*#&工藝Ⅳ 7.18±0.19 8.22±0.50 18.30±0.91 30.72±2.37*#&

工藝Ⅲ、Ⅳ組藥效學(xué)顯著優(yōu)于工藝Ⅰ、Ⅱ組，表明采用60%的乙醇提取效果更好，工藝Ⅲ、Ⅳ組比較藥效學(xué)沒有顯著差異，Ⅳ組提取方法操作更簡便，所以選擇工藝Ⅳ進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 星點設(shè)計-效應(yīng)面法實驗設(shè)計

2.2.1 評價指標(biāo) 選擇每一個實驗方法得到的濃縮藥液經(jīng)噴霧干燥所得的粉末取得率（Y）為評價指標(biāo)，計算公式為：

2.2.2 因素水平選擇 選擇液料比（X1）、提取時間（X2）、提取次數(shù)（X3）作為考察對象，每個因素均設(shè)5 個水平，3 個因素，見表5。

表4 各組大鼠TNF-α 含量水平變化(n ＝5，± s，ng·L－1)Tab 4 Level change of TNF-α in each group (n ＝5，± s，ng·L－1)

表4 各組大鼠TNF-α 含量水平變化(n ＝5，± s，ng·L－1)Tab 4 Level change of TNF-α in each group (n ＝5，± s，ng·L－1)

注（Note）：與模型組比較，*P ＜0.05；與工藝Ⅰ組比，#P ＜0.05；與工藝Ⅱ組比，&P ＜0.05（Compared with the model group，*P ＜0.05；compared with the groupⅠ，#P ＜0.05； compared with the group Ⅱ，&P ＜0.05）。

組別 TNF-α 含量 TNF-β 含量第2日 第5日 第7日 第10日 第2日 第5日 第7日 第10日模型組 154.10±19.21 143.21±17.20 132.17±15.34 119.87±15.01 101.23±14.29 91.47±10.68 85.73±9.85 80.46±8.76工藝Ⅰ 146.13±13.21 130.53±11.21 112.17±9.85 99.47±8.63 94.38±11.23 81.56±9.65 69.33±7.32 57.42±6.58工藝Ⅱ 143.08±10.57 131.28±9.87 113.65±10.12 96.58±7.65 91.04±9.57 83.74±8.53 68.45±6.58 60.44±5.68工藝Ⅲ 135.48±10.74 105.88±7.63 89.27±8.56 57.51±6.38*** 80.89±7.58 65.77±8.50 51.36±6.12 39.45±4.27***工藝Ⅳ 130.43±7.83 101.94±6.54 78.62±5.99 51.38±4.78*** 76.58±9.23 57.33±7.36 47.56±6.21 35.28±3.17***

表5 因素與水平Tab 5 Factor and level

2.2.3 實驗設(shè)計及結(jié)果 實驗方案由軟件Dsign-Expert.V8.0.6 生 成。 以500 mL 60%乙醇為溶劑提取，提取液旋蒸濃縮至以生藥計含量為1 g·mL－1。分別取濃縮藥液進(jìn)行噴霧干燥[15]。收集干燥粉末，稱重并記錄數(shù)據(jù)，按照“2.2.1”下公式計算粉末取得率。具體實驗方案及結(jié)果見表6。

2.2.4 模型擬合 采用軟件Desing-Expert.V8.0.6對表7中的數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合，通過模型擬合建造出數(shù)學(xué)模型，模型擬合的優(yōu)劣用方差分析來評價，選出最佳的擬合模型。

表6 實驗設(shè)計與結(jié)果Tab 6 Design and results

數(shù)學(xué)模型：Y＝8.67972＋0.83836X1＋0.022492X2＋2.17233X3＋5.45061×104X1X2＋0.32322X1X3－6.6571X2X3－0.14747X12－ 8.45938E-005X22－1.68130X32

根據(jù)表7模型P值為0.0002，表明模型具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，模型成立。液料比和提取次數(shù)P＜0.0001，表明液料比和提取次數(shù)對粉末取得率的影響差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。決定系數(shù)為0.9251，接近于1。校正決定系數(shù)為0.8477，表明該模型能解釋84.77%效應(yīng)面值的變化。預(yù)測決定系數(shù)為0.8474，表明該模型能預(yù)測解釋84.74%的效應(yīng)面值變化。模型的精密度為21.657，精密度合格。經(jīng)過星點設(shè)計效應(yīng)面法得到最佳提取條件為液料比4∶1，提取時間180 min，提取1 次。二次多項式回歸模型等高線和3D 圖見圖1和2。

表7 二次多項式模型方差分析Tab 7 Variance of quadratic polynomial model

圖1 二次多項式回歸模型等高線Fig 1 Contour of the quadratic polynomial regression model

圖2 二次多項式回歸模型3D 圖Fig 2 3D figure of quadratic polynomial regression model

2.2.5 驗證實驗結(jié)果 使用模型預(yù)測得到最佳提取條件，預(yù)測粉末取得率為13.0379%。按照優(yōu)化預(yù)測得到的最佳提取條件，以500 mL 60%乙醇為溶劑進(jìn)行提取，再分別對所得藥液旋蒸濃縮后進(jìn)行噴霧干燥，收集粉末，稱重并記錄數(shù)據(jù)，按照“2.2.1”項下公式計算粉末取得率并記錄數(shù)據(jù)。

由表8結(jié)果可知，實際粉末取得率與預(yù)測粉末取得率平均偏差小于2%，證明預(yù)測最佳提取條件在實際實驗操作中穩(wěn)定可行。

表8 驗證實驗結(jié)果Tab 8 Validation experiment

2.3 噴干粉轉(zhuǎn)移率測定

2.3.1 對照品溶液配制 精密稱取綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸對照品適量，置于量瓶中，加甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、0.5、1.0、1.0、0.5、0.5 mg·mL－1的 對照品儲備液，待用。

2.3.2 樣品溶液制備 將工藝Ⅳ組提取液濃縮后按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行噴霧干燥[15]，精密稱取樣品粉末0.150 g，甲醇溶解，定容至5 mL，超聲10 min，冷卻至室溫，補充甲醇減失量，即得樣品溶液。

2.3.3 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性 sepax MGE-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35 ℃，檢測波長210 nm，進(jìn)樣量5 μL，流速為1 mL·min－1，流動相為乙腈（B）和0.1%磷酸水（A），洗脫梯度如表9。將空白溶劑（甲醇）及“2.3.1”和“2.3.2”項下混合對照品溶液和樣品溶液進(jìn)樣測定，見圖3。由結(jié)果可知，6 種成分所得峰能達(dá)到基線分離，峰形較好且穩(wěn)定，其他成分對檢測沒有干擾。

表9 HPLC 的梯度洗脫程序Tab 9 Gradient elution procedure for HPLC

2.3.4 線性范圍考察 分別精密吸取“2.3.1”項下綠原酸、麥角甾苷、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸和熊果酸對照品儲備液適量配制成系列濃度的混合對照品溶液，分別精密吸取5 μL，進(jìn)樣測定，以峰面積（y）對質(zhì)量濃度（x）進(jìn)行線性回歸并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表10，6 種成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 轉(zhuǎn)移率測定 將甘露飲處方按照工藝Ⅳ進(jìn)行提取濃縮，按照“2.3.2”項下方法制備樣品溶液，提取濃縮液和樣品溶液均平行制備3 份，按照“2.3.3”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄濃縮液和樣品溶液中各有效成分的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算噴干粉中有效成分的轉(zhuǎn)移率，計算公式見公式（2）。結(jié)果綠原酸、麥角甾苷酸、柚皮苷、黃芩苷、甘草酸、熊果酸的轉(zhuǎn)移率分別為89.54%、70.29%、94.27%、95.35%、82.47%、80.37%。甘露飲中有效成分的轉(zhuǎn)移率均在70%以上，轉(zhuǎn)移率較好。

3 討論

圖3 空白溶劑（A）、混合對照品溶液（B）和樣品溶液（C）HPLC 圖Fig 3 HPLC chromatogram of the blank solution（A），the mixed control solution（B）and sample solution（C）

表10 甘露飲方劑中6 種有效成分線性關(guān)系Tab 10 Linearity of 6 active components in Ganluyin

在提取工藝優(yōu)化過程中，正交實驗設(shè)計是目前國內(nèi)應(yīng)用得比較成熟的方法，但是存在實驗精度不夠，建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性差，選擇的實驗取值僅僅是接近最佳取值，無法精確找到最佳點，不能靈敏地考察各因素間的交互作用，而星點設(shè)計-效應(yīng)面法是集數(shù)學(xué)與統(tǒng)計于一體，具有實驗次數(shù)少、精密度高等特點；并且可對未知結(jié)果的實驗進(jìn)行預(yù)測，比正交實驗設(shè)計更具優(yōu)勢，適用于多因素、多水平的實驗，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥研究領(lǐng)域[16-17]。

在優(yōu)化甘露飲提取工藝時，采用效應(yīng)面優(yōu)化法需同時考察多個因素對實驗結(jié)果的影響，由于前期實驗已確定最佳提取溶劑為60%乙醇，故本次實驗選擇液料比、提取時間、提取次數(shù)為影響因素進(jìn)行考察。模型擬合中采用噴霧干燥粉末取得率為評價指標(biāo)，而沒有用有效成分轉(zhuǎn)移率來考察，主要是因為有效成分含量測定采用梯度洗脫色譜條件，每一個樣品需要分析100 min，耗時較長，而前期預(yù)實驗篩選了烘干、減壓干燥、冷凍干燥和噴霧干燥等方法，通過測定發(fā)現(xiàn)采用噴霧干燥得到的噴干粉中有效成分轉(zhuǎn)移率較好。同時濃縮液和噴干粉中6 種有效成分轉(zhuǎn)移率均大于70%，轉(zhuǎn)移率較高，分析原因可能是采用噴霧干燥的方法，干燥溫度較低，干燥時間短，有效避免了提取液中有效成分的損失。

本文通過藥效學(xué)結(jié)合星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選甘露飲方的提取工藝，采取HPLC 分別對甘露飲濃縮液和噴干粉中6 種有效成分進(jìn)行含量測定，并計算干燥前后有效成分的轉(zhuǎn)移率，為甘露飲進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。