孫婷婷,趙松宇,王新法,秦明一,張超,田雪亮

（1.河南科技學(xué)院河南省生物藥肥研發(fā)與協(xié)同應(yīng)用工程研究中心,河南新鄉(xiāng)453003；2.長江師范學(xué)院,重慶408100）

大蔥紫斑病是大蔥的主要病害之一,多發(fā)生在大蔥生育后期,可危害大蔥葉片、花梗,也可危害鱗莖.發(fā)病嚴(yán)重的大蔥葉片和花?？菟?鱗莖腐爛,導(dǎo)致大蔥產(chǎn)量嚴(yán)重下降.該病的病原菌為香蔥鏈格孢,屬半知菌亞門[1-2].除了危害大蔥,該菌還能危害洋蔥、蒜、韭菜等重要的蔬菜作物.大蔥紫斑病的分生孢子借風(fēng)雨傳播,經(jīng)氣孔或傷口侵入大蔥.在適宜的條件下,病菌迅速繁殖,擴(kuò)大侵染,導(dǎo)致發(fā)病迅速加重[3].此外,該病在大蔥貯藏期還可繼續(xù)發(fā)生,造成大蔥葉片腐爛,降低大蔥商品價(jià)值.

目前,大蔥紫斑病的防治主要采用培育無病種苗、輪作、加強(qiáng)栽培管理和噴施化學(xué)藥劑.噴施殺菌劑是當(dāng)前常用方法,但是長期使用會(huì)造成農(nóng)藥殘留,從而導(dǎo)致大蔥品質(zhì)下降,危害人體健康.此外,殺菌劑大量施用還能造成病原菌抗藥性提高,加大防治難度.生物防治具有靶標(biāo)生物選擇性強(qiáng)、環(huán)境兼容性好、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)[4],具有廣闊的發(fā)展前景.目前,我國化學(xué)農(nóng)藥污染較為嚴(yán)重,隨著化學(xué)農(nóng)藥減施增效技術(shù)的大力推廣,利用微生物防治植物病害的地位愈加重要.

植物葉際存在大量的微生物,被稱為葉際微生物.植物葉際微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌等,其中以細(xì)菌數(shù)量最為豐富.大部分葉際微生物對植物有益,能有助于幫助植物固氮、提高植物抗性、幫助植物抵抗病原菌侵染等[5].目前,從植物葉際分離生防細(xì)菌用于防治植物葉部病害已經(jīng)成為挖掘生防資源的主要途徑[6].因此,研究從大蔥葉際分離并篩選對大蔥紫斑病菌有較好生防作用的細(xì)菌,為以后深入開展大蔥紫斑病生物防治奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 大蔥葉際細(xì)菌分離

樣品采集于河南省新野縣大蔥種植基地.從大蔥田間隨機(jī)選取10株大蔥,每株大蔥用無菌剪刀剪取1張頂葉,稱取30 g.然后將大蔥葉片剪成長度3 cm葉段,放入無菌三角瓶中.再向三角瓶中加入50 mL無菌磷酸鹽緩沖液,超聲波（40 Hz）清洗5 min.然后將大蔥葉片取出,剩余洗脫液經(jīng)8 000 r/min離心5 min,棄去上清液,留下沉淀,沉淀中包含大蔥葉際微生物.將沉淀轉(zhuǎn)移至2.0 mL無菌離心管,用無菌磷酸鹽緩沖液定容至1 mL.為了防止菌落重疊,難以純化等問題,將懸浮液稀釋100萬倍[7].取200 μL稀釋液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂（NA）固體平板上,置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h.共設(shè)置10個(gè)重復(fù).根據(jù)菌落的形態(tài)及顏色等挑取不同的單菌落至NB培養(yǎng)液,于28℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩（150 r/min）培養(yǎng)24 h,然后于4℃保存?zhèn)溆?

1.2 拮抗細(xì)菌篩選

采用對峙培養(yǎng)法篩選大蔥紫斑病生防細(xì)菌[8].首先將大蔥紫斑病菌餅（直徑5 mm）接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板中央,然后采用十字交叉法距離菌餅2 cm接種4株大蔥葉際細(xì)菌.將平板放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d后觀察有無抑菌圈出現(xiàn).每個(gè)處理3次重復(fù),設(shè)清水對照.選擇抑菌效果好的葉際細(xì)菌與大蔥紫斑病菌兩兩對峙培養(yǎng),培養(yǎng)條件同前.待對照菌落菌絲即將布滿整個(gè)平板時(shí),測量生防菌對峙的大蔥紫斑病菌落的直徑,按照公式（1）計(jì)算抑菌率.

抑制率/%=（對照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對照病原菌菌落直徑×100. （1）

1.3 拮抗細(xì)菌形態(tài)和分子鑒定

將生防細(xì)菌X85菌株點(diǎn)接到營養(yǎng)瓊脂平板,置于28℃培養(yǎng)3 d,觀察菌落形態(tài)、顏色、邊緣特征等.利用掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征,并測量菌體大小.采用菌落PCR擴(kuò)增生防細(xì)菌X85菌株的16SrDNA序列,引物為 27F（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）[9].PCR擴(kuò)增體系為 20 μL：菌液模板 1 μL,正向引物和反向引物各 1 μL,Taq 酶 0.3 μL,Buffer 2 μL,dNTP 1.2 μL,其余用dd水補(bǔ)足.PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸90 s,31個(gè)循環(huán),最后72℃穩(wěn)定5 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后,送到武漢金開瑞生物工程有限公司測序.所得序列在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行BLAST比對,下載物種相近的序列,然后采用MEGA軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[10].

1.4 拮抗細(xì)菌防效田間測定

將X85接種到NB培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)48 h,作為生防菌劑.選擇大蔥紫斑病重病田,設(shè)置3個(gè)小區(qū),每個(gè)小區(qū)10 m2.大蔥種植后2個(gè)月,接種生防菌劑.選擇陰天早晨,每個(gè)小區(qū)噴霧生防菌劑100 mL.以無菌水為對照.20 d后調(diào)查大蔥葉片紫斑病發(fā)病情況,統(tǒng)計(jì)病情指數(shù).

病情分級標(biāo)準(zhǔn)：0級,無病斑；1級,病斑占整個(gè)葉面積的5%以下；3級,病斑占整個(gè)葉面積的6%～10%；5級,病斑占整個(gè)葉面積的11%～20%；7級,病斑占整個(gè)葉面積的21%～50%；9級,病斑占整個(gè)葉面積的51%以上[11].按照公式（2）根據(jù)處理和對照病情指數(shù)計(jì)算防效.

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌篩選

采用培養(yǎng)法從大蔥葉際共計(jì)分離到385株細(xì)菌,葉際培養(yǎng)細(xì)菌分類結(jié)果如圖1所示.

圖1 葉際培養(yǎng)細(xì)菌分類Fig.1 Taxonomy of phyllosphere bacteria at genus level

由圖1可以看出,在屬水平上,嗜甲基桿菌屬（Methylobacterium）比例為32.5%,其次為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）,比例為 16.9%,微桿菌屬（Microbacterium）比例為 15.8%,假單胞菌屬（Pseudomonas）比例為14.0%.這些細(xì)菌比例較高,為優(yōu)勢細(xì)菌類群,在大蔥葉際細(xì)菌群落中占據(jù)主導(dǎo)地位.其他菌,如泛菌屬（Pantoea）、抗銻斯科曼氏球菌屬（Skermanella）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、沙雷氏菌屬（Serratia）數(shù)量較少,為非優(yōu)勢菌群.

所有分離的細(xì)菌與大蔥紫斑病菌進(jìn)行對峙培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)32株對大蔥紫斑病菌具有一定的拮抗能力.結(jié)果如圖2所示.

圖2 X85對大蔥紫斑病菌菌落和菌絲的抑制作用Fig.2 Inhibition of X85 against colony and mycelium of A.porri

由圖2-A可以看出,X85菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性,并產(chǎn)生明顯的抑菌圈,抑制大蔥紫斑病菌絲延伸.從圖2-B可以看出,在顯微鏡下觀察到大蔥紫斑病菌絲膨大,畸形.這表明大蔥紫斑菌絲的細(xì)胞壁被X85菌株產(chǎn)生的活性物質(zhì)所破壞.X85菌株對大蔥紫斑病菌的抑制率達(dá)到67.5%,抑菌效果最好,因此進(jìn)行下一步分析.

2.2 拮抗細(xì)菌的物種鑒定

X85菌落和菌體形態(tài)特征結(jié)果如圖3所示.

圖3 X85菌落和菌體形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of colony and cell body

由圖3-A可以看出,在NA培養(yǎng)基上,X85菌落呈乳白色,半透明,表面光滑,邊緣較為規(guī)則.由圖3-B可以看出,電子顯微鏡下 X85 菌體呈桿狀,兩端鈍圓,大小為長 1.0～1.1 μm,寬 0.4～0.6 μm.

X85菌株16S rDNA電泳圖結(jié)果和X85菌株16S rDNA序列進(jìn)化樹結(jié)果分別如圖4和圖5所示.

圖4 X85菌株16S rDNA電泳圖Fig.4 The electrophoretogram of 16S rDNA

圖5 X85菌株16S rDNA序列進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of 16S rDNA

圖4 所示,X85菌株的16S rDNA序列長度約為1 436 bp.在NCBI進(jìn)行BLAST比對分析,發(fā)現(xiàn)X85菌株與Pseudomonas lini的相似度最高.從圖5可以看出,菌株X85在MEGA進(jìn)化樹上與P.lini位于同一進(jìn)化分支,是P.lini的近似種.結(jié)合形態(tài)特征和16S rDNA序列鑒定,確定X85菌株為亞麻假單胞菌.

2.3 X85菌株田間防效的測定

從圖6可以看出,經(jīng)過X85生防菌劑處理后,大蔥紫斑病病情指數(shù)為17.4,而對照病情指數(shù)為47.1,差異顯著（P＜0.001）,綜合防效為63.1%.此外,菌劑處理大蔥葉片濃綠,單株質(zhì)量、株高明顯優(yōu)于對照處理,表明該菌還能夠促進(jìn)大蔥生長.

對照和處理大蔥紫斑病情指數(shù)結(jié)果如圖6所示.

圖6 對照和處理大蔥紫斑病情指數(shù)Fig.6 Disease index of Alternaria leaf spot under treatment and control

3 討論

研究從大蔥葉際分離的亞麻假單胞對大蔥紫斑病具有較高的防效.植物葉際生活著大量微生物,包括細(xì)菌、真菌、藻類等,其中細(xì)菌的數(shù)量最多.相對于其他植物葉片平展,大蔥的葉面積相對較小,且蠟質(zhì)層較厚,因此大蔥葉際微生物的數(shù)量可能相對較少.大蔥葉際微生物主要包括嗜甲基桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、微桿菌屬、假單胞菌屬等.其中嗜甲基桿菌數(shù)量最多,比例為32.5%,其次是鞘氨醇單胞菌屬,比例為16.9%.這與他人研究大豆、苜蓿和擬南芥葉際微生物的結(jié)果基本一致[12],表明這兩類菌在植物葉際中占主要地位.

嗜甲基桿菌可以利用植物葉片細(xì)胞壁去甲基化過程中產(chǎn)生的甲醇[13].葉際微生物蛋白組分析也表明,嗜甲基桿菌的甲醇降解相關(guān)酶類非常豐富[14].甲醇對植物具有一定的毒害作用,植物可能利用嗜甲基桿菌來降解甲醇.本研究中嗜甲基桿菌在大蔥葉際細(xì)菌群落中為優(yōu)勢菌群,可能也起到相似的作用.此外,嗜甲基桿菌能夠定植到植物根系,提高植物抗逆性,促進(jìn)植物生長,提高植物產(chǎn)量[15-16].研究嗜甲基桿菌能否促進(jìn)大蔥生長有待進(jìn)一步明確.研究表明,氨醇單胞菌能夠釋放揮發(fā)性有機(jī)物,通過多種單加氧酶和雙加氧酶降解二甲苯和2,4-二氯苯氧乙酸,促進(jìn)植物生長,提高植物抗旱能力[17-20].本研究中,該菌為優(yōu)勢細(xì)菌,可能也起到提高大蔥抗逆性,增強(qiáng)大蔥長勢的作用.

假單胞菌是一類分布廣泛的革蘭氏陰性細(xì)菌,能夠產(chǎn)生多種活性代謝產(chǎn)物,誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性,從而抵抗病原微生物的侵染[21-23].本研究中亞麻假單胞能夠有效抑制大蔥紫斑病菌絲的生長,造成菌絲膨大畸形,抑菌效率為67.5%.耿本聰和徐昭稀研究發(fā)現(xiàn)尼柯霉素能夠有效抑制大蔥紫斑病分生孢子萌發(fā),導(dǎo)致菌絲畸形[24].由此推斷,亞麻假單胞可能產(chǎn)生破壞大蔥紫斑病菌絲細(xì)胞壁的活性物質(zhì),從而導(dǎo)致菌絲畸形.亞麻假單胞一般生活在植物根際土壤中,生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)[25].研究從大蔥葉際分離到亞麻假單胞,表明該菌也能夠在植物葉際生存.

常棟等發(fā)現(xiàn)亞麻假單胞菌對煙草黑脛病有很好的防治效果,抑制率高達(dá)94%,并且該菌株的發(fā)酵液可顯著促進(jìn)田間煙株的株高、莖圍以及有效葉片數(shù)[26].本研究中亞麻單胞菌對大蔥紫斑病的田間防效為63.1%,低于抑快凈52.5%水分散粒劑對大蔥紫斑病的76.3%防效,與世高水分散粒劑防效62.32%相當(dāng),高于克得靈可濕性粉劑（防效60.28%）和氟硅唑質(zhì)量濃度為400 g/L乳油（防效54.45%）[27].總體來看,亞麻假單胞菌對大蔥紫斑病的防治效果較好.

研究從大蔥葉際分離到亞麻假單胞菌,且對大蔥紫斑病抑制作用.后續(xù)應(yīng)深入開發(fā)該菌菌劑,并進(jìn)行大面積應(yīng)用推廣.