韓子逸沈詩怡張金鑫周燕趙昕劉明江徐霄龍

(1. 揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇 揚州 225009; 2. 江蘇省動物重要疫病與人畜共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009; 3. 首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010)

角叉菜膠是一種從海藻中提取的含硫酸多糖,被廣泛用于制備動物的各種炎癥及血栓模型[1-2],其中角叉菜膠誘導的小鼠尾部血栓模型是目前科學研究中最為常用的血栓模型之一。該模型具有簡便快捷、成本低的優(yōu)點,模型條件通常為(20 ±1)℃室溫條件下,將0.20% ～0.80%劑量的角叉菜膠生理鹽水溶液注入小鼠腹腔,造模6 ～12 h 內小鼠尾尖將出現暗紅色血栓并逐漸向尾根擴大,24 h左右血栓區(qū)域趨于穩(wěn)定[3-4]。但筆者認為采用該方法建立的模型出栓速度過快且損傷嚴重,與正常情況下血栓形成栓塞致組織病變所需時間不符,不利于相關防治藥物的研究工作。因此,本試驗采用低劑 量(0.02%、 0.04%、 0.06%、 0.08%、 0.10%、0.20%)的角叉菜膠生理鹽水溶液(0.01 mL/g)連續(xù)腹腔注射(每天1 次)的方式探索小鼠慢性血栓模型的條件,為血栓相關研究工作提供更加適宜的動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

70只5周齡SPF 級ICR 小鼠雄性,體重(21 ±2)g,購自揚州大學實驗動物中心【SCXK(蘇)2017-0007】;飼養(yǎng)于揚州大學實驗動物中心【SYXK(蘇)2017-0044】;所有操作均符合實驗小鼠的飼養(yǎng)過程和其他實驗操作均符合實驗動物倫理學要求(審批號:YZUDWLL-202005-002)以及中華人民共和國《實驗動物管理條例》。飼養(yǎng)條件:(20 ± 1)℃,30%～40%濕度,自由采食飲水,12 h 循環(huán)燈光,適應性飼養(yǎng)7 d 后進行實驗。

1.1.2 主要試劑與儀器

角叉菜膠、生理鹽水溶液、檸檬酸鈉水溶液。凝血時間(thrombin time,TT)試劑盒、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)試劑盒、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)試劑盒、纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)試劑盒,均購自上海太陽生物技術有限公司;半自動血凝儀(PUN-2048A),購自北京普朗新技術有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒,均購自南京建成有限公司,上述指標均采用化學發(fā)光法并按照試劑盒說明書進行檢測。炎癥因子IL-1β、IL-10、TNF-α 試劑盒,購自abclonal 有限公司,炎癥因子指標均采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)并按照試劑盒說明書進行檢測,酶標儀(Epoch)購自美國博騰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備

配置濃度為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.20%的角叉菜膠生理鹽水溶液,現配現用。

1.2.2 動物分組及造模方法

將70 只ICR 雄性小鼠隨機分為7 組,每組10只,即:空白對照組、0.02%劑量組、0.04%劑量組、0.06%劑量組、0.08%劑量組、0.10%劑量組、0.20%劑量組。造模條件:空白組每天腹腔注射生理鹽水溶液0.01 mL/g,其余各組按照對應濃度分別腹腔注射角叉菜膠溶液0.01 mL/g;注射角叉菜膠后,每天眼觀各組小鼠尾尖處有無黑尾,當出現黑尾即判定該小鼠出栓,出栓小鼠不再注射角叉菜膠并立即處死采樣,未出栓小鼠繼續(xù)注射相應濃度的角叉菜膠溶液并觀察至第10 天;各組持續(xù)處理并觀察10 d;各組小鼠于(20 ± 1)℃下自由飲水、進食。

1.2.3 檢測指標

(1)出栓率、尾栓平均長度:每天記錄各組的出栓小鼠數量以及尾部血栓長度。

(2)血凝四項:小鼠處死前收集的血液置于含檸檬酸鈉的離心管中,離心(1500 r/min、4℃、10 min)取上層血漿,半自動血凝儀檢測血凝四項。

(3)炎癥因子指標:小鼠處死后采集結腸組織,按照炎癥因子試劑盒說明書測定結腸組織與血漿中IL-1β、IL-10 及TNF-α 的含量。

(4)氧化應激指標:小鼠處死后采集結腸組織,按照氧化應激試劑盒說明書測定結腸組織與血漿中谷胱甘肽過氧化物酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)的含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用 GraphPad Prism 6.0 多重比較分析(ordinary one-way ANOVA)并繪制小鼠血凝四項表格、氧化應激指標及ELISA 結果柱狀圖,P＜0.05 為差異具有顯著性,P＜0.01 為差異具有極顯著性。

2 結果

2.1 各組出栓率與尾栓平均長度

如表1 所示,0.02%劑量組小鼠試驗期間無尾部血栓形成;0.04%劑量組小鼠第4 天出栓2 只,第5、6 天各出栓1 只,出栓率40%;0.06%劑量組小鼠第5 天出栓2 只,第6 天出栓8 只,出栓率100%;0.08%劑量組第4 天出栓9 只,第5 天出栓1 只,出栓率100%;0.10%劑量組小鼠第2 天出栓10 只,出栓率100%;0.20%劑量組小鼠第1 天出栓10 只,出栓率100%。

表1 各組小鼠尾部血栓出栓結果(n=10)Table 1 Results of thrombus outlet in the tail of mice in each group(n=10)

如圖1 所示,自0.06%劑量組至0.20%劑量組,小鼠黑尾長度逐漸延長,黑尾顏色逐漸加深。

圖1 各組小鼠尾部血栓照片Figure 1 Photos of thrombus in the tail of mice in each group

2.2 各組血凝四項結果

如表2 所示,與空白對照組相比,0.02%劑量組小鼠血凝四項均無顯著差異;0.04%劑量組小鼠僅PT 顯著延長(P＜0.05);0.06%劑量組小鼠FIB 含量顯 著 升 高(P＜ 0.05),APTT 顯 著 縮 短(P＜0.05),TT 顯著延長(P＜0.05),PT 極顯著延長(P＜0.01);0.08%劑量組、0.10%劑量組與0.20%劑量組FIB 含量極顯著升高(P＜0.01),APTT 極顯著縮短(P＜0.01),TT、PT 均極顯著延長(P＜0.01)。

表2 各組血凝四項結果(n=5)Table 2 Results of hemagglutination in each group(n=5)

2.3 各組炎癥因子指標檢測結果

如圖2,與空白對照組比,0.06%劑量組與0.08%劑量組結腸組織中IL-1β 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-1β 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組TNF-α 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量TNF-α 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組IL-10 顯著降低(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-10 極顯著降低(P＜0.01)。

圖2 各組小鼠結腸組織與血漿中炎癥因子指標檢測結果Note. A. Detection results of inflammatory factors in colon tissues of mice in each group. B. Detection results of inflammatory factors in plasma of mice in each group.Figure 2 Detection results of inflammatory factors in colon tissues and plasma of mice in each group

與空白對照組相比,0.06%劑量組與0.08%劑量組血漿中IL-β 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-β 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組TNF-α 顯著升高(P＜0.05)、0.20%劑量TNF-α 極顯著升高(P＜0.01)、0.06%劑量組與0.08%劑量組IL-10 顯著降低(P＜0.05)、0.20%劑量組IL-10 極顯著降低(P＜0.01)。

2.4 各組氧化應激指標檢測結果

如圖3,與空白對照組相比,0.06%劑量組與0.08%劑量組結腸組織中SOD 顯著降低(P＜0.05),0.20%劑量組SOD 極顯著降低(P＜0.01),0.06%劑量組、0.08%劑量組與0.2%劑量組GSH-Px 均極顯著降低(P＜0.01),0.06%劑量組、0.08%劑量組與0.20%劑量組MDA 均顯著升高(P＜0.05)。

圖3 各組小鼠結腸組織與血漿中氧化應激指標檢測結果Note. A. Detection results of oxidative stress in colon tissues of mice in each group. B. Detection results of oxidative stress in plasma of mice in each group.Figure 3 Detection results of oxidative stress in colon tissues and plasma of mice in each group

與空白對照組相比,0.06%劑量組、0.08%劑量組與0.20%劑量組血漿中SOD 均顯著降低(P＜0.05)、GSH-Px 均極顯著降低(P＜0.01)、MDA 均顯著升高(P＜0.05)。

3 討論

采用角叉菜膠制備的大/小鼠血栓模型不需要進行手術等復雜操作且對動物造成創(chuàng)傷小,尾部血栓程度易于觀察和測量[5]。角叉菜膠可誘導機體組織急性炎癥反應,炎癥因子釋放入血后,可損傷血管內皮細胞并導致血栓形成;因小鼠尾部為單股動脈循環(huán),一旦栓塞很難形成側支循環(huán)導致尾部組織逐漸缺血壞死[6]。目前普遍采用0.20% ～0.80%劑量的角叉菜膠制備的小鼠尾部血栓模型,該模型出栓時間過短(6 ～12 h)、尾部病變嚴重,多種防治藥物難以短時間內發(fā)揮療效,不利于相關防治藥物的研究工作。故本試驗采用低劑量的角叉菜膠連續(xù)腹腔注射的方式建立慢性血栓小鼠模型,以期延長尾部血栓形成時間、減輕血栓的嚴重程度。0.06%、0.08%、0.10%、0.20%劑量組小鼠出栓率均為100%,但各組小鼠集中出栓的時間分別為第6 天(80%)、第4 天(90%)、第2 天(100%)、第1天(100%),因此,0.06%、0.08%角叉菜膠連續(xù)腹腔注射均可建立小鼠慢性血栓模型,除尾部血栓外,其他部位(如耳部、四肢)未見明顯血栓。

血凝四項(PT、APTT、TT、FIB)檢測對診斷凝血系統(tǒng)異常的血液性疾病具有重要意義[7]。血栓形成過程中將消耗大量凝血因子導致PT 延長,而凝血因子的缺失則會引起APTT 的縮短;同時在凝血酶的作用下,FIB 不斷轉化為纖維蛋白(血栓主要成分)并使機體血液持續(xù)保持高凝狀態(tài),當血液中纖維蛋白含量過高時,機體纖溶增強,纖維蛋白降解產物增多,導致TT 延長[8-9]。0.06%以上各劑量組與空白對照組相比PT、TT、FIB 均顯著升高,APTT顯著降低,表明機體凝血與纖溶平衡被打破,凝血亢進,導致各組小鼠均出現尾部血栓且0.06%劑量組小鼠在第6 天集中出栓,0.02%與0.04%劑量組小鼠出栓率較低,而0.10%與0.20%劑量組小鼠雖然全部出現尾栓但出栓時間太短,為急性血栓模型,因此,選擇0.06%角叉菜膠連續(xù)腹腔注射6 d 作為慢性血栓小鼠模型條件。

研究表明,腹腔注射角叉菜膠會引起大/小鼠腸道炎癥,大量炎癥介質的生成與尾部血栓的形成密切相關[10-11]。0.06%、0.08%、0.20%劑量組結腸組織、血液中IL-1β、TNF-α 含量均顯著升高,IL-10含量均顯著降低。另外,血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)在血栓形成過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用,VECs 通常處于兩種狀態(tài):靜止狀態(tài)、激活狀態(tài);靜止狀態(tài)的VECs 具有抗血栓作用,當局部組織炎癥并釋放的大量炎性介質(IL-1β,TNF-α等)可激活VECs,使其抗黏附、抗凝功能將轉變?yōu)榇兖じ健⒋倬奂墓δ?從而破壞VECs 維持的血凝與纖溶之間的平衡狀態(tài),最終促進血栓形成[12]。炎癥與氧化應激常伴隨發(fā)生,炎癥、氧化應激可導致組織、 細胞內產生大量活性氧(reactive oxide species,ROS),ROS 蓄積將引起血管內皮細胞損傷;還可促進免疫細胞(單核細胞、T 淋巴細胞、肥大細胞等)的趨化、聚集并釋放大量炎性因子,加劇血管內壁的炎癥反應[12]。0.06%、0.08%、0.20%劑量組結腸組織、血液中抗氧化酶(SOD,GSH-Px)活性均顯著降低,氧化產物(MDA)含量均顯著升高。綜上所述,角叉菜膠連續(xù)腹腔注射可引起腸道組織的炎癥、氧化應激反應,炎癥介質進入血液循環(huán)系統(tǒng),激活VECs(或破壞結構),從而導致小鼠尾部血栓。因此,角叉菜膠誘導的機體炎癥、氧化應激反應是小鼠尾部血栓形成的重要原因。

0.06%的角叉菜膠溶液連續(xù)腹腔注射6 d 可以建立慢性血栓小鼠模型,該模型形成時間長、尾部病變輕(黑尾長度短、顏色淺),為防治血栓相關藥物或療法(針刺、艾灸等)的研究提供了更加合適的動物模型。另外,除黑尾率、黑尾長度外,結合結腸組織、血液中炎癥、氧化應激指標變化及血凝四項檢查,可更好的評價藥物或療法的作用。值得注意的是,溫度能夠影響造模成功率,低溫可引起血管收縮、血液流速減慢,導致黑尾時間提前,而高溫則不易形成黑尾[1,13];劉彥霞等[3]研究發(fā)現濕度也是影響該模型的重要因素,濕度越高,黑尾出現時間越早。由于小鼠品種、個體差異及飼養(yǎng)環(huán)境不同,建議開展相關研究前進行預實驗,確定最佳的藥物濃度及給藥時間。