張鐘毓，許 燕，2，張旭婧，海幾哲

（1.新疆大學機械工程學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.西安交通大學機械工程學院，陜西 西安 710049）

1 引言

骨結(jié)核病是醫(yī)學上的一大難題，傳統(tǒng)結(jié)核藥物標準化治療往往持續(xù)至少（8～20）個月，包括清創(chuàng)手術(shù)及修復(fù)骨缺損[1]。這種治療方法存在如下弊端:抗結(jié)核藥物在到達病灶區(qū)后難以長期維持有效殺菌濃度；長期全身服用或注射極易引發(fā)毒副作用損害其他器官；清創(chuàng)后造成大段骨缺損。

針對以上問題，利用負載抗結(jié)核藥物的骨組織工程支架治療骨結(jié)核病應(yīng)運而生。其不僅可針對病人個性化用藥，而且對全身毒副作用小。文獻[2]以PLGA 復(fù)合β-TCP，采用共混法載入抗結(jié)核藥物制備得到的復(fù)合支架可有效抑制結(jié)核菌的生長增殖，置入骨結(jié)核病灶中起到局部抑菌的效果。文獻[3]以聚乙烯醇為粘結(jié)劑，通過三維打印技術(shù)制備出了負載塞米松的支架，研究發(fā)現(xiàn)此種支架增強了生物活性和藥物輸送性能。文獻[4]利用3D 打印技術(shù)制備了PLLA 多層同心圓柱載藥人工骨，實現(xiàn)了藥物逐序釋放并交替出現(xiàn)濃度高峰。但因為所使用的材料單一，生物活性較差，不能較好地修復(fù)病灶區(qū)域的骨缺損。

因羥基磷灰石是人體和動物骨骼主要無機成分，對骨生長有誘導(dǎo)作用，可促進骨組織缺損的修復(fù)[5-6]。故用羥基磷灰石作為生物骨組織工程支架基體材料。聚乙烯醇作為一種極安全的高分子粘結(jié)劑，對人體無毒，生物相容性良好，其水凝膠具有與人體自然組織相近的含水量、較高的機械強度及多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等特點，在生物醫(yī)學中被廣泛應(yīng)用[7-8]。絲素蛋白作為一種天然纖維蛋白，是一種很理想的藥物載體，具有良好的生物相容性及柔韌性[9-11]?；诖?，以羥基磷灰石/聚乙烯醇為外殼支撐材料、羥基磷灰石/聚乙烯醇/絲素蛋白為內(nèi)芯藥物載體材料利用3d 打印技術(shù)制備出同軸梯度三維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)骨組織工程支架，并進行了體外模擬降解實驗，對藥物載體材料的生物力學性能進行測試和表征

2 實驗部分

2.1 實驗原料與設(shè)備

40nm 羥基磷灰石（南京埃普瑞納米科技有限公司）；聚乙烯醇（北京博奧拓達科技有限公司）；350nm 絲素蛋白（湖州新天絲生物技術(shù)有限公司）；無水氯化鈣（天津大茂化學試劑廠）；透析袋（北京索萊寶科技有限公司）；SU8010 Scanning Electron Microscope（日本）；伺服控制拉伸試驗機（WDW-20）；型號CX2000 電子天平（東莞長協(xié)電子）；電熱恒溫干燥箱（紹興市蘇珀儀器有限公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京歐尼斯科技發(fā)展有限公司）；三維交流伺服閉環(huán)數(shù)控平臺（GXYZ353535VP、中國深圳）；pH 測試筆酸度計（上海普禾電子有限公司）

2.2 聚乙烯醇/絲素蛋白復(fù)合水凝膠及聚乙烯醇水凝膠的制備

使用電子天平稱取12g 聚乙烯醇（PVA）晶體，向其倒入100ml蒸餾水，通過水浴加熱法制得聚乙烯醇凝膠。取5g 絲粉加入到50ml40%氯化鈣溶液中，水浴加熱直到無固體顆粒。使用去離子水透析SF/CaCl248h，得到SF 溶液后于4 攝氏度下冷藏。量取一定量SF 水溶液和PVA 水凝膠，按質(zhì)量比1：4 進行混合后得到聚乙烯醇/絲素蛋白復(fù)合凝膠[12]。

2.3 復(fù)合材料支架的制備

以40nm 的羥基磷灰石粉末（HA）為基體材料，按質(zhì)量比1：1.5 注入PVA/SF 復(fù)合凝膠，在瓷質(zhì)搗藥碗中混合、攪拌均勻后，將其取出裝到內(nèi)層針筒中，噴頭直徑尺寸0.6mm；按上述方法配制HA/PVA 高粘度復(fù)合材料，并裝到外層針筒中，噴頭直徑尺寸1.55mm。利用G 代碼操控三維工作平臺運動軌跡，結(jié)合活塞擠出式沉積成型技術(shù)，通過自制噴頭制得3 組十字網(wǎng)格結(jié)構(gòu)的同軸生物多孔骨組織工程支架[13]，尺寸為（15×15×10）mm。并按上述方法制備出同種規(guī)格的單軸HA/PVA、HA/PVA/SF 骨組織工程支架作為對照組。

圖1 同軸組織工程骨支架Fig.1 Tissue Engineering Bone Scaffold

2.4 體外模擬降解實驗

通過對支架進行編號，將各組支架依次放入錐形瓶中，向瓶內(nèi)倒入初始pH=7.4 的PBS 緩沖液，如表1 所示。將其移入恒溫培養(yǎng)箱中，調(diào)目標溫度至37℃，不換液，模擬支架在體液中的降解，隔2、4、6、8、10 周后觀察實驗現(xiàn)象，記錄、分析各項指標變化，對羥基磷灰石/聚乙烯醇/絲素蛋白同軸生物多孔骨支架降解趨勢進行實驗探究，得到藥物載體材料降解性能的實驗數(shù)據(jù)。

表1 PBS 緩沖液成分Tab.1 Composition of the PBS

3 結(jié)果與討論

3.1 pH 分析

HA/PVA 復(fù)合材料在（0～2）周內(nèi)，緩沖液pH 無變化，如圖2所示。降解4 周后，緩沖液PH 值為7.3，而后又趨于平緩。降解10周后pH 值達到7.1，僅下降了0.3 單位，整體變化不明顯，基本維持生理pH 值。隨著HA/PVA/SF 復(fù)合材料在PBS 緩沖液中浸漬時間的增加，緩沖液，pH 值最終下降到6.6，變化最顯著。浸潤同軸復(fù)合材料的緩沖液pH 始終介于兩者之間。隨降解時間延長pH 值下降均勻，至第十周pH 值為6.8，呈弱酸性。實驗過程中發(fā)現(xiàn)隨時間增長降解液的顏色由透明變?yōu)榈S色，并逐步加深，因絲素中含有羧基等極性基團，故推測絲素蛋白的不斷析出致使溶液pH 值有所下降。研究表明細胞活性和細胞增殖均隨pH 降低呈遞減趨勢，持續(xù)局部過酸條件會影響成骨細胞活性，抑制骨細胞增殖[14]。故降解過程中同軸復(fù)合材料骨組織工程支架較單軸HA/PVA/SF 材料酸堿度理想，無過酸過堿物質(zhì)析出，不影響細胞正常增殖。

圖2 浸潤兩組復(fù)合材料的降解液pH 隨降解時間變化曲線Fig.2 pH of Degradation Solution Infiltrating Two Composites vs Degradation Times

3.2 高倍SEM 分析

在新疆大學理化中心進行高倍掃描電鏡試驗。將各組骨組織工程支架磨成粉末狀，牙簽蘸取少量通過導(dǎo)電膠粘到銅臺上，進行噴金處理后，在5k 放大倍數(shù)下觀察各樣本微觀結(jié)構(gòu)。截取了三種骨組織工程支架在0、4、8、10 周的電鏡圖片，如圖3 所示。

圖3 高倍SEM 組織工程骨支架微納米顆粒形貌Fig.3 Morphology of Micro and Nano Particles in Tissue Engineered Bone Scaffolds of High Power SEM

HA/PVA 復(fù)合材料骨支架在降解（0～4）周內(nèi)微觀形貌發(fā)生顯著變化，降解前結(jié)構(gòu)致密，降解4 周后出現(xiàn)微孔結(jié)構(gòu)，這將為成骨細胞黏附、生長提供空間。10 周后羥基磷灰石復(fù)合材料呈棒狀，微孔結(jié)構(gòu)明顯增多，孔徑尺寸增大。HA/PVA/SF 復(fù)合材料骨支架在經(jīng)4 周降解后，呈多孔海綿結(jié)構(gòu)，材料表面出現(xiàn)更多細微孔隙。（4～10）周內(nèi)孔洞數(shù)量隨降解時間延長不斷增加，相對HA/PVA復(fù)合材料各孔隙分布更均勻，從而更有利于新骨的長入，并為后期體內(nèi)植入修復(fù)骨缺損提供基礎(chǔ)。同軸梯度骨組織工程支架在降解4 周后，邊緣區(qū)相對中心產(chǎn)生更多細微孔隙，外殼材料相對內(nèi)芯材料降解更明顯，說明內(nèi)芯中含有的絲素蛋白材料可延緩降解。而在降解8 周后，可看到外殼和內(nèi)芯搭載處出現(xiàn)多處微孔結(jié)構(gòu)，推測由于初期外殼材料表面微孔結(jié)構(gòu)增多降解加快，模擬體液從外殼材料逐步向內(nèi)層滲透，因而交接處出現(xiàn)更多細微孔隙，這也說明同軸骨組織工程支架微孔結(jié)構(gòu)具備一定連通性。在降解后期，內(nèi)芯HA/PVA/SF 材料多處出現(xiàn)孔隙，說明模擬體液已滲入到內(nèi)芯材料，這將為后期內(nèi)芯材料負載的藥物持續(xù)長久釋放提供可能。

3.3 降解率分析

對三組復(fù)合材料骨組織工程支架依次編號，利用電子天平對各支架做三次平行稱重實驗，分別計算平均值記為其初始質(zhì)量m初始。每2、4、6、8、10 周后，取出浸于降解液的兩組復(fù)合材料支架，用濾紙吸干表面多余水分，并置于鼓風箱中進行干燥至恒重，并按前面方法進行稱重、計算，所得數(shù)據(jù)記為降解后質(zhì)量m 實驗后。則計算不同復(fù)合材料生物組織工程支架降解率可用公式α=（m初始-m降解后）/m 初始×100%求得。

圖4 復(fù)合材料骨組織工程支架降解率曲線圖Fig.4 Mass Loss Rate of Different Composites vs Degradation Times

HA/PVA 復(fù)合材料生物骨組織工程支架降解2 周后，材料降解速率是10.05%，隨著降解時間延長，6 周后降解率達到26.2%。（6～8）周內(nèi)降解速率明顯增快，這可能是由于隨著降解時間的積累，材料表面孔隙累計增多從而加速了支架的降解。最終在降解10 周后，HA/PVA 復(fù)合材料骨組織工程支架降解率達到40.14%。

HA/PVA/SF 復(fù)合材料生物骨支架降解率隨降解時間延長呈緩慢均勻增加的趨勢。降解2 周后降解率為7.26%，10 周后降解率24.44%，同步對比HA/PVA 復(fù)合材料，復(fù)合絲素蛋白后降解率數(shù)值明顯減小，降解變得緩慢。而研究表明絲素蛋白分子鏈中存在許多氨基酸重復(fù)多肽片段，其結(jié)構(gòu)規(guī)整，通過氫鍵作用緊密地堆積形成了穩(wěn)定的反平行β-折疊構(gòu)象[15-16]。故推測絲素蛋白特有的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)是導(dǎo)致復(fù)合材料骨組織工程支架降解速率變緩的重要因素。

同軸梯度復(fù)合材料生物骨組織工程支架在（0～2）周內(nèi)降解率為9.52%，與HA/PVA 復(fù)合材料骨組織工程支架降解速率基本一致，說明此時降解主要發(fā)生在支架外殼表層。而后隨著表面孔洞增多，加快支架表面的降解過程。降解6 周后，速率變緩，推測此時緩沖液已滲透到外殼和內(nèi)芯搭載處，由于降解更易發(fā)生于規(guī)整性較差區(qū)域，而復(fù)合絲素蛋白后材料微孔結(jié)構(gòu)分布更均勻，因此使得復(fù)合材料降解速率得到控制。10 周后降解率達到28.15%，與單軸HA/PVA/SF 降解率值相差不大，說明此時降解主要發(fā)生在內(nèi)芯載體材料。臨床研究發(fā)現(xiàn)，不同年齡、傷患部位的骨缺損患者骨愈合周期長短不一，時間范圍為植骨手術(shù)后（4～9）個月。

由于骨愈合周期較長，成骨速度慢，且作為藥物載體材料，應(yīng)使藥物緩慢均勻地釋放來保證病灶區(qū)域長期維持一定殺菌濃度，因此復(fù)合材料骨組織工程支架降解速率不宜過快，否則影響骨結(jié)核患者術(shù)后恢復(fù)，所以包裹著含絲素蛋白材料的同軸骨組織工程支架降解速率更理想。

3.4 力學性能分析

將三組骨組織工程支架經(jīng)2、4、6、8、10 周降解后取出，擦干表面多余水分，并冷凍干燥至質(zhì)量不發(fā)生變化。在常溫環(huán)境下利用新疆醫(yī)科大學提供的伺服控制拉伸試驗機進行非金屬壓縮試驗。施加載荷的速度為0.5mm/min，借助微機控制電子萬能試驗機測控系統(tǒng)得到其試驗力-變形曲線?？箟簭姸扔嬎愎饺缦?/p>

式中：p—抗壓強度；P—破壞時的最大載荷；A—樣本試驗接觸面面積。結(jié)果如圖5 所示。

圖5 復(fù)合材料骨組織工程支架抗壓強度曲線圖Fig.5 Compressive Strength of Composite Materials vs Degradation Times

HA/PVA 骨組織工程支架在降解前的抗壓強度為34.82MPa，隨著在PBS 緩沖液中降解時間延長力學性能逐漸降低。降解10周后抗壓強度減小為18.63 MPa。HA/PVA/SF 復(fù)合材料骨組織工程支架在經(jīng)過10 周降解后，抗壓強度變?yōu)?.91 MPa，在三組中力學強度最差。同軸復(fù)合材料骨組織工程支架相比于HA/PVA/SF材料，因外層使用了HA/PVA 復(fù)合材料，支架抗變形能力有所提高。降解4 周后抗壓強度衰減率明顯變大，這是由于降解主要發(fā)生于支架表面，外殼材料孔洞增多，導(dǎo)致力學性能顯著變差。降解6 周后，力學性能衰減速率變小，這是由于在降解中期，外殼材料保護作用逐漸變?nèi)?，使得更多緩沖液接觸到內(nèi)芯材料。而在外殼復(fù)合材料基礎(chǔ)上添加了絲素蛋白作為內(nèi)芯材料后，其微觀形貌更規(guī)整，微孔結(jié)構(gòu)分布更加均勻，這種現(xiàn)象將延緩復(fù)合材料降解速率，使支架材料抗變形能力衰減速度趨于平緩。因骨組織替代材料需滿足人體松質(zhì)骨抗壓強度4-13MPa，同軸骨組織工程支架在降解終期的抗壓強度為12.61MPa，仍在此范圍內(nèi)，說明在藥物載體材料降解過程中同軸梯度骨組織工程支架可滿足力學支撐條件。

4 結(jié)論

（1）SEM 分析結(jié)果表明，同軸復(fù)合材料骨組織工程支架隨著降解時間的延長孔洞數(shù)量不斷增多，這將有利于成骨細胞黏附、增殖，并提供新骨生長的空間。降解10 周后，溶液呈弱酸性，整個過程無過酸過堿物質(zhì)產(chǎn)生，可提供細胞正常增殖的微環(huán)境。

（2）與單軸羥基磷灰石/聚乙烯醇骨組織工程支架相比，由于內(nèi)芯藥物載體材料復(fù)合了具有穩(wěn)定β-折疊構(gòu)象的絲素蛋白，同軸支架降解速率明顯變得緩慢，這可為后續(xù)藥物隨載體材料降解而長期持續(xù)釋放提供理論基礎(chǔ)。

（3）相比于單軸羥基磷灰石/聚乙烯醇/絲素蛋白復(fù)合材料，同軸復(fù)合材料骨組織工程支架因羥基磷灰石/聚乙烯醇表層材料賦予了其更優(yōu)異的力學性能，基本滿足松質(zhì)骨抗壓強度要求，可為后期體內(nèi)植入提供參考依據(jù)。但體外模擬的環(huán)境終究和體內(nèi)存在差別，因此同軸骨組織工程支架體內(nèi)降解性能仍需考察。