胡冠華，王德寶，趙麗華，蘇 琳，田建軍，靳 燁

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018）

發(fā)酵香腸是將絞碎的瘦肉與丁狀脂肪按一定比例與輔料均勻混合后灌入腸衣，在自然或微生物發(fā)酵作用下生產(chǎn)的具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地及較長保質(zhì)期的一類肉制品[1]。發(fā)酵香腸成熟過程中，會(huì)發(fā)生一系列的理化、生化及微生物反應(yīng)，這類反應(yīng)主要是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的分解氧化，它們既可提供豐富的營養(yǎng)因子，又可通過Strecker 反應(yīng)及美拉德等反應(yīng)生成決定香腸品質(zhì)的重要風(fēng)味物質(zhì)[2]。發(fā)酵香腸中大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)在成熟階段產(chǎn)生。Meyniera A 等[3]研究表明香腸干燥成熟是游離脂肪酸釋放的關(guān)鍵時(shí)期，飽和脂肪酸含量降低，不飽和脂肪酸含量增加，且游離脂肪酸進(jìn)一步被氧化分解為醇、醛、酮等，形成香腸特有風(fēng)味，如3-甲基丁醛、二烯醛、葵酸乙酯等。韋友兵等[4]通過研究薩拉米香腸發(fā)酵成熟過程中蛋白質(zhì)水解及脂質(zhì)氧化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)香腸成熟過程是蛋白質(zhì)水解和游離氨基酸總量累積的主要階段。Casquete 等[5]、Salazar 等[6]和朱迎春等[7]研究發(fā)現(xiàn)香腸成熟階段對發(fā)酵肉制品的色澤、pH 值、aw及微生物數(shù)量等均有影響。目前成熟周期對發(fā)酵香腸的品質(zhì)和風(fēng)味研究報(bào)道較少。

本文以羊肉為原料，添加木糖葡萄球菌、清酒乳桿菌作為發(fā)酵劑，制作羊肉發(fā)酵香腸，探究不同成熟時(shí)間對羊肉發(fā)酵香腸食用品質(zhì)及風(fēng)味累積的影響，以期為香腸規(guī)?；a(chǎn)加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料肉：羊肉（肥瘦比為1∶4），源自內(nèi)蒙古巴彥淖爾烏拉特中旗蘇尼特羊后腿及羊尾。腸衣：20～25mm 膠原蛋白腸衣。

發(fā)酵劑：清酒乳桿菌（Lactobacillus sake）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus），由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：蔗糖、葡萄糖、抗壞血酸鈉（分析純），上海國藥集團(tuán)有限公司；37 種游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品、甲醇、正己烷及丙酮（色譜級(jí)），美國Sigma公司。

儀器與設(shè)備：高效液相色譜儀（1260），美國安捷倫公司；島津氣相色譜儀（GC2014），日本島津公司；全自動(dòng)測色色差計(jì)（TCP2），北京奧依克光電儀器；智能水分活度測量儀（HD-3A），上海精密儀器儀表公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（LRH-250-HS），天津市福元銘儀器設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵香腸制作 參照ZHAO 等[8]方法，試驗(yàn)配方：羊后腿肉80%、羊尾肥膘20%、蔗糖0.5%、食鹽2.5%、亞硝酸鈉70 mg/kg、葡萄糖0.5%、硝酸鈉100 mg/kg、抗壞血酸鈉0.05%、發(fā)酵劑107CFU/g。

表1 發(fā)酵香腸加工工藝條件Table 1 Fermented sausage processing conditions

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在原有發(fā)酵羊肉香腸研究基礎(chǔ)上，對直徑20～25 cm 的膠原蛋白腸衣灌裝的羊肉香腸的最佳成熟周期進(jìn)行確定。本試驗(yàn)將成熟期分為5 d，分別對不同成熟時(shí)間（0，3，4，5，6 d）的羊肉香腸食用品質(zhì)及風(fēng)味感官進(jìn)行比較，以確定該直徑下羊肉香腸的最佳成熟周期。

1.2.3 理化品質(zhì)測定 參照GB 5009.237-2016《食品pH 值的測定》[9]、GB 4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[10]及GB4789.38-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》測定香腸pH值、乳酸菌及大腸菌數(shù)[11]。MSA 瓊脂培養(yǎng)基，根據(jù)平板菌落計(jì)數(shù)的方法測定葡萄球菌數(shù)；使用HD-3A 型智能水分活度儀及TCP2 型色差計(jì)測定香腸aw、色澤亮度（L）和紅度（a*）。

失重率測定：將灌裝后香腸質(zhì)量記為m，其它成熟階段香腸質(zhì)量記為m1，不同成熟階段的失重率記為W（%），則W（%）=（m-m1）×100/m，重復(fù)測定3 次，取平均值。

1.2.4 游離脂肪酸的測定 脂肪酸提?。簠⒄誇olch 等[12]的方法提取香腸中脂肪，稱取5 g 肉樣勻漿，加入5 mL 0.5 mol/L NaOH-CH3OH 溶液，70 ℃回流5min，加入BF3-CH3OH（1∶3，V/V）溶液5 mL，70℃回流2 min，最后加入3 mL C6H14溶液萃?。?0 ℃，1 min），加入5 mL 飽和NaCl 溶液，靜置10 min，分層后吸1 mL 上層液體于進(jìn)樣瓶中做氣相色譜分析。

氣相色譜條件：升溫程序：初溫120 ℃，保持5 min，以4 ℃/min 速率升至250 ℃，持續(xù)28 min。進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度280 ℃。載氣為高純氮?dú)猓?9.99%）。氫氣流速40 mL/min，恒定柱流速1.1 mL/min，分流比20∶1。進(jìn)樣量1.0 μL。

1.2.5 風(fēng)味的測定 參照羅玉龍等[13]方法并略作修改。將4 g 切碎的香腸樣加入20 mL 樣品瓶中，將萃取頭插入樣品瓶，在60 ℃下吸附40 min 后拔出，在GC 進(jìn)樣口（250 ℃）解吸附3 min。

揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜）測定條件：GC 條件：TR-5 型毛細(xì)色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為He，載氣流速1.0 mL/min，傳輸線溫度250 ℃，進(jìn)樣時(shí)間1 min；升溫程序：40 ℃保持3 min，以4 ℃/min 升溫到150 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min 升溫到200 ℃，最后以20℃/min 升至230 ℃，保持5 min。MS 條件：離子源溫度250 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍30～400（質(zhì)荷比）。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)與MEANLIB、NISTDEMO 和Wiley Library 檢索定性，將匹配度大于800 作為鑒定依據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 和SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 成熟時(shí)間對羊肉發(fā)酵香腸理化品質(zhì)的影響

由表2 可知，隨著發(fā)酵成熟時(shí)間的延長，香腸pH 值呈現(xiàn)下降，其中前4 d pH 值由5.70 快速降至4.81，下降率16.93%，主要是由于微生物分解碳水化合物生成乳酸等有機(jī)酸所致[14]。成熟第4～5 天香腸pH 值趨于穩(wěn)定，成熟第6 天pH 值雖稍有下降，但與成熟第4～5 天相比差異不顯著（P＞0.05）。香腸成熟結(jié)束時(shí)pH 值降至4.75，顯著低于（P＜0.05）發(fā)酵肉制品安全酸度5.3。有研究表明低酸度有利于抑制病原菌的生長，可促使亞硝酸鹽分解，減少殘留的NO2-與二級(jí)胺反應(yīng)生成N-亞硝胺的可能，從而提高產(chǎn)品食用的安全性[15]。

水分活度是影響發(fā)酵肉制品貨架期和食用安全性能的重要因素[16]。表2 表明香腸aw呈現(xiàn)快速下降趨勢，失重率與aw變化趨勢恰相反，表明兩者變化呈顯著負(fù)相關(guān)，這可能是由于成熟前期香腸pH 值大幅降低，接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)，改變了肌球重鏈蛋白與水分結(jié)合能力所致[17]。香腸成熟0～3 d，aw下降速率最快，可能與成熟初期溫度和濕度大幅下調(diào)有關(guān)，香腸內(nèi)部濕度與外部環(huán)境形成較大濕度差，使香腸中水分大量向外擴(kuò)散和蒸發(fā)，這與王德寶等[18]研究結(jié)果一致。成熟結(jié)束時(shí)香腸的aw和失重率分別達(dá)到0.75，53.60%。Talon 等[19]研究表明aw低于0.90 時(shí)可有效抑制腐敗菌、致病菌生長繁殖。綜上，成熟時(shí)間的延長可顯著降低香腸的aw，低aw有助于提高香腸食用品質(zhì)和安全性能，延長產(chǎn)品貨架期。

表2 不同成熟時(shí)間對羊肉香腸理化品質(zhì)的影響Table 2 Effects of different ripening time on physico-chemical quality of fermented mutton sausages

發(fā)酵香腸的色澤直接影響消費(fèi)者對產(chǎn)品購買欲望。從表2 可看出，香腸亮度L 呈下降趨勢，成熟3～6 d 顯著低于成熟第0 天（P＜0.05），這可能是與成熟過程中香腸水分不斷蒸發(fā)，減弱香腸表面對光的反射作用所致，因而隨著水分活度下降香腸亮度值降低。此結(jié)果與Johansson 等[17]研究結(jié)果一致。成熟過程中香腸的紅度值顯著高于成熟初期（P＜0.05），這可能與低pH 值促使亞硝酸鹽與肌紅蛋白結(jié)合形成亞硝基肌紅蛋白有關(guān)，從而提高了香腸紅度色澤（a*）[19]。José 等[20]研究結(jié)果表明：不同成熟時(shí)間對發(fā)酵香腸紅度值有重要影響，且Essid 等[21]和Casquete 等[22]研究發(fā)現(xiàn)羊肉發(fā)酵香腸的色澤與成熟時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。

由表2 可知，發(fā)酵香腸成熟過程中乳酸菌和葡萄球菌均呈先上升后緩慢下降的變化趨勢，分析原因可能是隨著成熟時(shí)間的延長，aw、失重率不斷下降，水分含量不斷降低，抑制微生物菌株的生長繁殖，從而導(dǎo)致乳酸菌和葡萄球菌數(shù)量下降。成熟過程中腸桿菌不斷下降，其中0～3 d 下降速率最快，4～6 d 腸桿菌下降速率變緩，仍顯著高于（P＜0.05）成熟初期，說明成熟時(shí)間的延長有效控制大腸桿菌的生長，此研究結(jié)果與朱迎春等[7]的研究結(jié)果一致。在成熟結(jié)束時(shí)，大腸桿菌數(shù)為1.87 lg（CFU/g）＜3.01 lg（CFU/g），確保證了發(fā)酵香腸的微生物安全性。

2.2 成熟時(shí)間對發(fā)酵羊肉香腸脂肪酸組成的影響

游離脂肪酸是發(fā)酵香腸中風(fēng)味物質(zhì)或其重要的前體物，在成熟過程中一定量游離脂肪酸的釋放對發(fā)酵香腸特有風(fēng)味的形成起到非常重要的作用[23]。發(fā)酵香腸中添加的發(fā)酵劑與內(nèi)源脂酶可將香腸中脂質(zhì)分解為短鏈揮發(fā)性脂肪酸、醛、酯等物質(zhì)，賦予發(fā)酵肉制品獨(dú)特風(fēng)味[9]，還可促進(jìn)飽和脂肪降解，加速單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）的釋放[24]。

羊肉發(fā)酵香腸游離脂肪酸含量變化見表3。在成熟過程中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸含量均呈上升趨勢，說明脂肪酸的生成速度大于分解速度。飽和脂肪酸含量（SFA）＞單不飽和脂肪酸含量（MUFA）＞多不飽和脂肪酸含量（PUFA），與Essid 等[21]研究結(jié)果一致。在成熟初期，游離脂肪酸的含量非常低，僅495.86 mg/100 g，主要是飽和脂肪酸，占總量的53.95%。成熟結(jié)束時(shí)，游離脂肪酸含量達(dá)到1 312.82 mg/100 g，顯著高于成熟初期（P＜0.05）。對比各脂肪酸占總脂肪酸含量，發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸（SFA）從53.95%降到49.06%，單不飽和脂肪酸（MUFA）從24.53%升到33.56%，有較大的提高，表明單不飽和脂肪酸含量所占總脂肪酸的比例隨著成熟時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加趨勢。多不飽和脂肪酸的含量（PUFA）從21.51%降到17.38%，說明成熟過程中主要是多不飽和脂肪酸（PUFA）發(fā)生氧化降解，生成如烯醛、二烯醛及酮類等羰基類特色風(fēng)味物質(zhì)[25]。

表3 不同成熟時(shí)間對羊肉香腸游離脂肪酸組成的影響Table 3 Effects of different ripening time on the composition of free fatty acids in the fermented mutton sausages

觀察表3 中發(fā)酵香腸游離脂肪酸的種類，可以看出肉豆蔻酸、油酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸和亞麻酸6 種脂肪酸總和占總脂肪酸的85.80%，是羊肉發(fā)酵香腸中游離脂肪酸的主要成分。SFA 上升趨勢顯著，在成熟第3 天達(dá)到最高（892.49 mg/100 g），成熟干燥結(jié)束時(shí)增加了376.51 mg/100 g，其中棕櫚酸和肉豆蔻酸增加最多，分別增加了274.59 mg/100 g 和100.24 mg/100 g，是影響SFA的主要脂肪酸；MUFA 在成熟第3 天達(dá)到最高（700.07 mg/100 g），干燥成熟結(jié)束時(shí)增加了318.97 mg/100 g，其中油酸增加最多，為214.89 mg/100 g，可能是由于油酸主要位于甘油三酯的sn-1 和sn-3 位置有關(guān)，易被發(fā)酵劑及內(nèi)源脂肪酶水解而釋放[26]。PUFA 在成熟第4 天達(dá)到最高值（329.76 mg/100 g）后呈緩慢下降趨勢，成熟結(jié)束時(shí)增加了121.48 mg/100 g。綜上所述，成熟3～4 d 是香腸各脂肪酸積累的重要階段。

表4 不同成熟時(shí)間對羊肉香腸風(fēng)味物質(zhì)的影響（峰面積×107/g）Table 4 Effects of different ripening time on the flavor composition（expressed as AU×107/g）in fermented mutton sausages

（續(xù)表4）

2.3 成熟時(shí)間對發(fā)酵羊肉香腸風(fēng)味物質(zhì)的影響

風(fēng)味是發(fā)酵香腸重要屬性之一。不同成熟時(shí)間香腸揮發(fā)性物質(zhì)的變化情況見表4，共鑒定出6 類53 種揮發(fā)性風(fēng)味化合物，包括醛類17 種、酯類12 種、醇類10 種、酸類7 種、酮類5 種、烷類1 種。這些風(fēng)味物質(zhì)主要是由脂質(zhì)氧化分解、蛋白質(zhì)降解代謝以及碳水化合物的分解，如Strecker降解，美拉德反應(yīng)等途徑所形成[27]。

有較低閾值的醛類風(fēng)味物質(zhì)對肉制品具有重要貢獻(xiàn)作用[28]。由表4 可知，香腸中檢出醛類化合物種類及含量最多，從成熟初期7 種增到成熟結(jié)束時(shí)的16 種，相對含量從3.65%增至14.40%。香腸中含量最高的3 種醛是己醛、庚醛、壬醛，是香腸主要的揮發(fā)性風(fēng)味化合物。其中己醛具有青草味，在成熟3 d 時(shí)相對含量最高，達(dá)16.42%；庚醛、壬醛呈脂香氣味和花香，在成熟4 d 時(shí)相對含量最高分別達(dá)33.74%，23.89%，且隨著成熟時(shí)間的延長，三者含量呈遞減趨勢（P＜0.05）。香腸中主要芳香醛為苯甲醛，在成熟3 d 時(shí)含量達(dá)到最大值，且在成熟過程中檢出的具有水果香味的3-甲基丁醛，也在成熟3 d 時(shí)含量達(dá)到最大值。從總含量上看，醛類物質(zhì)呈先上升后下降趨勢，成熟3 d 時(shí)含量達(dá)到最高值，顯著高于其它時(shí)間的（P＜0.05）。綜上得出成熟3 d 是醛類風(fēng)味物質(zhì)積累的最佳時(shí)期。

醇類相比醛類，閾值較高，對香腸風(fēng)味影響較小，然而作為醛酮類化合物的前體物質(zhì)，對風(fēng)味形成具有加和作用[29]。對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的醇類主要是戊醇具有油脂氣味，辛醇帶有柑橘氣味，苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，1-辛烯-3-醇具有濃郁蘑菇香味[30]。在成熟4 d 醇類物質(zhì)種類最多12 種，相對含量最高達(dá)39.71%，顯著高于其它各成熟時(shí)間的（P＜0.05）。這說明成熟4 d 是醇類風(fēng)味物質(zhì)積累的最佳時(shí)期。

酯類物質(zhì)是發(fā)酵香腸風(fēng)味形成所必需的物質(zhì)，在成熟初期檢出5 種，成熟結(jié)束時(shí)檢出11 種，相對含量從13.56%增到25.28%，其中成熟4 d 的相對含量最高達(dá)32.28%，顯著高于其它各成熟時(shí)間的（P＜0.05）。這說明成熟時(shí)間的延長有助于酯類物質(zhì)的積累，且成熟第4 天酯類物質(zhì)積累最多。對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大的是具有果香味和奶油香味乙酯類物質(zhì)，例如己酸乙酯及辛酸乙酯，它們構(gòu)成了發(fā)酵香腸特有的酯香味[31]。

酮類化合物是脂肪氧化的另一產(chǎn)物，閾值低可賦予香腸干酪水果香味、花香味。成熟0 d 僅檢出2-甲基-3-庚酮，成熟結(jié)束時(shí)檢出4 種酮類。在成熟第3 天酮類物質(zhì)相對含量最高達(dá)33.78%，與其它各組差異顯著（P＜0.05），其中含量最高的是3-羥基-2-丁酮，賦予香腸清香奶香味[32]。這說明成熟第3 天是酮類物積累的關(guān)鍵時(shí)間。

酸類化合物主要來自脂肪水解氧化過程中產(chǎn)生的小分子脂肪酸，從成熟初期3 種增到成熟結(jié)束時(shí)的6 種，在成熟第3 天含量達(dá)到最高值。其中乙酸含量最高，賦予香腸酸醋味；異戊酸次之賦予香腸橘樣的香味[33]。烷烴類閾值較高，僅檢出十九烷1 種，對香腸整體風(fēng)味影響較小。

延長成熟時(shí)間，可使碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪充分降解氧化，累積更多的重要風(fēng)味物質(zhì)，而過度氧化分解，會(huì)產(chǎn)生不良滋味與氣味。選擇合適的成熟時(shí)間對香腸風(fēng)味和口感起決定性作用。綜合考慮，成熟3～4 d 為發(fā)酵香腸風(fēng)味積累的最佳時(shí)間。

3 結(jié)論

研究了不同成熟時(shí)間對羊肉發(fā)酵香腸食用品質(zhì)及風(fēng)味的影響，結(jié)果表明：隨著成熟時(shí)間的延長發(fā)酵香腸的pH 值不斷降低，成熟0～4 d 內(nèi)下降速率最快，成熟結(jié)束時(shí)pH 降到4.75＜5.3（處于安全食用范圍）。aw急劇下降，成熟結(jié)束時(shí)達(dá)到0.75＜0.9，能有效抑制雜菌的生長，提高產(chǎn)品的食用安全性。成熟3～4 d 香腸的紅度值達(dá)到最大值，改善了香腸色澤。香腸較低的pH 和aw使得大腸桿菌的生長受到抑制，在成熟過程中不斷下降，確保了香腸微生物的安全性。成熟過程中游離脂肪酸的含量顯著增加（P＜0.05），成熟3～4 d 時(shí)含量達(dá)到最高值；同時(shí)風(fēng)味物質(zhì)含量也顯著增加（P＜0.05），成熟3～4 d 風(fēng)味物質(zhì)種類及含量達(dá)到最高值，說明此時(shí)是發(fā)酵香腸最佳成熟時(shí)間。