陳鐵樓,許 兵，郭梓琰, 張新海,馬麗婷, 王世鋒,陳 駿,劉 進(jìn) ,方以群

糖尿病型牙周炎(diabetes-associated periodontitis, DAP)患者因血糖升高和糖耐量降低引起機(jī)體抵抗力降低，易誘發(fā)牙齦炎癥、牙槽骨吸收和組織愈合減慢[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者發(fā)生牙周炎的危險(xiǎn)性比非糖尿病患者明顯增高，牙周炎患者凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)增高，可影響胰島細(xì)胞凋亡及其分泌功能。老年牙周炎患者牙齦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)量增加[3]。白細(xì)胞介素1β(IL-1β)可刺激人牙周韌帶細(xì)胞中膠原酶合成，誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶13表達(dá)，調(diào)控人成骨細(xì)胞擴(kuò)增和凋亡[4]。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，DAP患者牙齦組織中IL-1β和腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量高于健康組，牙齦細(xì)胞凋亡明顯增加[5]。高壓氧(hyperbaric oxygen,HBO)可對(duì)人牙周炎起治療作用[6]，但HBO對(duì)DAP患者牙齦細(xì)胞凋亡和凋亡因子表達(dá)及機(jī)制罕見(jiàn)報(bào)道，本研究擬探討HBO對(duì)DAP患者牙齦細(xì)胞凋亡及與IL-1β、TNF-α、前列腺素E2(PGE2)、Caspase3表達(dá)的關(guān)系，為用HBO治療DAP及機(jī)制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

1.2 主要試劑

TNF-α抗體(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)，IL-1β抗體(上海陽(yáng)光生物科研網(wǎng))，PGE2 抗體(上海基免實(shí)業(yè)有限公司)，兔抗Caspase3抗體 (南京凱基生物科技有限公司)。免疫組化(IHC)SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 臨床指標(biāo)測(cè)定 每例患者選10顆牙(包括上頜和下頜切牙各2顆，前磨牙各1顆，磨牙各2顆)，于初診和治療1個(gè)月后，分別測(cè)定各組患者齦溝出血指數(shù)(SBI)和牙松動(dòng)度，按Loe標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定菌斑指數(shù)(PLI)、牙齦指數(shù)(GI)，用標(biāo)準(zhǔn)刻度探針測(cè)定每個(gè)牙的牙周袋深度(PD)和附著喪失(AL)，PD和AL取測(cè)定牙頰側(cè)近中、中央、遠(yuǎn)中和舌側(cè)中央4點(diǎn)的平均值。

1.3.2 HE染色和TUNNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡[5]在臨床指標(biāo)后，每組在治療前和治療后1個(gè)月各選擇符合拔牙適應(yīng)證的2例松動(dòng)牙，拔除時(shí)在其舌側(cè)取牙齦組織，一部分立即放入4%甲醛中固定，待行HE、TUNNEL和IHC染色；另一部分用4%多聚甲醛固定制作透射電鏡標(biāo)本。

取經(jīng)4%甲醛固定24 h牙齦組織，石蠟包埋，切5 μm切片。①HE染色觀察牙齦上皮和固有層細(xì)胞凋亡；②TUNNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況，細(xì)胞凋亡陽(yáng)性染色為棕黃色或褐色。高倍鏡(40倍)下，用10×10網(wǎng)格分別對(duì)視野下的牙齦上皮層陽(yáng)性細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)，每張切片觀察10個(gè)視野，計(jì)算基底層和棘層細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.3 透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡[5]將4%多聚甲醛固定的牙齦組織脫水和樹(shù)脂包埋，常規(guī)超薄切片，醋酸鈾、枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.3.4 IHC測(cè)定牙齦組織中TNF-α、IL-1β、PGE2及Caspase3表達(dá)[5]對(duì)經(jīng)包埋的牙齦組織，5 μm連續(xù)切片,脫蠟,3%過(guò)氧化氫孵育，滴加山羊血清封閉非特異性抗體，加一抗(1∶100)，4 ℃冰箱過(guò)夜。滴加生物素標(biāo)記二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育各15 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，固定封片。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照,陽(yáng)性細(xì)胞染為黃褐色。在顯微鏡( ×200)下用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性染色的吸光度值，每張切片選擇10個(gè)染色陽(yáng)性視野測(cè)定TNF-α、IL-1β、PGE2及Caspase3含量，計(jì)算其均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)和方差分析比較治療前與治療后1個(gè)月時(shí)每?jī)山M間PLI、GI、SBI、PD、AL差異，及牙齦中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3表達(dá)量的差異，兩組間凋亡細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)的差異采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HBO對(duì)牙周臨床指標(biāo)影響

3組在治療后1個(gè)月時(shí)SBI、GI、PD與治療前比均有顯著性差異，治療后1個(gè)月時(shí)HBO+SRP組的SBI、GI、PD、AL比HBO組和SRP組明顯降低；治療后1個(gè)月時(shí)SRP組和HBO+SRP組PLI比治療前明顯降低(表1)。

表1 3組在治療前、治療后1個(gè)月時(shí)SBI、GI、PLI、PD、AL比較Tab.1 Comparison of SBI, GI, PLI, PD, AL between the 3 groups before and 1 month after treatment

2.2 HE染色結(jié)果

HBO組在治療后1個(gè)月時(shí)牙齦上皮層基底細(xì)胞和棘細(xì)胞凋亡比治療前明顯減少，固有層巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞減少，血管明顯增多；SRP組牙齦組織細(xì)胞凋亡減少，血管數(shù)量增加不明顯；HBO+SRP組在治療后1個(gè)月時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)量比HBO組和SRP組減少，凋亡程度減輕，血管數(shù)量明顯增加(圖1 A～C)。

A：HBO組治療前； B：HBO組治療后1個(gè)月； C：HBO+SRP組治療后1個(gè)月; 凋亡細(xì)胞()；紅細(xì)胞(★)；血管(▲)

2.3 TUNNEL結(jié)果

HBO組和SRP組在治療后1個(gè)月時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比治療前明顯減少，凋亡細(xì)胞位于基底細(xì)胞層和棘細(xì)胞層，染色為陽(yáng)性；HBO+SRP組牙齦上皮層和固有層凋亡細(xì)胞數(shù)量比HBO組和SRP組明顯減少，凋亡細(xì)胞呈陽(yáng)性或弱陽(yáng)性(圖2)。HBO+SRP組基底細(xì)胞和棘細(xì)胞的凋亡細(xì)胞指數(shù)比HBO組和SRP組明顯減少(表2)。

A：SRP組; B：HBO組治療前; C：HBO組治療后1個(gè)月；D：HBO+SRP組治療后1個(gè)月；凋亡細(xì)胞()

表2 3組治療前、治療后1個(gè)月時(shí)牙齦上皮層和固有層凋亡細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)比較Tab.2 Comparison of positive expression index of apoptosis cell in basal cell and acanthocyte between 3 groups before and 1 month after treatment %

2.4 超微結(jié)構(gòu)變化

DAP患者在HBO治療前凋亡細(xì)胞核固縮，與胞質(zhì)分離出現(xiàn)間隙，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)疏松形成空泡，胞質(zhì)濃縮，線粒體腫脹，可見(jiàn)胞膜內(nèi)陷形成凋亡小體。HBO組和SRP組在治療后1個(gè)月時(shí)細(xì)胞凋亡數(shù)量和凋亡程度明顯減輕，HBO+SRP組細(xì)胞凋亡的核固縮程度明顯減輕，膠原纖維排列整齊，成纖維細(xì)胞內(nèi)線粒體未見(jiàn)明顯水腫，凋亡小體少見(jiàn)(圖3)。

2.5 HBO對(duì)牙齦組織TNF-α、IL-1β、PGE2和Caspase3表達(dá)影響

DAP患者在HBO治療前牙齦固有層TNF-α、IL-1β、PGE2染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，主要陽(yáng)性細(xì)胞為巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,基底細(xì)胞呈弱陽(yáng)性；牙齦上皮和固有層Caspase3呈強(qiáng)陽(yáng)性，主要陽(yáng)性細(xì)胞為上皮基底細(xì)胞和棘細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞呈弱陽(yáng)性。HBO組和SRP組在治療后1個(gè)月時(shí)TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和染色強(qiáng)度減輕；HBO+SRP組固有層染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量和程度比HBO組和SRP組明顯減輕(圖4)。根據(jù)Lamber-Beer定律，組織中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 含量與吸光度值成正比，可用吸光度值來(lái)反映，治療后1個(gè)月時(shí)3組的牙齦組織中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3值與治療前有顯著性差異，HBO+SRP組治療后1個(gè)月時(shí)TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3 值明顯小于HBO組和SRP組(表3)。

表3 3組治療前、治療后1個(gè)月時(shí)牙齦組織中TNF-α、IL-1β、PGE2、Caspase3吸光度值比較Tab.3 Comparison of absorbency of TNF-α, IL-1β, PGE2 and Caspase3 in gingival between 3 groups before and 1 month after treatment

A：HBO組治療前； B：HBO組治療后1個(gè)月； C：HBO+SRP組治療后1個(gè)月；凋亡細(xì)胞核固縮 (); 線粒體(▲); 纖維(★)

3 討 論

糖尿病與牙周炎存在雙向關(guān)系，DAP與牙齦細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮及蛋白降解，牙周致病性的伴放線聚集桿菌和牙齦卟啉單胞菌可誘導(dǎo)牙齦上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞凋亡[8]。Alikhani等[9]報(bào)道，細(xì)菌脂多糖在TNF-α作用下可增加凋亡因子Caspase8活性，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡；牙齦卟啉單胞菌侵入牙齦上皮2 h，可促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)。糖尿病的高血糖可增加促凋亡基因Caspase 活性和mRNA水平，促進(jìn)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞凋亡[10]，影響傷口愈合和組織修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)，DAP患者牙齦上皮層基底細(xì)胞和棘細(xì)胞凋亡，凋亡細(xì)胞體積變小，線粒體腫脹，胞膜內(nèi)陷，核染色體固縮。

牙周厭氧菌能激活人單核細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶和PGE2，誘導(dǎo)骨吸收。炎癥時(shí)多型核白細(xì)胞浸潤(rùn),釋放TNF-α和IL-1β，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。糖尿病患者高血糖可誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)直接損傷牙周組織或通過(guò)影響胰島b細(xì)胞,激活氧化應(yīng)激敏感信號(hào)通路,包括NF-kB、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)等,導(dǎo)致TNF-α等炎性因子產(chǎn)生，激活膠原酶和破骨細(xì)胞引起牙周組織破壞[11]。DAP由于長(zhǎng)期高血糖導(dǎo)致高級(jí)糖基化終產(chǎn)物增加，通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶刺激細(xì)胞凋亡與細(xì)胞表面受體結(jié)合導(dǎo)致TNF-α、IL-1β和PGE2分泌，促進(jìn)成纖維細(xì)胞凋亡，影響牙周組織修復(fù)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)DAP患者牙齦組織中IL-1β、TNF-α和PGE2表達(dá)量升高，與患者SBI、GI、PD和AL增加和細(xì)胞凋亡程度正相關(guān)。

Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)HBO聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素可抑制脊髓損傷大鼠神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)其損傷修復(fù)。HBO暴露可防止蛛網(wǎng)膜下腔出血引起的兔膀胱細(xì)胞凋亡和收縮能力受損[14]，HBO可上調(diào)BDNF/TrkB信號(hào)通路，通過(guò)抗凋亡和抑制樹(shù)突狀/突觸變性，改善脊髓損傷所致的神經(jīng)功能障礙[15]。本研究發(fā)現(xiàn)HBO組凋亡基因Caspase3表達(dá)明顯降低，HBO+SRP組對(duì)Caspase3作用明顯強(qiáng)于HBO組和SRP組。SRP組患者Capsase3降低可能與牙周潔治去除細(xì)菌對(duì)牙齦細(xì)胞刺激，炎癥因子分泌減少，促凋亡因子減少，細(xì)胞凋亡被抑制有關(guān)。

在牙周炎癥狀態(tài)下，免疫細(xì)胞活動(dòng)增強(qiáng)，炎癥因子合成和分泌增加，參與牙周組織的破壞。牙周致病菌可通過(guò)受損的牙周組織進(jìn)入血循環(huán)，加重糖尿病的發(fā)展[16]。2型糖尿病患者齦溝液中的IL-1β、PGE2 水平明顯高于非糖尿病患者[17]，而IL-1β、PGE2可刺激DAP骨吸收，誘導(dǎo)蛋白酶產(chǎn)生，抑制膠原和非膠原合成[18]。我們以往發(fā)現(xiàn)HBO暴露可抑制牙周袋內(nèi)厭氧菌繁殖對(duì)牙周炎起治療作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)HBO組和SRP組在治療后1個(gè)月時(shí)牙齦中TNF-α、IL-1β、PGE2水平明顯降低，HBO+SRP組牙齦中IL-1β、TNF-α、PGE2水平降低更明顯，且與SBI、GI、PD、AL值及細(xì)胞凋亡指標(biāo)Caspase3表達(dá)降低一致，表明HBO可通過(guò)抑制牙周炎牙齦組織中IL-1β、TNF-α、PGE2產(chǎn)生，降低Caspase3表達(dá)，減少牙齦細(xì)胞凋亡，HBO聯(lián)合SRP對(duì)糖尿病型牙周炎IL-1β、TNF-α、PGE2和Caspase3 抑制作用更明顯，并可維持1個(gè)月以上。有關(guān)HBO暴露對(duì)糖尿病型牙周炎細(xì)胞凋亡的時(shí)間效應(yīng)的影響另文發(fā)表。

炎細(xì)胞 ()；基底細(xì)胞(▲)