張運(yùn)輝，周小青，伍大華，楊夢琳，鄭彩杏，童天昊

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)；22011數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新，長沙 410208；3重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)院，重慶 404120；4湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，長沙 410006

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見的癡呆類型，起病潛隱，以嚴(yán)重的認(rèn)知和記憶功能減退，并伴有進(jìn)行性的智能、記憶、言語、視空間技能障礙及精神人格改變等主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]。目前，西醫(yī)對AD病因及發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明，尚無根治AD的藥物，成為公共健康和醫(yī)療界的挑戰(zhàn)之一[2]。我國傳統(tǒng)中醫(yī)通過辨病與辨證相結(jié)合，抓住AD病因病機(jī)特點(diǎn)，隨證加減用藥，在改善AD患者學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能、提高生活和社會(huì)交往能力方面具有較確切的療效[3]。

Song[4]認(rèn)為，脾胃為后天之本，氣血生化之源。年老體邁者，脾胃虛弱，水谷精微不能化為精血，腎精空虛，腦髓失充則發(fā)為癡呆之證。Lu[5]認(rèn)為脾胃虛弱是AD的根本原因，由虛而致痰濁血瘀，痰瘀阻塞清竅，加速AD形成。提出“從脾胃論治”AD，并發(fā)現(xiàn)健脾方藥對AD有一定的治療作用。四君子湯是經(jīng)典補(bǔ)脾方藥，始載于《太平惠民和劑局方》，由人參、白術(shù)、茯苓、甘草組成。其中人參性甘溫，益氣補(bǔ)脾，為君；白術(shù)苦溫，健脾燥濕，合人參以益氣健脾，為臣;茯苓甘淡，滲濕健脾，為佐；炙甘草甘平，和中益土，為使。四味皆為平和之品，四藥相輔，共奏益氣健脾之功，為治脾胃氣虛的基本方。實(shí)驗(yàn)研究表明，四君子湯水提液能提高Aβ25-35誘導(dǎo)的HBMEC損傷細(xì)胞的活性，調(diào)控GLUT1、LRP1、RAGE mRNA和LRP1蛋白、RAGE蛋白的表達(dá)，有助于Aβ跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)，減少Aβ在腦內(nèi)的聚集[6]；四君子湯可能通過補(bǔ)脾作用，促進(jìn)AD大鼠中樞能量生成，改善中樞的能量代謝紊亂，調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體活性及AMPK表達(dá)[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[8]，四君子湯合黃連解毒湯治療阿爾茨海默病療效顯著。因此，深入探討四君子湯的作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號通路，分析其對AD的影響及其作用機(jī)制，對于闡述四君子湯治療AD的科學(xué)內(nèi)涵以及為AD的臨床治療提供有價(jià)值的信息。

由于生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法已成為一種系統(tǒng)、高效地揭示中藥復(fù)方分子機(jī)制的新手段。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要研究藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系，可通過整合中藥化學(xué)成分、疾病靶標(biāo)構(gòu)建“化學(xué)成分-作用靶標(biāo)-疾病靶標(biāo)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)”，將相互作用關(guān)系可視化為網(wǎng)絡(luò)模型，并從分子層面和整體的角度研究藥物對生物網(wǎng)絡(luò)的影響[9]，其研究策略的系統(tǒng)性、整體性特點(diǎn)與中醫(yī)基礎(chǔ)理論從整體觀念、辨證論治的角度去診治疾病的理念，中藥及方劑的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的原理非常契合[10]。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討四君子湯治療AD的可能作用機(jī)制，以期為四君子湯的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 四君子湯有效成分及其靶點(diǎn)的篩選

以“人參”、“白術(shù)”、“茯苓”、“甘草”為關(guān)鍵詞，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查詢?nèi)藚ⅰ仔g(shù)、茯苓、甘草四味中藥的有效成分，本研究基于ADME(藥物吸收、分布、代謝、排泄)參數(shù)進(jìn)行篩選，對人參、白術(shù)、茯苓、甘草的有效成分根據(jù)口服利用度(oral bioavailability OB)和類藥性(drug- like，DL)篩選出符合條件的候選活性成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)，并設(shè)置OB≥30%及DL≥0.18作為篩選條件[11]，篩選出人參、白術(shù)、茯苓、甘草的有效成分。通過篩選，559個(gè)化合物分子中有136個(gè)符合條件，并將其作為候選化合物。為了提供更準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究只選擇TCMSP數(shù)據(jù)庫中OB≥33%及DL≥0.19作為有效成分，一共篩選出24個(gè)活性化合物。最后，使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫并借助Perl 語言，將靶點(diǎn)的“蛋白名(protein name)”統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為“基因名(genename)”，得到的信息用于后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析。

1.2 AD疾病相關(guān)基因的篩選

通過治療靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫Drugbank (https://www.drugbank.ca/)、Dis Ge NET(http:// www.disgenet.org/)和TTD(https://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)對AD相關(guān)的基因進(jìn)行篩選，將四君子湯預(yù)測的相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)映射到AD相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，2個(gè)網(wǎng)絡(luò)中重疊的基因即被認(rèn)為是四君子湯中藥成分治療AD的作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將四君子湯預(yù)測的相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)映射到AD相關(guān)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，2個(gè)網(wǎng)絡(luò)中交集基因即被認(rèn)為是四君子湯中藥成分治療AD的作用靶點(diǎn)。將四君子湯有效成分與AD的交集基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫，選擇物種為“Homo sapiens”(人源)進(jìn)行操作，最小相互作用閥值設(shè)為“medium confidence=0.4”，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，即“四君子湯-靶點(diǎn)-阿爾茨海默病”網(wǎng)絡(luò)。

1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，?jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)整體的中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)和點(diǎn)度中心性(degree centrality，DC)，以betweenness、closeness和degree的均數(shù)為“閾值”，選取betweenness、closeness和degree同時(shí)在閾值之上的靶點(diǎn)為“關(guān)鍵靶點(diǎn)”，明確PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的代謝通路與生物過程分析

為進(jìn)一步研究四君子湯抗AD的作用情況，采用Metascape平臺(tái)對四君子湯的AD靶點(diǎn)群進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析，研究四君子湯靶點(diǎn)的主要抗AD代謝通路；再進(jìn)行GO生物過程富集分析，詮釋四君子湯靶點(diǎn)的抗AD生物過程，Metascape的平臺(tái)列表與背景均選擇“Homo Sapiens”(人源)進(jìn)行操作。篩選出AD與四君子湯有效成分相關(guān)性前20的分子功能和前10的信號通路。

1.6 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將四君子湯有效成分、對應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1構(gòu)建四君子湯-有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.7 體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

1.7.1 細(xì)胞與試劑

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜絡(luò)細(xì)胞瘤細(xì)胞株P(guān)C12細(xì)胞(長沙贏潤生物技術(shù)有限公司)；Aβ25-35(購自美國Sigma公司)；TB Green Premix Ex Taq PCR試劑盒(TAKARA公司)；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(北京默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；10%新生小牛血清(Hyclone Lab)；PBS(北京索萊寶科技有限公司)；FBS(吉泰遠(yuǎn)成生物科技有限公司)。四君子湯1劑購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，經(jīng)水提、蒸發(fā)、濃縮至不流動(dòng)的清膏，使用時(shí)稱取適量，溶解，過 0.22 μm 濾膜除菌后于-20 ℃保存。

1.7.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù)

PC12細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS、1%PBS)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后取對數(shù)生長期細(xì)胞，分為5組。對照組：加入不含F(xiàn)BS、PBS DMEM中孵育24 h；模型組：予Aβ25-35(20 μmol/L)孵育24 h[12]；四君子湯低劑量組(1 mg/mL)、中劑量組(2 mg/mL)、高劑量組(4 mg/mL)孵育24 h。

1.7.3 QPCR檢測PC12細(xì)胞培養(yǎng)上清APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAOB、INSR mRNA表達(dá)

Trizol法提取PC12細(xì)胞總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成c DNA。使用Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物序列(見表1)。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min→95 ℃ 5 s → 60 ℃ 1 min，重復(fù)40個(gè)循環(huán)；按95 ℃ 15 s→55 ℃ 1 min→95 ℃ 30 s反應(yīng)條件測溶解曲線。以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.7.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 四君子湯有效成分的篩選和靶標(biāo)預(yù)測及分析

為了提供更準(zhǔn)確的結(jié)果，本研究選擇TCMSP數(shù)據(jù)庫中OB≥33%及DL≥0.19作為有效成分，一共篩選出24個(gè)活性化合物(如表2)。其中人參有效成分9個(gè)、白術(shù)有效成分3個(gè)、茯苓有效成分6個(gè)、甘草有效成分6個(gè)。其中人參皂苷Rh2、人參二醇、茯苓多糖、異甘草素等在活性成分中占主要比例。對四君子湯候選靶標(biāo)進(jìn)行基因分析，取P值排名前 20位，得到候選靶標(biāo)的基因功能，涉及抗凋亡、抗炎、對β淀粉樣蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、對自噬的調(diào)控、老化、記憶、對胰島素的反應(yīng)、氧化還原過程等。對四君子湯候選靶標(biāo)進(jìn)行通路富集分析，取P值排名前20位，得到候選靶標(biāo)參與的通路信息，主要涉及凋亡、阿爾茨海默病、炎癥反應(yīng)、自噬、胰島素代謝等通路。

表2 四君子湯有效成分Table 2 Effective ingredients of Sijunzi Decoction

2.2 有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選后四君子湯的28個(gè)有效成分及166個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入 Cytoscape 3.7.1構(gòu)建“四君子湯有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)”(見圖1)。24個(gè)菱形表示四君子湯的有效成分，164個(gè)綠色三角形為有效成分作用靶點(diǎn)，共有898條邊代表靶點(diǎn)和有效成分之間的相互作用，體現(xiàn)了四君子湯多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

圖1 四君子湯有效成分-基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Effective ingredients of Sijunzi Decoction-gene target network注：藍(lán)色菱形：人參活性成分；紅色菱形：白術(shù)活性成分；黃色菱形：茯苓活性成分；紫色菱形：甘草活性成分；綠色三角：靶基因。Note:Blue diamond:Active compound of Ginseng Radix et Rhizoma;Red diamond:Active compound of Atractylodis Macrocephalae Rhizoma;Yellow diamond:Active compound of Poria cocos;Purple diamond:Active compound of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma;Green triangle:Target gene.

2.3 阿爾茨海默病相關(guān)基因

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD數(shù)據(jù)庫檢索AD的靶基因，去重后共得到2 245個(gè)基因。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

在Drugbank、Dis Ge NET和TTD數(shù)據(jù)庫檢索AD的靶基因與四君子湯作用的靶基因有102個(gè)重復(fù)，這102個(gè)靶基因可能為四君子湯抗AD的靶點(diǎn)。為研究各靶點(diǎn)在體內(nèi)的相互作用關(guān)系，尋找核靶點(diǎn)，將潛在靶點(diǎn)蛋白群進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(見圖2)，結(jié)果共發(fā)現(xiàn)102個(gè)靶蛋白發(fā)生相互作用，產(chǎn)生722條代表蛋白之間相互作用的邊。其中疾病靶標(biāo)主要有PSEN1(早老素1)、PSEN2(早老素2)、APOE(載脂蛋白E)、APP(淀粉樣β前體蛋白)等，藥物靶標(biāo)主要有CASP3(半胱天冬酶3)、Bax(凋亡調(diào)節(jié)劑Bax)、Bcl-2(凋亡調(diào)節(jié)劑Bcl-2)、mTOR(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶mTOR)、MAPK1(絲裂原激活的蛋白激酶1)、MAOB(單胺氧化酶B)、CDK5(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶-5)、GSK-3β(糖原合酶激酶3β)、INSR(胰島素受體)，這些藥物靶標(biāo)主要涉及細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬、胰島素代謝等。

圖2 靶蛋白 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network diagram of target protein

2.5 核心靶點(diǎn)分析結(jié)果

Cytoscape 3.7.1計(jì)算得到，PPI網(wǎng)絡(luò)平均度值為14.2，平均介數(shù)為3.6×10-2，平均緊密度為0.5，度值、介數(shù)和緊密度均超過平均值的靶蛋白共7個(gè)，依次為APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAOB、INSR，說明以上7個(gè)靶點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于鍵位置，很可能是四君子湯抗AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.6 Metascape分析的KEGG和GO結(jié)果

通過GO數(shù)據(jù)庫分析，四君子湯有效成分靶標(biāo)與AD疾病靶標(biāo)基因功能有神經(jīng)元凋亡過程、對β淀粉樣蛋白的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、老化、記憶、神經(jīng)元凋亡過程的正調(diào)控、對氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)、自噬、對胰島素的反應(yīng)、細(xì)胞對胰島素刺激的反應(yīng)、MAPK級聯(lián)反應(yīng)、自噬的調(diào)控、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等條目(見圖3)。說明四君子湯治療AD的機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞凋亡、淀粉樣β蛋白聚集、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬、胰島素代謝等密切相關(guān)。

圖3 有效組分-基因靶點(diǎn)-分子功能的GO富集氣泡圖Fig.3 Bubble chart of GO enrichment of effective components-gene targets-molecular functions

通過KEGG數(shù)據(jù)庫富集四君子湯治療AD關(guān)鍵靶標(biāo)所參與的通路主要涉及凋亡、阿爾茨海默病、MAPK信號通路、mTOR信號通路、NF-κB信號通路、Wnt信號通路、IL-17信號通路、PI3K-Akt信號通路、Notch信號通路、胰島素信號通路等(見圖4)，說明四君子湯可能主要通過調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、自噬、胰島素代謝等來防治AD。

圖4 前10個(gè)代表性的通路Fig.4 Top 10 representative pathways

2.7 四君子湯對 Aβ25-35誘導(dǎo)的 PC12細(xì)胞APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MAOB、mTOR、INSR mRNA的影響

Aβ25-35作用24 h，Bcl-2表達(dá)下調(diào)(P<0.01)，APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達(dá)上調(diào)(P<0.01)，表明 Aβ25-35可誘導(dǎo)活化各基因；四君子湯干預(yù)后，四君子湯中、高劑量組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05，P<0.01)，APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達(dá)明顯降低(P<0.05，P<0.01)(見表3)。

表3 PC12細(xì)胞APP、Caspase-3、Bax、Bcl-2、MAOB、mTOR、INSR mRNA表達(dá)比較Table 3 Comparison of APP,Caspase-3,Bax,Bcl-2,MAOB,mTOR,INSR mRNA expression in PC12 cells

3 討論

AD屬于中醫(yī)學(xué)“健忘”“癡呆”“呆證”等范疇，脾胃在AD發(fā)病中具有重要的作用。脾胃為后天之本，氣血生化之源，脾胃能將化生的水谷精微運(yùn)化至腦，以充養(yǎng)腦髓。Xia[13]認(rèn)為脾胃運(yùn)化功能旺盛，水谷精微化生有源，才能充血生精。脾胃虛弱，運(yùn)化無力，則氣血津液化源不足，臟腑虧虛，后天之精來源匱乏，致腎精虛損，腦髓空虛，神機(jī)失用,發(fā)生癡呆。Zhang[14]指出脾胃虧虛，后天失養(yǎng)，一則腎精不足，不能充養(yǎng)腦髓；二則津液不足，無以內(nèi)滲于骨空，而髓減腦消，發(fā)生癡呆。四君子湯始載于《太平惠民和劑局方》，為治脾胃氣虛的基本方。實(shí)驗(yàn)研究表明，四君子湯水提液能提高Aβ25-35誘導(dǎo)的 HBMEC 損傷細(xì)胞的活性，調(diào)控GLUT1、LRP1、RAGE mRNA和LRP1蛋白、RAGE蛋白的表達(dá)，有助于Aβ跨血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)，減少Aβ在腦內(nèi)的聚集[6]；四君子湯可能通過補(bǔ)脾作用，促進(jìn)AD大鼠中樞能量生成，改善中樞的能量代謝紊亂，調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合體活性及AMPK表達(dá)[7]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[8]，四君子湯合黃連解毒湯治療阿爾茨海默病療效顯著。

本研究通過中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)收集四君子湯中4味中藥有效成分和靶標(biāo)，結(jié)果顯示：每味中藥可作用于多個(gè)靶標(biāo)，多種中藥可同時(shí)作用于一個(gè)靶點(diǎn)，說明藥物間發(fā)揮作用有著密切的關(guān)系，各藥相須相使相輔相成。對基因功能和通路富集的分析顯示，四君子湯對 AD的干預(yù)作用主要涉及細(xì)胞凋亡、淀粉樣β蛋白聚集、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬、胰島素代謝等。通過構(gòu)建四君子湯潛在藥物靶標(biāo)與疾病靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出關(guān)鍵靶標(biāo)7個(gè)，其中疾病靶標(biāo)主要有PSEN1、PSEN2、APOE、APP等，藥物靶標(biāo)主要有APP、CASP3、Bax、Bcl-2、mTOR、MAPK1、MAOB、CDK5、GSK-3β、INSR。構(gòu)建疾病靶標(biāo)與有效成分的網(wǎng)絡(luò)，共有24種有效成分，四君子湯中與疾病靶標(biāo)關(guān)系密切的有效成分主要為人參皂苷Rh2、人參二醇、茯苓多糖、異甘草素等。Cai[15]研究表明，人參皂苷Rh2能夠抑制Aβ25-35激活的BV-2細(xì)胞內(nèi)前炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，并進(jìn)一步抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而減輕對神經(jīng)元的損傷，在AD發(fā)病中具有保護(hù)作用。Liang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，人參二醇可提高AD細(xì)胞模型的存活率，抑制乳酸脫氫酶(LDH)的釋放，且能顯著抑制細(xì)胞凋亡，減輕內(nèi)Ca2 +超載。Hou等[17]研究發(fā)現(xiàn)茯苓多糖能增強(qiáng)超氧化物歧化酶的活性，降低丙二醛的含量，均有利于生物體內(nèi)自由基的清除，起到延緩衰老的作用。Li[18]研究發(fā)現(xiàn)異甘草素對Aβ25-35處理PC12細(xì)胞毒性及細(xì)胞凋亡有較好的保護(hù)作用。

采用四君子湯干預(yù)Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞模型驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)四君子湯可顯著上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達(dá)。Aβ的異常沉淀是APP過度表達(dá)的后果[19]。Caspase-3是Caspases級聯(lián)反應(yīng)中下行的最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶，在各種程序啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡中起最后樞紐的作用[20]，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵標(biāo)志因子，有人稱之為“死亡蛋白酶”。研究表明，AD腦內(nèi)神經(jīng)元的丟失機(jī)制與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，海馬神經(jīng)元凋亡是受各種基因調(diào)控的程序化死亡過程，其病理生理機(jī)制十分復(fù)雜，在凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是Bc1-2和Bax對細(xì)胞凋亡的調(diào)控[21]。MAOB基因的異常表達(dá)或突變與AD的發(fā)生具有密切關(guān)系[22]。MAOB 活性下降有利于保持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，對機(jī)體的抗氧化及抗衰老有促進(jìn)作用[23]。mTOR的活性是自噬體形成、成熟的關(guān)鍵[24]。Liu等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在AD細(xì)胞模型中的INSR基因和蛋白水平均升高。四君子湯可上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)APP、Caspase-3、Bax、MAOB、mTOR、INSR表達(dá)，與預(yù)測其參與調(diào)控β淀粉樣蛋白聚集、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬、胰島素代謝相吻合。故體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在一定程度上證實(shí)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測結(jié)果。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，采用整合藥理學(xué)平臺(tái)，建立了四君子湯成分-基因靶標(biāo)的分子生物網(wǎng)絡(luò)、蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，從多個(gè)角度探索四君子湯治療AD的潛在分子機(jī)制。結(jié)果表明，四君子湯可通過調(diào)控β淀粉樣蛋白聚集、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)、自噬、胰島素代謝等多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療AD的作用，其具體機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)還需通過更深入的實(shí)驗(yàn)研究加以驗(yàn)證。