廖成敏

（昆明理工大學(xué)，云南 昆明 650500）

人體組織是高度復(fù)雜的系統(tǒng)，由萬億個(gè)細(xì)胞組成，這些細(xì)胞在種類、時(shí)間和空間上有所不同，但它們相互協(xié)調(diào)，形成獨(dú)特的微環(huán)境，以維持器官功能和處理信息，進(jìn)而確定細(xì)胞類型?；趯θ梭w器官分子基礎(chǔ)的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物器官轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性是由類型、狀態(tài)、數(shù)量不同的細(xì)胞因發(fā)育（時(shí)間）和區(qū)域（空間）存在差異而造成的。

高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）通常用于鑒定細(xì)胞類型和推斷發(fā)育軌跡等。scRNA-seq方法應(yīng)用廣泛，包括偽時(shí)態(tài)分析[1]、條形碼標(biāo)記細(xì)胞的起源[2]、以特定時(shí)間間隔連續(xù)采樣[3]，可以揭示細(xì)胞命運(yùn)、決定細(xì)胞譜系和發(fā)育軌跡。然而，scRNA-seq無法解決空間異質(zhì)性的問題，基于微流控scRNA-seq技術(shù)，例如inDrop、Dropseq、microwell-seq和Split-seq等在組織消化后，細(xì)胞形成懸浮液，此時(shí)已丟失空間位置信息，無法將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組信息與空間位置進(jìn)行匹配。

因此，獲取空間轉(zhuǎn)錄組信息是研究人員的長期目標(biāo)，從早期嘗試使用熒光原位雜交（Flourescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH）的方法[4]，到目前單細(xì)胞分辨率下的空間轉(zhuǎn)錄組檢測[5]。最近，某學(xué)者使用了早先提出的一種RNA成像方法和FISH技術(shù)描繪了下丘腦視前區(qū)的空間分辨圖譜[6]，發(fā)現(xiàn)下丘腦視前區(qū)覆蓋了大約70個(gè)神經(jīng)元簇，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于整個(gè)大腦。此外，同一群體內(nèi)的細(xì)胞具有不同的分子特征，為了更好地了解細(xì)胞異質(zhì)性，有必要同時(shí)記錄它們的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性和空間坐標(biāo)。

1 空間轉(zhuǎn)錄組的主要優(yōu)勢

首先，空間轉(zhuǎn)錄組可以提供基因表達(dá)的“組織空間位置”信息，彌補(bǔ)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的最大缺點(diǎn)。其次，空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)只需要提供“組織切片”，但是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組需要制備細(xì)胞懸浮液或“原生質(zhì)體”，而在植物中，原生質(zhì)體的獲得非常困難。最后，空間轉(zhuǎn)錄組得到的空間位置信息可以作為細(xì)胞類群判定的一種注釋信息，結(jié)合組織解剖學(xué)等知識，可以更快、更好地判斷細(xì)胞所屬類群，這在非模式物種的單細(xì)胞組學(xué)研究中具有很好的應(yīng)用前景。

2 空間分辨轉(zhuǎn)錄學(xué)技術(shù)的研究進(jìn)展

一般而言，現(xiàn)有的產(chǎn)生空間分辨轉(zhuǎn)錄本的方法可分為4類：

（1）利用計(jì)算機(jī)算法，根據(jù)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)模擬重構(gòu)組織的空間形態(tài)。例如Seurat是一個(gè)在單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析中廣泛用到的R包，可以利用scRNA-seq數(shù)據(jù)，加上對標(biāo)志基因進(jìn)行原位測序的結(jié)果重構(gòu)組織的空間信息。

（2）激光顯微切割加二代測序（LCM+NGS）。這種技術(shù)對儀器和實(shí)驗(yàn)人員的操作要求較高，而且獲取的通量也比較低，如果組織非常珍貴或者研究的內(nèi)容十分精細(xì)，可以考慮使用這種方法。但是這種方法因細(xì)胞通量低，應(yīng)用較為困難。

（3）基于高分辨圖像的原位測序。最經(jīng)典的是smFISH，但這種方法的通量比較低。最近發(fā)布的FISH-seq技術(shù)通過多輪雜交的方式，已經(jīng)把測序通量提高到了超過 10 000個(gè)轉(zhuǎn)錄本。

（4）基于空間條形碼（spatial barcodes）的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，是目前的主流技術(shù)。以商業(yè)化的10x Genomics Ⅴisium為例，簡述基于空間條形碼的空間轉(zhuǎn)錄組工作流程。整個(gè)流程一共分為6步：第一，將冷凍組織切片，把切片放到芯片上。第二，用HE或者IF對組織切片進(jìn)行染色，類似于“質(zhì)控”，用來檢驗(yàn)切片和貼片是否成功。第三，組織透化。在這一步中，向切片添加透化試劑，使得細(xì)胞的mRNA垂直向下釋放到spot中，并與連有空間條形碼的捕獲極進(jìn)行連接，然后通過被捕獲的mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。第四，去除組織切片，釋放cDNA，進(jìn)入測序文庫構(gòu)建。第五，測序，目前通常使用illumina二代測序。第六，數(shù)據(jù)分析，目前已經(jīng)開發(fā)了很多成熟的分析包。

3 展望

雖然空間轉(zhuǎn)錄學(xué)在發(fā)現(xiàn)疾病因子、建立空間圖譜和描繪空間藍(lán)圖方面得到了廣泛的應(yīng)用，但其潛力遠(yuǎn)不止于此。例如，在細(xì)胞間通信的研究中，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和已知的配體-受體復(fù)合物中推斷出不同細(xì)胞類型的上下信號串?dāng)_[7]。然而，單個(gè)細(xì)胞間正在進(jìn)行的相互作用很難立即捕捉。無論是在組織中還是在培養(yǎng)環(huán)境中，緊密空間中的細(xì)胞更有可能相互作用，這正是空間轉(zhuǎn)錄技術(shù)的作用。空間轉(zhuǎn)錄組被引入細(xì)胞間通信的研究是有希望的。一些實(shí)驗(yàn)已經(jīng)顯示了缺血神經(jīng)元的體細(xì)胞和軸突線粒體在單細(xì)胞尺度上的通信[8]。利用圖像的方法（如seqFISH+、Merfish和Starmap）可以為觀察單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的分子行為提供亞細(xì)胞視圖，使分析基因-基因相互作用、基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和多模式組學(xué)成為可能[9]。研究表明，DNA變異與mRNA表達(dá)有關(guān)[10]，因此，同時(shí)檢測處于原始坐標(biāo)的分子可以加深人們對轉(zhuǎn)錄因子如何激活基因進(jìn)行表達(dá)、基因如何相互溝通以及細(xì)胞如何運(yùn)作的理解。突破這些瓶頸已成為下一個(gè)發(fā)展方向。

在這些障礙中，當(dāng)前技術(shù)的主要挑戰(zhàn)是從單細(xì)胞原位獲得無偏向性的轉(zhuǎn)錄組，因?yàn)楝F(xiàn)有大多數(shù)基于實(shí)驗(yàn)的方法都是從靶向方法smFISH衍生出來的。SMR、SmHCR和osmFISH具有較高的檢測效率和信號強(qiáng)度。相比之下，seqFISH+和Merfish可以從大量細(xì)胞中原位測量超過 10 000個(gè)mRNA，但它們不能準(zhǔn)確檢測新序列或小序列變體。FISH-seq是一種介于靶向性和無偏向性方法之間的折中解決方案，但這種方法效率低，難以在組織上實(shí)施，僅對較短的讀數(shù)進(jìn)行測序，無法準(zhǔn)確檢測變異體或新片段?；贚CM的方法，一旦突破了細(xì)胞通量低的瓶頸，就具有巨大的潛力，因?yàn)樗鼈兛梢酝ㄟ^深度測序獲得全基因覆蓋的轉(zhuǎn)錄本。在計(jì)算機(jī)技術(shù)中，這些方法充分利用了來自scRNA-seq、原位雜交和已發(fā)表的現(xiàn)有數(shù)據(jù)來重建組織的空間轉(zhuǎn)錄。然而，細(xì)胞的實(shí)際坐標(biāo)不能完全匹配，這些方法通常會簡化建模過程以便于計(jì)算。因此，需要開發(fā)能夠伴隨高通量scRNA-seq的高空間分辨率的新技術(shù)。這些較為完善的技術(shù)的出現(xiàn)，將使它們在解決一系列生物學(xué)問題方面得到廣泛的應(yīng)用。