周鋒,胡海燕,范玉闖,王金葉,郭子灝,李成偉

（1.河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；3.河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院；河南新鄉(xiāng)453003）

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的三大主要糧食作物之一,年產(chǎn)量為主要糧食作物總產(chǎn)量的20.79%,在我國(guó)糧食作物中占據(jù)了重要的地位[1].小麥莖基腐病（Wheat crown rot）是一種典型的由多種病原菌復(fù)合侵染引起的土傳性真菌病害,從小麥分蘗期到成熟期均可發(fā)生且在世界各小麥產(chǎn)區(qū)均有分布,嚴(yán)重影響了小麥的產(chǎn)量[2-13].近年來(lái),由于種植方式的轉(zhuǎn)變及秸稈還田技術(shù)的大面積推廣,一些腐生菌在田間不斷積累[14].同時(shí),以河南省、山東省和江蘇省為代表的我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)的小麥莖基腐病頻繁發(fā)生,且呈現(xiàn)出病害加重的趨勢(shì)[13-14].已有研究表明小麥莖基腐病至少可由16種以上的鐮孢菌侵染引起,但由于受到地域差異的限制,不同地區(qū)之間的致病優(yōu)勢(shì)種存在明顯的差異[9,15].為了進(jìn)一步明確河南省新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)菌源,研究開展了該病害病原物的分離、純化及rDNA-ITS的分子鑒定研究,試圖從分子水平確定其病原,為病原物的診斷提供依據(jù).

此外,由于該病在小麥的分蘗期至成熟期均可發(fā)病,且目前尚未選育出能夠有效抵抗小麥莖基腐病的抗病小麥品種,所以當(dāng)前對(duì)其仍以化學(xué)藥劑防控為主,但是選用何種殺菌劑對(duì)其進(jìn)行防控具有較好的效果,目前尚不完全清楚.為此,研究開展了該病原菌對(duì)13種殺菌劑的敏感性測(cè)定試驗(yàn),以期為該病害的化學(xué)防控提供指導(dǎo).

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試試劑 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g；葡萄糖20.0 g；瓊脂條20.0 g；dd H2O定容至1.0 L.

2×Taqmastermix,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNAMarker2000,北京博邁德基因技術(shù)有限公司.

1.1.2 供試殺菌劑 本研究中所用到的殺菌劑如表1所示.

表1 供試殺菌劑信息Tab.1 Fungicides used in the current study

1.1.3 主要儀器設(shè)備 SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái),浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司；2720型PCR擴(kuò)增儀,美國(guó)Applied biosystems應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；HP2500G型智能光照培養(yǎng)箱,金壇市瑞華實(shí)驗(yàn)儀器廠；DYY-7C型電泳儀,北京市六一儀器廠；CX31-RBSFA型生物顯微鏡,上海通灝光電科技有限公司；Tanon3500核酸凝膠成像系統(tǒng),上海天能科技有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離與鑒定 本試驗(yàn)中病原菌的分離主要采用組織分離法[16].主要操作步驟如下：①取表現(xiàn)出明顯癥狀的小麥莖基部,在無(wú)菌條件下,將病健交界處剪成大小約為3 mm2的小塊；②分別用5%的次氯酸鈉溶液和70%的乙醇溶液對(duì)上述病塊組織潤(rùn)洗1 min；③將洗消后的冰塊組織用無(wú)菌水沖洗3次,然后再將其置于滅菌濾紙上于超凈臺(tái)內(nèi)晾干后將其用無(wú)菌的鑷子轉(zhuǎn)移到PDA培養(yǎng)基的中央,于22℃的普通光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng).

同時(shí),將新鮮菌塊進(jìn)行微觀形態(tài)觀察,并按照Duan等[17]的方法將上述新鮮菌塊接種到綠豆湯培養(yǎng)基中在溫度為22℃轉(zhuǎn)速為120 r/min的恒溫?fù)u床上進(jìn)行孢子培養(yǎng),3 d后觀察孢子形態(tài).

1.2.2 分子鑒定 采用羅中欽等[18]的方法制備模板DNA,然后用通用引物ITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）（上海生工生物工程股份有限公司）來(lái)擴(kuò)增目標(biāo)片段,按照實(shí)驗(yàn)室常規(guī)PCR反應(yīng)的體系來(lái)進(jìn)行目標(biāo)片段的擴(kuò)增（50.0 μL的反應(yīng)體系：引物I質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL,引物II質(zhì)量濃度為 2.0 μg/mL,模板質(zhì)量濃度為 5.0 μg/mL,2×ES taq master mix質(zhì)量濃度為 25.0 μg/mL,ddH2O補(bǔ)余）,運(yùn)用如下程序（94℃2 min/94℃30 s,55℃30 s 72℃1 min（循環(huán)30次）/72℃10 min,4℃保存即可）對(duì)供試病原菌rDNA-ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),并將檢測(cè)后有明顯單一條帶的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,并對(duì)反饋的測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行初步分析后,將其和GeneBank中下載的相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)、分析,確定病原菌的種類.

1.2.3 殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定 試驗(yàn)中所涉及到的殺菌劑毒力測(cè)定采用室內(nèi)生長(zhǎng)速率法進(jìn)行[19].在無(wú)菌工作臺(tái)上將預(yù)先配制好的殺菌劑母液（多菌靈用濃度為0.1 mmol/L的HCl溶解,其余的原藥均用丙酮溶解）分別稀釋成0.006 25,0.012 50,0.025 00,0.050 00,0.100 00,0.200 00,0.400 00和0.800 00 μg/mL質(zhì)量濃度梯度溶液,其中多菌靈和腐霉利稀釋成0.012 5,0.025 0,0.050 0,0.100 0,0.200 0,0.400 0,0.800 0和1.600 0 μg/mL質(zhì)量濃度梯度溶液；咪鮮胺稀釋成0.000 781,0.001 560,0.003 125,0.006 250,0.012 50,0.025 000,0.050 000和0.100 000 μg/mL質(zhì)量濃度梯度溶液,用加入相應(yīng)體積無(wú)菌水的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照,配制成含一系列濃度梯度殺菌劑的PDA培養(yǎng)基平板.然后將直徑為6 mm的新鮮菌餅接種在每個(gè)平板的中央,后將其轉(zhuǎn)移到23℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),每個(gè)處理至少設(shè)置3次以上重復(fù).培養(yǎng)48 h后采用十字交叉法測(cè)量上述各培養(yǎng)皿中菌落的直徑,并取其平均值.利用DPS軟件按照生長(zhǎng)抑制率公式求出各個(gè)藥劑的EC50值及毒力回歸方程.

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果形態(tài)分析

對(duì)采用組織分離法分離出的病原菌進(jìn)行顯微鏡分析,其結(jié)果如圖1所示.

圖1 小麥莖基腐病原菌菌絲（A）、分生孢子（B）及菌落（C和D）形態(tài)圖Fig.1 Morphologies of mycelia（A）,conidial（B）and colonies（C and D）of the wheat crown rot

圖1結(jié)果表明：該病原菌菌絲直立密集且呈白色,中央的菌絲為黃色,且可產(chǎn)黃色色素；分生孢子一般為大型分生孢子,呈鐮刀型,具2～5個(gè)隔膜,單胞大小為39.1～56.0 μm.

2.2 病原菌rDNA-ITS序列的擴(kuò)增與序列分析

通過(guò)用常規(guī)PCR技術(shù)對(duì)小麥莖基腐病菌的rDNA-ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增,然后對(duì)所得PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,經(jīng)過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察,小麥莖基腐病菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳膠圖如圖2所示.

圖2 通用引物ITS1/ITS4對(duì)小麥莖基腐病菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳膠圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of the wheat crown rot with the common ITS1/ITS4 primers

由圖2結(jié)果可以看出,供試樣品中有一條明亮的條帶,然后取25 μL的PCR產(chǎn)物送至公司測(cè)序,得到了一條521 bp的DNA片段.在將上述獲得的DNA片段上載到NCBI（National Center for Biotechnology nformation,NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明該菌株的rDNA-ITS序列與已報(bào)道的Fusarium pseudograminearum菌株（ID：MH333075.1）的序列高度相似,序列相似性為99.02%,屬于無(wú)性真菌類鐮孢屬成員.

2.3 對(duì)13種殺菌劑的敏感性測(cè)定結(jié)果

本研究通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了13種殺菌劑對(duì)假禾谷鐮刀菌的室內(nèi)毒力,其測(cè)定結(jié)果如表2所示.

表2 13種殺菌劑對(duì)假禾谷鐮刀菌的室內(nèi)毒力Tab.2 Laboratory virulence determination of 13 fungicides against F.pseudograminearum

從表2結(jié)果可以看出,多菌靈和腐霉利的EC50值最高,其EC50值質(zhì)量濃度分別為1.32和1.15 μg/mL,表明小麥莖基腐病菌已經(jīng)對(duì)上述兩種殺菌劑不敏感,即使用常規(guī)劑量的腐霉利和多菌靈來(lái)防控小麥莖基腐病已存在一定的風(fēng)險(xiǎn)；而其它11種殺菌劑對(duì)假禾谷鐮刀菌均具有較高的抑菌活性,其EC50值質(zhì)量濃度分布在0.03～0.97 μg/mL之間,其中,咯菌腈對(duì)該病原菌的抑菌活性最高（質(zhì)量濃度為0.03 μg/mL）,嘧菌酯的抑菌活性相對(duì)較弱（質(zhì)量濃度為0.97 μg/mL）.經(jīng)過(guò)對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行比較,供試殺菌劑對(duì)該病原菌的抑菌活性按照活性由高到低的順序依次為：咯菌腈＞咪鮮胺＞戊唑醇＞嘧菌環(huán)胺＞苯醚甲環(huán)唑＞啶酰菌胺＞氟碇胺＞吡唑醚菌酯＞氟吡菌酰胺＞醚菌酯＞嘧菌酯＞多菌靈＞腐霉利.

檢測(cè)結(jié)果表明上述13殺菌劑均可以作為對(duì)小麥莖基腐病化學(xué)防治的候選殺菌劑,但是使用常規(guī)劑量的腐霉利和多菌靈來(lái)對(duì)其防控時(shí)存在較大的風(fēng)險(xiǎn).

3 結(jié)論與討論

為了進(jìn)一步明確河南省新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)菌源,研究對(duì)所分離到的病原菌開展了rDNA-ITS的分子鑒定研究,通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有結(jié)果進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn),本研究所分離到的小麥莖基腐病的病原為F.pseudograminearum,與已報(bào)道菌株（ID：MH333075.1）的序列高度相似,序列相似性高達(dá)99.02%.即侵染小麥造成河南省新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)的小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原為F.pseudograminearum,與已報(bào)道的豫北地區(qū)小麥莖基腐病的病原一致[20].

目前,對(duì)小麥莖基腐病的化學(xué)藥劑防治雖已有報(bào)道,但是研究結(jié)果主要集中在幾種常見的殺菌劑上[21],尚不能系統(tǒng)地評(píng)估目前已有殺菌劑對(duì)小麥莖基腐病的抑菌情況.研究通過(guò)室內(nèi)分離得到了小麥莖基腐病的病原為F.pseudograminearum,并通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定了13種殺菌劑對(duì)F.pseudograminearum的毒力,結(jié)果表明：除了F.pseudograminearum對(duì)苯并咪唑類殺菌劑多菌靈（EC50質(zhì)量濃度為1.15 μg/mL）和二甲酰亞胺類殺菌劑腐霉利（EC50質(zhì)量濃度為1.32 μg/mL）呈現(xiàn)敏感性降低的現(xiàn)象外,其他11種殺菌劑均對(duì)F.pseudograminearum均具有較高的活性,EC50值質(zhì)量濃度分布在0.03～0.97 μg/mL之間,其按照活性高低的順序依次為咯菌腈＞咪鮮胺＞戊唑醇＞嘧菌環(huán)胺＞苯醚甲環(huán)唑＞啶酰菌胺＞氟碇胺＞吡唑醚菌酯＞氟吡菌酰胺＞醚菌酯＞嘧菌酯＞多菌靈＞腐霉利.進(jìn)一步表明除了使用常規(guī)劑量的腐霉利和多菌靈來(lái)對(duì)其防控時(shí)存在一定的風(fēng)險(xiǎn)外,其它11種殺菌劑均可作為小麥莖基腐病化學(xué)藥劑防治的候備用殺菌劑；同時(shí),因上述殺菌劑對(duì)小麥莖基腐病均具有較好的活性,故在小麥莖基腐病及由F.pseudograminearum引起的病害發(fā)生期間施用上述11種殺菌劑均能夠有效的對(duì)其進(jìn)行防控,對(duì)小麥、玉米等作物的豐產(chǎn)和豐收具有重要的意義.