趙梓岐 倪坤明 付偉偉 丁士剛

北京大學(xué)第三醫(yī)院消化科(100183)

胃癌是全球范圍內(nèi)多發(fā)的惡性腫瘤，早期癥狀隱匿不易發(fā)現(xiàn)、晚期預(yù)后相對較差，是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。流行病學(xué)研究[1]顯示，2019年我國胃癌發(fā)病率為43.1/10萬，居全國惡性腫瘤發(fā)病率第2位，死亡率達(dá)29.6/10萬，防治形勢較為嚴(yán)峻。胃癌是一種多因素導(dǎo)致的疾病，目前已知主要危險因素包括環(huán)境危險因素和個人危險因素，前者包括膳食因素、吸煙、幽門螺桿菌感染、職業(yè)暴露、胃部手術(shù)等，后者包括家族易感性、基因多態(tài)性以及胃潰瘍、惡性貧血等疾病。胃癌的一般發(fā)病機(jī)制涉及由慢性胃炎發(fā)展至慢性萎縮性胃炎，進(jìn)而進(jìn)展為假幽門腺化生、腸化生、異型增生等癌前病變的一系列過程。胃癌發(fā)生的相關(guān)分子學(xué)機(jī)制仍未完全明確，是多年來的研究熱點(diǎn)之一。諸多研究證實(shí)，外泌體在包括胃癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色。本文就外泌體及其內(nèi)容物對胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用作一綜述。

一、外泌體的生物學(xué)特性

外泌體是直徑為30～150 nm的細(xì)胞外囊泡，幾乎所有類型的細(xì)胞均可產(chǎn)生，其由包含跨膜蛋白并包裹胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)或核酸的脂質(zhì)雙層組成。最初，外泌體被認(rèn)為是丟棄細(xì)胞中廢物的場所。現(xiàn)有研究[2]則表明，在生理和病理條件下，外泌體可通過轉(zhuǎn)運(yùn)特定的外泌體內(nèi)容物，如蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、非編碼RNA等，來調(diào)節(jié)局部和遠(yuǎn)處的細(xì)胞通訊。近年諸多研究[3-4]顯示，外泌體是腫瘤發(fā)生、生長、血管形成以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要介質(zhì)，與人類的正常生理穩(wěn)態(tài)和包括癌癥在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)。

外泌體的生物發(fā)生始于質(zhì)膜的內(nèi)向出芽，形成含有膜蛋白的早期內(nèi)含體。隨著內(nèi)含體內(nèi)陷和特定蛋白質(zhì)、核酸的封閉，形成多囊體。此后上述兩種微泡與質(zhì)膜發(fā)生融合，并向胞外釋放外泌體。多囊體形成的調(diào)節(jié)在內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport, ESCRT)的驅(qū)動下完成，ESCRT包括約30種蛋白質(zhì)，在真核生物中具有保守性。此外，與外泌體形成有關(guān)的機(jī)制亦有神經(jīng)酰胺途徑、4次跨膜蛋白途徑等。概括而言，外泌體是一類細(xì)胞外信號體，在正常生理環(huán)境中可促進(jìn)真核細(xì)胞間的廣泛生物通訊；而在惡性腫瘤中，此種調(diào)節(jié)機(jī)制可影響癌細(xì)胞的存活和生長[5]。

二、 外泌體影響胃癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制

腫瘤的發(fā)生與腫瘤微環(huán)境有密切聯(lián)系，而外泌體可通過多種途徑作用于腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞及其周圍正常細(xì)胞、基質(zhì)等的總稱，主要包括腫瘤細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(cancer-associated fibro-blasts, CAFs)、脂肪細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)等[6]。胃癌細(xì)胞自身及其所處的腫瘤微環(huán)境內(nèi)的多種細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體，經(jīng)多種機(jī)制促進(jìn)或抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

1. 調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長增殖：CAFs是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可通過分泌成纖維細(xì)胞活化蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)等為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造適宜的增殖環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成。CAFs的來源主要包括組織內(nèi)原有成纖維細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞分化以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)。胃癌細(xì)胞源性外泌體可誘導(dǎo)胃黏膜毛細(xì)血管周細(xì)胞的增殖、遷移，并增加周細(xì)胞的CAFs相關(guān)標(biāo)記物表達(dá)，進(jìn)而通過介導(dǎo)運(yùn)輸骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2激活PI3K/Akt、MEK/ERK通路，促進(jìn)周細(xì)胞向CAFs轉(zhuǎn)化[7]。此外，胃癌來源的外泌體亦可通過TGF-β/Smad通路誘導(dǎo)人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSCs)向CAFs分化[8]。

此外，外泌體調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長的機(jī)制亦包括：胃癌細(xì)胞源性外泌體和內(nèi)含微RNA(miRNA)可通過CD97上調(diào)ERK、JNK、p38等MAPK通路關(guān)鍵成員的磷酸化水平、激活下游蛋白表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其侵襲力[9]；胃黏膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體可功能性轉(zhuǎn)運(yùn)高毒力幽門螺桿菌菌株的毒力因子CagA蛋白,促進(jìn)其進(jìn)入其他胃黏膜細(xì)胞，此可能與早期胃癌的發(fā)生有關(guān)[10]。

2. 調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)免疫功能：體內(nèi)巨噬細(xì)胞分為M1、M2表型，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、脂多糖(LPS)、干擾素-γ(IFN-γ)等可使單核細(xì)胞分化為M1表型，發(fā)揮吞噬殺傷微生物、分泌炎性因子、刺激特異性免疫、抑制腫瘤生長等功能；而巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、IL-10等則可使單核細(xì)胞分化為M2表型，具有促進(jìn)基質(zhì)重編程、組織修復(fù)、血管生成、增強(qiáng)腫瘤生長的作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在腫瘤微環(huán)境中主要呈現(xiàn)M2表型，可分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TGF-β、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、IL-10以及多種趨化因子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制相關(guān)免疫功能、促進(jìn)血管生成等[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，胃癌源性外泌體可促進(jìn)PD1+TAMs的產(chǎn)生以及TAMs向M2表型轉(zhuǎn)化，繼而增加IL-10分泌、抑制CD8+T細(xì)胞功能，有利于腫瘤細(xì)胞增殖。此外，體內(nèi)胃癌源性外泌體可通過激活NF-κB通路來促進(jìn)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[13]。

髓系來源的抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是一類未成熟的髓系細(xì)胞，可抑制T細(xì)胞活性。胃癌外泌體通過減少CD8+T細(xì)胞與自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)數(shù)量、增加CD4+T細(xì)胞數(shù)量、募集MDSCs來產(chǎn)生免疫抑制微環(huán)境。CD8+T細(xì)胞是針對腫瘤的關(guān)鍵免疫細(xì)胞。有研究[14]顯示，腫瘤來源的外泌體改變基因表達(dá)和細(xì)胞因子分泌模式可能與腫瘤源性外泌體內(nèi)容物富集有關(guān)。此外，胃癌細(xì)胞源性外泌體可激活Hsp72/TLR2通路、進(jìn)而誘導(dǎo)MDSCs以增加IL-6的分泌，通過自分泌途徑進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫抑制作用。

此外，有研究[15]發(fā)現(xiàn)，含人高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的胃癌細(xì)胞源性外泌體作用于Toll樣受體4(TLR4)，可激活NF-κB通路，使體內(nèi)中性粒細(xì)胞自噬作用增強(qiáng)，同時促進(jìn)其極化為N2表型以發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及抑制腫瘤免疫的功能。經(jīng)胃癌細(xì)胞源性外泌體刺激后，MDSCs一方面可上調(diào)CD69、CD25等與T細(xì)胞激活有關(guān)的表面標(biāo)記物表達(dá)，另一方面可抑制單個核細(xì)胞增殖，從而激活人髓系白血病單核細(xì)胞(THP1細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞，增加多種前炎性因子表達(dá)[16]。

3. 調(diào)節(jié)腫瘤血管生成：一方面，腫瘤源性外泌體可轉(zhuǎn)運(yùn)多種血管生長相關(guān)因子以調(diào)節(jié)腫瘤血管生成，如VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)以及多種miRNA，亦可通過抑制低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)等表達(dá)，促進(jìn)血管生成[17]；另一方面，部分腫瘤源性外泌體內(nèi)含血管生成蛋白(ANG)，此為一種內(nèi)切核酸酶，可參與新生血管形成、腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及固有免疫調(diào)節(jié)等過程，同時對VEGF、表皮細(xì)胞生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等多種血管生成因子發(fā)揮的效應(yīng)具有允許作用[18]。

三、外泌體內(nèi)容物對胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用

1. 外泌體內(nèi)蛋白：腫瘤源性外泌體內(nèi)含多種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化以及維持其正常生理功能的蛋白，包括多種癌基因表達(dá)產(chǎn)物、酶、生物因子、熱休克蛋白以及轉(zhuǎn)錄因子等，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起有重要作用。

①三次跨膜結(jié)構(gòu)域(tripartite motif, TRIM): TRIM家族屬于一類泛素連接酶，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等方面均發(fā)揮重要作用，其成員TRIM3具有抑癌功能。研究[19]發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清外泌體中TRIM3表達(dá)水平較健康人群有所下降，而TRIM3過表達(dá)可通過調(diào)控干細(xì)胞增殖分化、EMT等途徑抑制胃癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

②人胃動蛋白1(gastrokine 1, GKN1): GKN1是由胃黏液分泌細(xì)胞產(chǎn)生的一種胃特異性蛋白，可隨黏液分泌至胃黏膜表面，在維持胃黏膜完整性和穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖分化方面發(fā)揮重要作用，屬抑癌因子。研究[20]表明，GKN1通過外泌體形式被胃黏膜分泌和內(nèi)吞，可抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

③其他：在胃癌發(fā)生過程中，腫瘤附近浸潤的M2巨噬細(xì)胞可高水平表達(dá)載脂蛋白E(ApoE)，并由外泌體將其轉(zhuǎn)運(yùn)至鄰近癌細(xì)胞，從而激活PI3K/Akt信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[21]。在幽門螺桿菌感染后的胃癌細(xì)胞所釋放的外泌體中，磷酸化形式的間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(MET)表達(dá)水平明顯升高，可通過刺激IL-1β分泌等方式促進(jìn)TAMs表型轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤生長和進(jìn)展[22]。對p53敲除的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究[23]發(fā)現(xiàn)，其產(chǎn)生的外泌體可轉(zhuǎn)運(yùn)泛素蛋白連接酶E3成分N識別蛋白2(UBR2)至胃癌細(xì)胞和p53未敲除的干細(xì)胞，導(dǎo)致Wnt/β-catenin通路異常激活，發(fā)揮促進(jìn)胃癌進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的干細(xì)胞性等作用。

2. 外泌體內(nèi)RNA

①M(fèi)iRNA：近年在外泌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種miRNA，可被鄰近或遠(yuǎn)處細(xì)胞吸收，起調(diào)節(jié)作用[24]。同時外泌體內(nèi)miRNA亦具有相關(guān)的主動分揀機(jī)制，即miRNA的3’末端等特異序列可指導(dǎo)其整合入外泌體，而中性鞘磷脂酶-2(nSMase-2)、蘇素化的核不均一核糖核蛋白(hnRNP)等分子亦可控制miRNA分揀[25]。外泌體miRNA在疾病進(jìn)展中起重要作用，并能刺激血管生成、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[26]。除包裝入外泌體或微泡外，miRNA亦可包裝入高密度脂蛋白中，或與囊泡外AGO2蛋白結(jié)合，以上三者均可保護(hù)miRNA免受降解。這種通過循環(huán)囊泡傳遞信息的途徑是細(xì)胞間通訊的第三種方式，與接觸性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和可溶性分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)同等重要[25]。

外泌體中miRNA的功能可分為兩類：一種是常規(guī)功能，即前述的負(fù)調(diào)節(jié)功能，可引起目標(biāo)基因表達(dá)水平特征性變化；另一種是取決于miRNA種類的特異性功能，對于某些miRNA，當(dāng)其作為外泌體內(nèi)成分而非細(xì)胞內(nèi)成分發(fā)揮作用時，此功能方能體現(xiàn)。外泌體中各種不同類型的miRNA在胃癌腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮不同功能，如miR-423-5p可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和遷移[27]、let-7 miRNA維持致瘤表型和轉(zhuǎn)移潛能[28]、miR-130a促進(jìn)血管生成和腫瘤生長[29]、miR-21抑制細(xì)胞凋亡[30]、miR-34過表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲以及運(yùn)動[31]等。

②長鏈非編碼RNA(lncRNA)：研究[32]發(fā)現(xiàn)，一種長度為26 bp的lncRNA X26nt含量在胃癌細(xì)胞源性外泌體中明顯升高，其可轉(zhuǎn)運(yùn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白水平，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、血管形成等，加速腫瘤生長和血管生成。此外，研究[33]發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清分離的外泌體內(nèi)lncRNA HOTTIP表達(dá)水平較健康人群升高，其具有作為胃癌生物標(biāo)記物的潛力。

③環(huán)狀RNA(circRNA)：近年研究[34]發(fā)現(xiàn)，在胃癌患者的癌組織和血清中，外泌體形式的circSHKBP1水平顯著上升，且與疾病不良預(yù)后相關(guān)。該分子屬于circRNA，在體內(nèi)外均可發(fā)揮促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及血管生成的作用，其主要機(jī)制是通過miR-582-3p/HUR/VEGF通路增強(qiáng)VEGF mRNA的穩(wěn)定性，同時直接與熱休克蛋白90結(jié)合、阻抑其正常泛素化，最終引起胃癌進(jìn)展加速。

總之，外泌體是參與胃癌發(fā)生、發(fā)展的多功能載體，內(nèi)含種類豐富的RNA，可維持細(xì)胞惡性表型，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、遷移、黏附，促進(jìn)EMT、血管生成，促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化等[35]。

四、外泌體在胃癌診療中的應(yīng)用潛力

1. 外泌體在生物標(biāo)記物方面的潛力：近期研究揭示了外泌體內(nèi)的多種內(nèi)含物在胃癌的早期診斷、預(yù)后分析以及療效評估方面可能具有重要的生物標(biāo)記物潛力。

①DNA和蛋白質(zhì)：研究[20]顯示，GKN1在胃癌患者血清外泌體中的水平顯著低于健康人群，且具有一定的鑒別胃癌患者與良性胃部疾病以及肝癌、結(jié)腸癌患者的能力，有望成為胃癌的特異性診斷標(biāo)記物。另有研究[36]對胃液提取的外泌體內(nèi)的DNA進(jìn)行BARHL2甲基化分析，證實(shí)其可作為早期探測胃癌的臨床標(biāo)記物。

②MiRNA：有研究[37]發(fā)現(xiàn)miR-92b-3p、let-7g-5p、miR-146b-5p、miR-9-5p這4種血清外泌體miRNA組合的表達(dá)水平升高與早期胃癌的進(jìn)展密切相關(guān)，可能成為新的早期胃癌的生物標(biāo)記物。另有4種血清外泌體的組合為miR-10b-5p、miR-195-5p、miR-20a-3p、miR-296-5p，其在胃癌診斷和預(yù)后方面的標(biāo)記物意義已得到研究證實(shí)，在其水平上調(diào)后進(jìn)行的輔助化療可能會降低患者的總生存率[38]。研究[27]發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清外泌體內(nèi)miR-423-5p含量顯著升高，并與腫瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)，可能成為胃癌的預(yù)后指標(biāo)。

③LncRNA：近期研究[39-40]發(fā)現(xiàn)，lncRNA PCSK2-2∶1和lncRNA SLC2A12-10∶1在胃癌患者血清外泌體中的表達(dá)水平與健康人群有顯著差異，前者與腫瘤體積、分期、靜脈侵襲情況相關(guān)，可作為預(yù)測轉(zhuǎn)移和預(yù)后的指標(biāo)，而后者較傳統(tǒng)診斷指標(biāo)具有較高的敏感性，可作為新型的胃癌診斷指標(biāo)。

2. 外泌體在靶向治療方面的潛力：關(guān)于外泌體及其內(nèi)容物在胃癌治療中的潛力，目前研究主要集中在外泌體與胃癌細(xì)胞耐藥性方面。順鉑是胃癌化療的常用藥物之一，胃癌患者對該藥的初始反應(yīng)良好，但大多數(shù)患者會隨用藥時間的延長而進(jìn)展為對順鉑耐藥，其機(jī)制包括藥物吸收減少和外排增加、腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性藥物成分減少、分子靶點(diǎn)改變、DNA損傷修復(fù)加強(qiáng)、前凋亡因子下調(diào)以及抗凋亡基因上調(diào)等。目前認(rèn)為外泌體與此過程密切相關(guān)。由外周血單核細(xì)胞分化來的M2巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生含有miR-21的外泌體，通過PTEN和PI3K/Akt等通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生對順鉑的耐藥性[41]。而針對HEK293T細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)表明，外泌體可用作抗miR-214的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，可能具有逆轉(zhuǎn)胃癌對順鉑耐藥性的作用[42]。此外，外泌體內(nèi)含的c-Met siRNA可顯著抑制胃癌細(xì)胞的侵襲性，并在體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出部分逆轉(zhuǎn)胃癌對順鉑耐藥性的作用，有望成為胃癌的潛在治療靶點(diǎn)之一[43]。

五、總結(jié)

綜上所述，外泌體是細(xì)胞間物質(zhì)交換與信息傳遞的重要渠道。通過內(nèi)含的蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)，外泌體可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長增殖、腫瘤相關(guān)免疫功能以及腫瘤血管生成，促進(jìn)或抑制胃癌的發(fā)生、發(fā)展。利用多種方式針對外泌體形式的特定蛋白或核酸進(jìn)行監(jiān)測，可作為胃癌病變評估、療效監(jiān)測等的參考指標(biāo)，展現(xiàn)出作為腫瘤早期標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)的潛力。