孫曉東，周 珍，曾 煉，謝麗霞，杜凱麗，桑 明,2*

1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院，襄陽 441000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院 武當(dāng)特色中藥研究湖北省重點實驗室，十堰 442000

白藜蘆醇(resveratrol，RES)，是一種非黃酮類的多酚化合物，廣泛存在于葡萄、花生等植物以及虎杖等中藥材，作為低毒性的天然藥物發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化等作用，此外，白藜蘆醇也是一種很有前景的抗腫瘤藥物[1-3]。它的靶點廣泛，如mTOR、JAK、β-amyloid、Adenylyl cyclase、IKKβ、DNA polymerase，也是一種特異性的SIRT1活化劑和有效的孕烷X受體(PXR)抑制劑[4,5]。新近研究發(fā)現(xiàn)，RES對多種腫瘤具有體內(nèi)外抑制活性[6-9]，但RES作為一種抗癌藥物的臨床試驗還是很有限，在腫瘤動物模型中測試RES的研究結(jié)果表明，RES對胃腸道腫瘤主要發(fā)揮預(yù)防作用。而在乳腺癌動物模型中RES有可能成為癌癥治療劑，然而，這種有益作用取決于動物和細胞類型[10]。RES對于人類HPV病毒感染的宮頸癌模型發(fā)揮什么樣的作用，相關(guān)報道較少。本研究主要利用HeLa細胞在裸鼠皮下成瘤，檢測RES在體內(nèi)的抑癌效應(yīng)，通過檢測RES在宮頸癌細胞自噬方面發(fā)揮的作用，從體內(nèi)外兩方面探討RES通過促進細胞自噬性死亡抑制宮頸癌的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

細胞培養(yǎng)及研究所用的DMEM(11965-092)、胰酶(25300054)(Gibco公司，美國)；二甲基亞砜(DMSO，D2650)、Trizol試劑(93289-100ML)(Sigma公司，美國)；逆轉(zhuǎn)錄酶(M1705)、RNA酶抑制劑(N2511)(Promega公司，美國)；SYBR Green PCR Mix(1725204)(Bio-Rad公司，美國)；Rabbit Anti-LC3 Polyclonal Antibody(abs127815)、Rabbit anti-p62/SQSTM1 Polyclonal Antibody(abs143300)、Rabbit Anti-TMEM49 Polyclonal Antibody (abs126424)、Rabbit Anti-Beclin 1 Polyclonal Antibody(abs122672)(愛必信生物科技有限公司，中國)；細胞凋亡-Hoechst染色試劑盒(C0003)、Ad-GFP-LC3B(C3006-1ml)、Ad-mCherry-p62(C3016-1ml)、Ad-mCherry-GFP-LC3B(C3011-1ml)、Mito-Tracker Red CMXRos(C1049-50 μg)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(A0208)、山羊抗小鼠二抗(A0216)(碧云天生物科技有限公司，中國)；SpectraMax i3x酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司，美國)；Ⅸ70倒置熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；ABI 7500-PCR儀(Life technology公司，美國)；BD FACSAria II流式細胞儀(BD公司，美國)。

1.1.2 實驗動物

SPF級BALB/c裸小鼠，6周齡，雌性，體重18～20 g，購自湖南斯萊克景達公司[SCXK(湘)2019-0004]，在本實驗室無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間【SCXK(鄂)2017-0093】飼養(yǎng)。按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷，所有動物實驗通過襄陽市第一人民醫(yī)院動物倫理委員會審批(審批號：20170622)。

1.2 方法

1.2.1 動物及腫瘤細胞株

18只Balb/C nude鼠，均于右側(cè)腋中線皮下注射瘤細胞(2×107/mL，100 μL/只)，每三天測量并根據(jù)公式(V= a×b2/2)計算瘤體的體積，做記錄，對實驗小鼠進行稱重。瘤體直徑大于2 mm視為成瘤，將小鼠隨機分成3組：對照組、RES治療組(50 mg/kg)、RES治療組(100 mg/kg)，每組6只。RES治療組采用灌胃給藥，對照組給予等體積含相同濃度溶劑的生理鹽水。每天給藥一次，連續(xù)給藥三周。給藥期間觀察各組小鼠的精神、活動、飲食、飲水情況。給藥三周后處死全部裸鼠。

HeLa細胞(人宮頸癌細胞，HPV18陽性)、SiHa細胞(人宮頸癌細胞，HPV16陽性)、End1/E6E7細胞購自湖南豐匯生物科技有限公司，通過STR鑒定，與文獻報道一致[11,12]。培養(yǎng)于高糖DMEM，添加10%胎牛血清，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 免疫組化檢測LC3B、Beclin-1和P62蛋白在腫瘤組織中的表達

取腫瘤組織，4%多聚甲醛固定、石蠟包理，5 μm連續(xù)切片。采用免疫組化檢測腫瘤組織中LC3B、Beclin-1和P62蛋白的表達，陽性染色呈棕黃色，先在低倍鏡下掃視整個組織切片，在細胞染色清晰，背景良好的區(qū)域選擇4個視野，進行高倍鏡拍照，用Image J軟件讀取4個視野的陽性面積，計算相對表達量。

1.2.3 Real-time RT-PCR檢測自噬相關(guān)基因表達

HeLa細胞用不同濃度RES(10、20、40 μM)、Rapa處理24 h，采用TRIzol試劑提取總RNA，合成 cDNA，用SYBR Green PCR Mix進行PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min，然后95 ℃ 15 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s進行40個循環(huán)，熔解曲線檢測引物特異性。以GAPDH作為內(nèi)參照，2-△△CT計算目的基因相對表達量。引物由金凱瑞生物科技有限公司合成(武漢)，序列如下表1。

表1 引物列表Table 1 List of primers

1.2.4 Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達

HeLa細胞同“1.2.3”處理，用預(yù)冷的PBS清洗培養(yǎng)板的細胞，加蛋白裂解液冰上提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后加樣緩沖液混合，100 ℃煮5 min。在12% SDS-PAGE電泳膠中電泳分離，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗、二抗，以GAPDH為內(nèi)參照，用ECL發(fā)光法顯色，用Bio-Rad成像設(shè)備曝光采圖，Image Lab軟件讀取條帶灰度值，計算相對表達量。

1.2.5 腺相關(guān)病毒Ad-GFP-LC3B、Ad-mCherry-p62、Ad-mCherry-GFP-LC3B感染HeLa細胞

HeLa細胞接種到24孔細胞爬片上，每孔2.5×104個細胞，培養(yǎng)24 h完全貼壁后，換800 μL新鮮培養(yǎng)液，按照美國CDC的生物安全等級及其操作與防護要求進行感染實驗，每孔以MOI值為5進行腺病毒感染，感染后約24 h，除去含有病毒的培養(yǎng)液，每孔加入1 mL新鮮的完全培養(yǎng)液，按照分組對細胞進行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用Hoechst染細胞核，PBS清洗后，取出細胞爬片，扣于有封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察細胞生長狀況及熒光蛋白表達情況，根據(jù)熒光強度判斷細胞自噬水平。

1.2.6 JC-1試劑盒檢測細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential)△Ψm

JC-1是一種廣泛用于檢測△Ψm的理想熒光探針。在△Ψm較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以產(chǎn)生紅色熒光；在△Ψm較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體(monomer)，可以產(chǎn)生綠色熒光。常用紅綠熒光的相對比例來衡量線粒體去極化的比例?！鳓穖的下降是細胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到△Ψm的下降，同時也可以作為細胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。將HeLa和SiHa細胞分為對照、RES、自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)、自噬抑制劑巴伐洛霉素A1(bafilomycin A1，BAFA1)、RES+Rapa、RES+BAFA1，共6組，RES工作濃度為40 μM，Rapa工作濃度為100 nM，BAFA1工作濃度為100 μM。處理24 h，用PBS洗滌細胞兩次，直接用1 mL JC-1染色工作液孵育細胞，或用0.25%的胰酶消化后收集細胞，用1mL JC-1染色工作液充分混勻，37 ℃ 孵育15 min，根據(jù)試劑說明，用流式細胞儀檢測進行檢測。

1.2.7 一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(紅色熒光) 檢測細胞凋亡

將HeLa按照“1.2.6”方法處理24 h，用PBS洗滌細胞兩次，4%多聚甲醛固定細胞30 min，用PBS洗滌一次，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min，用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒進行檢測，TdT酶與熒光標(biāo)記液按1∶9配制，每孔細胞加TUNEL檢測液50 μL，室溫避光孵育60 min，PBS洗滌3次，用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RES顯著抑制裸鼠皮下移植瘤生長

用藥期間，每組裸鼠進食、飲水、體重及活動狀況良好，未見明顯不良反應(yīng)。與對照組相比，RES(50 mg/kg)和RES(100 mg/kg)治療組腫瘤大小和質(zhì)量明顯低于Vehicle組(P<0.05)。結(jié)果見圖1a和1b。

2.2 RES顯著促進腫瘤組織中LC3B和Beclin-1表達、抑制P62表達

免疫組化檢測腫瘤組織中LC3B、P62和Beclin-1蛋白的表達量，結(jié)果顯示RES可以上調(diào)LC3和Beclin-1的蛋白表達水平同時下調(diào)P62蛋白表達水平，且有一定的濃度依賴。結(jié)果如圖1c所示。這提示RES抑制宮頸癌生長可能與促進細胞自噬有關(guān)。

圖1 RES抑制宮頸癌裸鼠皮下移植瘤的生長Fig.1 RES inhibits the growth of cervical cancer subcutaneous xenografts in nude mice注：(a)HeLa細胞裸鼠皮下移植腫瘤生長體積；(b)HeLa細胞裸鼠皮下移植腫瘤重量，與Vehicle組相比較，**P < 0.01，***P < 0.001；(c)腫瘤組織切片進行免疫組化檢測自噬相關(guān)蛋白P62、Beclin-1和LC3B(標(biāo)尺：20 μm)。Note:(a)The tumor volume;(b) The tumor weight,compared with vehicle,**P <0.01,***P <0.001.(c) The autophagy-related protein levels of P62,Beclin-1,and LC3B in tumor tissue was detected using immunohistochemical (Scale bar:20 μm).

2.3 RES調(diào)控細胞自噬相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達

為證實RES是否調(diào)控宮頸癌細胞自噬，我們通過Real-time RT-PCR檢測細胞自噬相關(guān)基因VMP1、Beclin-1和P62的mRNA表達，結(jié)果顯示RES可以顯著促進自噬基因VMP1、Beclin-1的表達，顯著抑制P62的表達，與自噬激活劑Rapa的效果相似，其中40 μM RES與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果如圖2a所示。Western blot檢測結(jié)果也顯示RES促進自噬相關(guān)蛋白VMP1、Beclin-1和LC3B的表達，如圖2b所示。Ad-GFP-LC3B和Ad-mCherry-p62感染細胞后，熒光顯微鏡檢測結(jié)果顯示，RES抑制P62的表達，促進LC3B的表達，如圖2c所示。

圖2 RES促進宮頸癌細胞自噬Fig.2 RES promotes autophagy of cervical cancer cells注：(a)Real-time RT-PCR檢測HeLa細胞中VMP1、Beclin-1、P62 mRNA表達水平，與對照組比，*P < 0.05；(b)Western blotting檢測HeLa細胞中VMP1、Beclin-1、LC3B 蛋白表達水平；(c)Ad-GFP-LC3B和Ad-mCherry-p62感染細胞后，熒光顯微鏡檢測小體(標(biāo)尺：20 μm)。Note:(a)The expression levels of VMP1,Beclin-1,P62 mRNA in HeLa cells was detected using Real-time RT-PCR,compared with the control group, *P <0.05;(b) The protein levels of VMP1,Beclin-1,LC3B in HeLa cells was detected using Western blotting;(c)RES inhibited the expression of P62 and promoted the expression of LC3B,increased the number of autophagosomes (Scale bar:20 μm).

2.4 RES促進HeLa細胞發(fā)生細胞自噬

為檢測RES誘導(dǎo)的細胞自噬是否與線粒體損傷相關(guān)，在感染 Ad-GFP-LC3B后，RES、Rapa、BAFA1單獨或聯(lián)合作用細胞24 h后，再用Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記線粒體，然后用熒光顯微鏡檢測拍照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP-LC3B標(biāo)記的自噬小體增加伴隨Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記的線粒體的減少，如圖3a所示。因為BAFA1抑制自噬小體的酸化，所以RES與BAFA1聯(lián)合組自噬小體累積明顯(圖3a)。而P62蛋白在RES組、Rapa組、RES + Rapa組都明顯降低，BAFA1組、BAFA1 + RES組沒有明顯變化(圖3b)，這也說明BAFA1或者BAFA1與RES聯(lián)用抑制自噬小體的降解。另外，為檢測RES對自噬流的影響，用雙熒光標(biāo)記的腺相關(guān)病毒載體Ad-mCherry-GFP-LC3B感染HeLa細胞，24 h后再用RES、Rapa、BAFA1單獨或聯(lián)合作用細胞24 h，然后用熒光顯微鏡檢測拍照，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(mCherry和GFP的綜合效果)形式存在于細胞質(zhì)中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下mCherry-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點的形式表現(xiàn)出來(LC3B dot or punctae)；當(dāng)自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點的形式表現(xiàn)出來。結(jié)果顯示RES促進HeLa細胞自噬流的發(fā)生，RES組與對照組相比，細胞內(nèi)黃色斑點明顯增加，說明自噬小體形成增多；RES + Rapa組比Rapa組紅色斑點增加，說明自噬溶酶體增多；BAFA1組、RES + BAFA1組只有綠色熒光，而且綠色熒光有進入細胞核的現(xiàn)象，如圖3c。這些提示RES促進細胞自噬流的形成，而 BAFA1阻斷自噬流后RES不能再恢復(fù)自噬流。

圖3 RES對HeLa細胞自噬的影響Fig.3 Effects of RES on autophagy of HeLa cells注：(a)Ad-GFP-LC3B標(biāo)記自噬小體,Mito-Tracker Red CMXRos標(biāo)記線粒體，熒光顯微鏡觀察自噬小體的變化(標(biāo)尺：20 μm)；(b)Ad-mCherry-p62標(biāo)記P62，RES與Rapa、BAFA1處理HeLa細胞24 h后，熒光顯微鏡拍照(標(biāo)尺：20 μm)；(c)Ad-mCherry-GFP-LC3B檢測自噬流(標(biāo)尺：20 μm)。Note:(a) Ad-GFP-LC3B labeled autophagosomes,Mito-Tracker Red CMXRos labeled mitochondria,the changes of autophagosomes was observated by fluorescence microscope (Scale:20 μm);(b) Ad-mCherry-p62 labeled P62,RES and Rapa,BAFA1 treated HeLa cells for 24 h,the changes of autophagosomes was observated by fluorescence microscope (Scale:20 μm);(c) Autophagic flow of HeLa cells was detected by using Ad-mCherry-GFP-LC3B (Scale bar:20 μm).

2.5 RES抑制宮頸癌與降低△Ψm相關(guān)

JC-1檢測結(jié)果顯示RES，Rapa和BAFA1對宮頸癌細胞的△Ψm具有不同的影響，RES和BAFA1不同程度的誘導(dǎo)HeLa細胞(圖4a、c)和SiHa(圖4b、c)△Ψm降低，Rapa對△Ψm的影響不明顯(圖4a、b、c)； 與單獨使用RES組相比，同時使用RES和Rapa，△Ψm降低比例有所減少，但沒有統(tǒng)計學(xué)差異，而同時使用RES和BAFA1組的細胞△Ψm降低更加顯著，如圖4a、b、c。△Ψm的降低，是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，它可引起線粒體膜發(fā)生一連串的生物化學(xué)變化，導(dǎo)致細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，因此JC-1可以用于早期的細胞凋亡檢測，△Ψm下降的比例增加，也說明發(fā)生早期凋亡的細胞比例也增加。接下來，用TUNEL試劑檢測HeLa細胞各組處理后的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)HeLa細胞凋亡比例的變化與△Ψm降低的比例基本一致，RES和BAFA1不同程度的誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡，兩者聯(lián)合使用后，細胞凋亡比例增加；Rapa對細胞凋亡沒有明顯作用，與單獨使用RES相比，RES和Rapa聯(lián)合組細胞凋亡比例有所下降(如圖4d)。這些結(jié)果提示RES對線粒體膜電位以及細胞凋亡的作用在與BAFA1聯(lián)用后有疊加效應(yīng)，與Rapa聯(lián)用后有消減效應(yīng)，說明RES對宮頸癌細胞的自噬和凋亡都有影響，自噬激活的情況下凋亡減弱，自噬抑制的情況下凋亡增強。

圖4 RES與Rapa、BAFA1誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡Fig.4 RES and Rapa,BAFA1 induce cervical cancer cell apoptosis注：(a)流式檢測RES與Rapa、BAFA1對HeLa細胞線粒體膜電位的影響；(b)流式檢測RES與Rapa、BAFA1對SiHa細胞線粒體膜電位的影響；(c)圖a和圖b結(jié)果的統(tǒng)計分析，與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；(d)熒光顯微鏡檢測RES與Rapa、BAFA1對HeLa細胞凋亡的影響。Note:(a) The effect of RES,Rapa,and BAFA1 on the mitochondrial membrane potential of HeLa cells;(b) The effect of RES,Rapa,and BAFA1 on the mitochondrial membrane potential of SiHa cells;(c) Statistical analysis of (a) and (b),compared with the control group,*P <0.05,**P <0.01;(d) The effect of RES,Rapa,and BAFA1 on apoptosis of HeLa cells was used by fluorescence microscopy.

3 討論

宮頸癌治療以手術(shù)為主，術(shù)后聯(lián)合化、放療。由于化療藥物大多具有較強的不良反應(yīng)和易產(chǎn)生耐藥性，限制了宮頸癌的臨床治療及預(yù)后，因而尋找抗瘤效果好而毒性低的藥物是臨床治療的緊迫需求。近年來的大量研究證實RES具有良好的抗腫瘤能力，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中均有功效[6,7,9,13]。研究證實，在宮頸癌細胞中組織蛋白酶L介導(dǎo)了白藜蘆醇誘導(dǎo)的自噬性和凋亡性細胞死亡[14]，白藜蘆醇誘導(dǎo)宮頸癌細胞系的線粒體膜電位降低，促進其凋亡的發(fā)生，也可以增加溶酶體通透性[15]。本研究進一步通過體內(nèi)外實驗驗證了白藜蘆醇通過自噬途徑抑制宮頸癌的效應(yīng)，首先通過體內(nèi)實驗證實RES顯著抑制宮頸癌的進展，而且，組織水平檢測發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)蛋白的表達受到RES的調(diào)節(jié)，因此推測RES抑制宮頸癌的機制可能與RES誘導(dǎo)自噬性細胞死亡(autophagic cell death，ACD)的發(fā)生有關(guān)。ACD是細胞發(fā)生過度自噬的結(jié)果，也是與細胞凋亡不同的Caspase非依賴性的Ⅱ型程序性細胞死亡[16]，其主要特征為細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量自噬體和自噬溶酶體，胞質(zhì)中絕大部分物質(zhì)被降解，但細胞核依然保持完整性[17]。在持續(xù)的應(yīng)激狀態(tài)及持續(xù)進展的自噬作用下，細胞會由于過度的自我損耗而死亡[18]。這類細胞的死亡常常帶有自噬特征，主要表現(xiàn)為Beclin1的過表達以及細胞中產(chǎn)生大量自噬體和自噬溶酶體[19]。液泡膜蛋白(vacuole membrane protein-1，VMP1)是公認(rèn)的自噬蛋白，其表達水平與腫瘤惡性程度負相關(guān)[20]，與Beclin-1共同作為激活自噬的分子開關(guān)[21]。VMP1在宮頸癌中的表達以及作用還未見報道。

通過RT-PCR、Western blot以及自噬小體檢測均證實，RES促進宮頸癌細胞ACD的發(fā)生。結(jié)果顯示，在宮頸癌細胞中Beclin-1、VMP1以及位于自噬小體和自噬溶酶體內(nèi)膜的LC3B可以被RES誘導(dǎo)高表達，效應(yīng)與Rapa相似。Rapa是哺乳動物TOR(mTOR)激酶的抑制劑，與FKBP12結(jié)合抑制mTORC1激活自噬，從而發(fā)揮腫瘤抑制作用[22,23]。進一步檢測自噬小體及自噬流，發(fā)現(xiàn)RES和Rapa均可促進自噬小體和自噬溶酶體的形成，兩者聯(lián)用后自噬小體和自噬溶酶體進一步增加，伴隨P62和線粒體的減少，但細胞核仍保持完整；同時，我們觀察到BAFA1可阻斷RES造成的宮頸癌細胞的自噬流，BAFA1與RES聯(lián)用造成自噬小體和P62的累積，伴隨線粒體的顯著減少，而且細胞核明顯異常與其它組。BAFA1是一種從鏈霉菌屬物種中分離的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是特異的 vacuolar-type H+ ATPase(V-ATPase)抑制劑。BAFA1可以靶向線粒體，誘導(dǎo)凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體轉(zhuǎn)至細胞核，促進caspase非依賴性凋亡。此外，BAFA1誘導(dǎo)Beclin-1與Bcl-2結(jié)合，進一步抑制自噬，促進細胞凋亡[24]。我們的實驗結(jié)果也證實了這一點，通過檢測線粒體膜電位和TUNEL陽性率，我們發(fā)現(xiàn)RES可以誘導(dǎo)線粒體膜電位下降促進細胞凋亡，而在自噬激活和自噬抑制的情況下會產(chǎn)生對宮頸癌細胞的不同反應(yīng)。有文獻報道，RES阻止Rapa誘導(dǎo)的P62降解，因此Rapa和RES的聯(lián)合能夠阻止自噬的上調(diào)并誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡[25]。但在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)RES和Rapa聯(lián)用可促進宮頸癌細胞過度自噬，自噬溶酶體的大量形成造成ACD的發(fā)生；而當(dāng)宮頸癌細胞的自噬流被阻斷，RES又可通過降低線粒體膜電位誘導(dǎo)內(nèi)源性的細胞凋亡。

由此可見，RES在婦科腫瘤宮頸癌的治療方面有良好的應(yīng)用前景，而且與自噬激活劑Rapa或者自噬抑制劑BAFA1聯(lián)合使用，能從促進自噬性死亡或者促進細胞凋亡兩個途徑起到更加積極的抗癌作用。