沈 晗黃玉宇 沈夕坤陳 汀

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽合肥 230012；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇蘇州 215009）

五味消毒飲出自《醫(yī)宗金鑒》，由金銀花、蒲公英、野菊花、紫花地丁、天葵子組成，具有清熱解毒、消癰散結(jié)的作用［1］，方中各藥藥力專一，均能清熱解毒，為治療癤疔瘡癰的經(jīng)典方劑。文獻(xiàn)［2-8］報(bào)道，這5 種中藥（天葵子除外）均為有機(jī)酸、黃酮等抗炎、抗病毒成分，現(xiàn)代臨床上常用于治療外科急性感染，如急性乳腺炎、蜂窩組織炎等。

中藥材質(zhì)量會(huì)直接影響中藥復(fù)方制劑質(zhì)量，從而影響其臨床療效，但單一成分的定量測(cè)定無(wú)法全面反映中藥材、中藥復(fù)方質(zhì)量。目前，中藥指紋圖譜正成為新興的質(zhì)量控制手段，它是一種綜合的、可量化的鑒定手段［9］，能全面評(píng)價(jià)中藥材、中藥復(fù)方成分信息，對(duì)其篩選或控制具有一定的實(shí)用價(jià)值。因此，本實(shí)驗(yàn)建立五味消毒飲HPLC 指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩帷?，5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷的含量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）；AG285、AX26DR 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300VDB 型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；KDC-140R 型超速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；Direct-Q3UV 型超純水儀（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試劑與藥物 綠原酸（批號(hào)110753-201415，純度96.2%）、秦皮乙素（批號(hào)110741-201708，純度99.9%）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703，純度99.7%）、木犀草苷（批號(hào)111720-201609）、蒙花苷（批號(hào)111528-201710，純度96.6%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品研究檢定院；新綠原酸（批號(hào)4974，純度≥98.0%）、隱綠原酸（批號(hào)3208，純度≥98.0%）、異綠原酸B（批號(hào)3089，純度≥98.0%）、3，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)3089，純度≥98.0%）、4，5-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)3001，純度≥98.0%）對(duì)照品均購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。金銀花（批號(hào)190416，產(chǎn)地山東）、野菊花（批號(hào)190401，產(chǎn)地江蘇）均購(gòu)自蘇州市博源藥業(yè)有限公司；蒲公英（批號(hào)190721，產(chǎn)地江蘇）、紫花地?。ㄅ?hào)190501，產(chǎn)地江蘇）均購(gòu)自蘇州市天靈飲片公司；天葵子（批號(hào)190318，產(chǎn)地江蘇）購(gòu)自春暉堂藥業(yè)有限公司，上述藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院沈多榮副主任中藥師鑒定為正品。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 五味消毒飲制備 按處方比例稱取2 劑藥材量，加18 倍量水浸泡30 min 后煎煮2 次，每次30 min，濾液合并濃縮至500 mL，即得。同法制備10 批樣品（S1～S10），批號(hào)分別為20191011、20191012、20191013、20191014、20191015、20191016、20191017、20191018、20191019、20191020。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷對(duì)照品適量，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解稀釋，即得（各成分質(zhì)量濃度分別為0.494 0、0.175 0、0.365 2、0.032 9、0.260 6、0.011 3、0.364 6、0.006 8、0.005 2、0.002 7 mg／mL）。

2.2.2 對(duì)照藥材溶液 按“2.1”項(xiàng)下工藝制備金銀花、紫花地丁、野菊花、蒲公英、天葵子溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液 精密量取“2.1”項(xiàng)下制劑3 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲（45 kHz）處理30 min，14 000 r／min 離心5 min，取上清液，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液 按“2.1”項(xiàng)下處方比例和制備工藝，分別制備缺金銀花、缺紫花地丁、缺野菊花、缺蒲公英、缺天葵子的陰性樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表 1；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，進(jìn)樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下樣品（S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，以11 號(hào)峰（綠原酸）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.032%～0.478%，相對(duì)峰面積RSD 為0.144%～2.607%，相似度均大于0.999，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下樣品（S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以11 號(hào)峰（綠原酸）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.030%～0.488%，相對(duì)峰面積RSD 為0.168%～2.534%，相似度均大于0.997，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下樣品（S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、8、12、24 h 在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以11 號(hào)峰（綠原酸）為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 為0.040%～1.165%，相對(duì)峰面積RSD 為0.150%～2.260%，相似度均大于0.995，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 圖譜生成 按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液（S1～S10），在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入2012 年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》，以S1 為參照，設(shè)定時(shí)間窗寬度為0.1 min，經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行全譜峰匹配，結(jié)果見(jiàn)圖1～2。由此可知，10 批樣品中有34個(gè)共有峰，其相似度分別為 0.973、0.993、0.998、0.999、0.985、0.995、0.997、0.996、0.999、0.994，均大于0.97，說(shuō)明樣品之間質(zhì)量差異較小。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for ten batches of samples

再選擇分離度好、峰面積高的11 號(hào)峰（綠原酸）作為參照，計(jì)算共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見(jiàn)表2～3。由此可知，各批樣品之間共有峰相對(duì)保留時(shí)間的差異較?。≧SD＜0.37%），但有些批次之間差異較大（RSD＞10%），這是因?yàn)榉迕娣e越小，誤差越大，RSD 也會(huì)隨之增加。

圖2 各成分對(duì)照?qǐng)D譜Fig.2 Reference chromatogram of various constituents

2.4.5 共有峰歸屬及鑒定 根據(jù)各藥材HPLC 色譜圖（圖3）及保留時(shí)間，可知共有峰來(lái)自金銀花的有1、5、7、11、12、14～16、18、25、28～29、31 號(hào)峰，來(lái)自蒲公英的有1、8、11、14、16、24～25、27～29、34 號(hào)峰，來(lái)自野菊花的有5、11～12、14、17、19、25～26、28～33 號(hào)峰，來(lái)自紫花地丁的有6、13、19、23～27、29、32、34 號(hào)峰，來(lái)自天葵子的只有16 號(hào)峰。其中，5、11～14、25、28～29、31～32 號(hào)峰通過(guò)查閱文獻(xiàn)［10-19］和比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，分別鑒定為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸和蒙花苷，并且13 號(hào)峰（秦皮乙素）、32 號(hào)峰（蒙花苷）分別是紫花地丁、野菊花特征峰。另外，2～4、9～10、20～22 號(hào)峰尚無(wú)藥材歸屬，可能它們?cè)诩逯筮^(guò)程中產(chǎn)生了新成分。

圖3 各藥材HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various medicinal materials

表2 共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab.2 Relative retention time of common peaks

2.5 各成分含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件 同“2.3”項(xiàng)。

2.5.2 線性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL 測(cè)定，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表4，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下樣品（S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷峰面積RSD 分別為1.19%、0.39%、0.36%、0.40%、0.90%、1.02%、1.23%、1.24%、1.31%、1.39%，表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下樣品（S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ辗迕娣eRSD 分別為2.22%、2.13%、2.06%、1.94%、2.25%、2.21%、2.57%、2.69%、3.10%、2.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

表3 共有峰相對(duì)峰面積Fig.3 Relative peak areas of common peaks

表4 各成分線性關(guān)系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下樣品（S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ辗迕娣eRSD 分別為2.08%、1.65%、1.58%、1.53%、1.73%、2.67%、2.68%、2.78%、3.07%、2.86%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)下樣品（S1），按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，各精密吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，加入對(duì)照品溶液，甲醇定容至刻度，在“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘幩?、4，5-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷平均加樣回收率分別為100.96%、100.37%、99.74%、97.12%、100.33%、97.05%、104.50%、97.43%、103.00%、95.16%，RSD 分別為1.09%、1.79%、1.45%、3.95%、1.94%、1.83%、4.79%、3.68%、2.91%、4.90%。

2.5.7 測(cè)定結(jié)果 取10 批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

3.1 煎煮條件確定 本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行煎煮前，先對(duì)方劑煎煮因素進(jìn)行了篩選，包括藥材加水量、方劑浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在相同的浸泡時(shí)間、煎煮時(shí)間下隨著加水量增加，指標(biāo)性成分含量越來(lái)越高，在加水量為18 倍時(shí)曲線出現(xiàn)拐點(diǎn)，從節(jié)能高效的原則出發(fā)，選擇18 倍量；《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》 規(guī)定，一般浸泡時(shí)間不得低于30 min，而且相關(guān)文獻(xiàn)也表明中草藥浸泡時(shí)間在20～30 min 即可，故選擇30 min；考察了煎煮時(shí)間10、20、30、40、50 min，發(fā)現(xiàn)大部分成分的折線圖在30 min 后出現(xiàn)拐點(diǎn)，而且隨著時(shí)間延長(zhǎng)其含量降低，故選擇30 min。最終確定，煎煮條件為藥材加18 倍量水浸泡30 min 后煎煮2 次，每次30 min。

3.2 流動(dòng)相確定 本實(shí)驗(yàn)考察了0.05% 磷酸-乙腈、0.1% 磷酸-乙腈、0.05% 磷酸-甲醇、0.1% 磷酸-甲醇，發(fā)現(xiàn)0.1%磷酸-乙腈洗脫時(shí)各成分色譜峰峰形較好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)確定 本實(shí)驗(yàn)比較了230、260、290、320 nm 波長(zhǎng)處各成分色譜信息，發(fā)現(xiàn)在320 nm處色譜峰分離度、峰形較好，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 指標(biāo)成分確定 對(duì)于指標(biāo)成分的選擇，應(yīng)從中藥君臣佐使配伍理論、復(fù)方臨床功效及成分有效性、可測(cè)性、特殊性的角度出發(fā)［20］。五味消毒飲中金銀花是君藥，故應(yīng)首要考慮該藥材；全方功效清熱解毒、消癰散結(jié)，故還應(yīng)針對(duì)其有效性進(jìn)行選擇；特殊性是指能代表某一類藥或某一個(gè)藥的化學(xué)成分［21］，如紫花地丁中秦皮乙素、野菊花中蒙花苷；可測(cè)性是指可進(jìn)行定性鑒別、定量分析的指標(biāo)成分［22］。金銀花、野菊花、蒲公英均含有酚酸、黃酮類成分，其中金銀花總酚、總環(huán)烯醚萜均具有明顯的抗炎作用，以前者最強(qiáng)［15］；以咖啡?；鼘幩峤Y(jié)構(gòu)單元為主的新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、3，5-二咖啡酰奎寧酸、4，5-二咖啡酰奎寧酸也具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒等作用［22］；木犀草苷在上述3 種藥材中均存在，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等作用［23］；蒲公英中的酚類成分在抗炎方面也發(fā)揮著重要作用［14］；蒙花苷［6］是野菊花中特有的黃酮類成分，秦皮乙素［8］是紫花地丁主要活性成分，均有抗炎作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇上述10 種成分作為指標(biāo)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立五味消毒飲HPLC 指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、秦皮乙素、咖啡酸、木犀草苷、異綠原酸B、3，5-二咖啡?？鼘帯?，5-二咖啡?？鼘?、蒙花苷的含量，該方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。另外，五味消毒飲中黃酮、酚酸、萜類成分等有效物質(zhì)很多，今后將進(jìn)一步結(jié)合紫外、紅外、質(zhì)譜對(duì)其進(jìn)行分析。