施錦濤，張凱，張芮浩，王克平，周海宇,*

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，蘭州 730030；2甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點實驗室，蘭州 730030；3蘭州市西固區(qū)人民醫(yī)院骨科，蘭州 730060

骨肉瘤是最為常見的骨惡性腫瘤，其特點為好發(fā)于長骨干骺端，進(jìn)展迅速且預(yù)后不良，在青少年和兒童中病死率很高[1-2]，突出癥狀為腫瘤部位疼痛，且存在高度轉(zhuǎn)移性，如腦轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移[3-4]，5年總生存率為71%[5]。盡管有證據(jù)表明，骨肉瘤起源于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)或更具可塑性的成骨細(xì)胞前體[6-7]，但具體機制目前尚未明確。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，作為抗腫瘤免疫檢查點，程序性死亡蛋白1(PD-1)及其配體1(PD-L1)在骨肉瘤中高表達(dá)[8-10]，PD-1/PD-L1軸在介導(dǎo)骨肉瘤發(fā)生免疫逃逸并導(dǎo)致其進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[11]。本文綜述了PD-1/PD-L1軸在骨肉瘤中最新研究進(jìn)展，以期為認(rèn)識和治療骨肉瘤提供新的理論依據(jù)。

1 PD-1/PD-L1軸研究

1.1 主要特點 PD-1又稱分化簇279(CD279)，是一個由288個氨基酸構(gòu)成的膜蛋白，也是一種重要的免疫抑制分子，在活化的T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)。與PD-1結(jié)合的配體PD-L1又稱表面抗原分化簇274(CD274)或B7同源體(B7-H1)，通常在腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)中表達(dá)，并通過PD-1/PD-L1途徑調(diào)控腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞的免疫耐受進(jìn)程[12-13]。PD-1負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞受體(TCR)信號，可上調(diào)E3-泛素連接酶CBL-b和c-CBL，觸發(fā)T細(xì)胞受體下調(diào)，抑制T細(xì)胞的活化及細(xì)胞因子的釋放，PD-1/PD-L1可廣泛地負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。隨著腫瘤免疫相關(guān)研究的深入，越來越多的證據(jù)表明，實體腫瘤可逃避自身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，而相關(guān)抗腫瘤免疫治療取得了良好的效果，逐漸引起了研究者的關(guān)注[14-17]。作為腫瘤免疫檢查位點，PD-1/PD-L1在骨肉瘤治療中的研究也已深入開展。

1.2 PD-1/PD-L1與骨肉瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的變化 腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。除腫瘤細(xì)胞外，骨肉瘤中還存在免疫細(xì)胞浸潤，當(dāng)出現(xiàn)腫瘤時，機體可通過自身的細(xì)胞免疫或體液免疫消除腫瘤細(xì)胞或抑制其增長，從而起到免疫監(jiān)視作用。當(dāng)骨肉瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較高的免疫原性時，濾泡輔助性T細(xì)胞高表達(dá)PD-1，低表達(dá)抗腫瘤物質(zhì)白細(xì)胞介素-21(IL-21)，從而減弱CD8+T細(xì)胞釋放干擾素γ(IFN-γ)及脫顆粒的能力，進(jìn)而降低T細(xì)胞對骨肉瘤細(xì)胞的毒性[18]。IFN-γ是由有絲分裂原刺激T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的一種高效的抗病毒生物活性物質(zhì)，在腫瘤免疫中發(fā)揮一定作用[19]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ可誘導(dǎo)血管肉瘤中PD-L1的表達(dá)進(jìn)而產(chǎn)生免疫耐受[20]，Yoshida等[21]在骨肉瘤中也觀察到了此現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)抗PD-L1抗體可明顯減少CD4+T細(xì)胞中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory cells，Tregs)的數(shù)量，增加CD8+T細(xì)胞浸潤[22]，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。Markel等[23]的研究發(fā)現(xiàn)，抗PD-L1抗體能減緩T細(xì)胞的耗竭，提示T細(xì)胞在PD-L1介導(dǎo)骨肉瘤產(chǎn)生免疫耐受的過程中發(fā)揮重要作用。據(jù)報道，在MG-63型骨肉瘤細(xì)胞系中PD-L1呈高表達(dá)，且該細(xì)胞系能耐受NK細(xì)胞的殺傷作用，當(dāng)阻斷PD-1/PD-L1時，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性增強，并通過顆粒酶B(GZMB)發(fā)揮對骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用[24]。Yoshida等[25]研究19例骨肉瘤臨床標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，IFN-γ和GZMB的表達(dá)與PD-L1呈明顯正相關(guān)。骨肉瘤原發(fā)部位存在較多的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤，相應(yīng)地PD-L1表達(dá)也明顯增強，且IFN-γ刺激可增加骨肉瘤細(xì)胞系中PD-L1的表達(dá)[26]，提示骨肉瘤可適應(yīng)免疫抗性，產(chǎn)生PD-L1，進(jìn)而逃避免疫細(xì)胞的殺傷作用。綜上，PD-1/PD-L1可通過弱化CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞的功能而導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞的免疫逃逸，因此，上述免疫細(xì)胞可作為拮抗PD-1/PD-L1對骨肉瘤作用的靶向免疫細(xì)胞，從而為骨肉瘤的治療提供策略。

1.3 PD-1/PD-L1經(jīng)信號通路介導(dǎo)骨肉瘤免疫逃逸

腫瘤發(fā)生發(fā)展涉及的相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制備受研究者關(guān)注，深入研究和理解骨肉瘤相關(guān)通路對認(rèn)識骨肉瘤以及探尋新的干預(yù)手段有一定指導(dǎo)意義。JAK/STAT信號通路是參與腫瘤發(fā)生的常見信號通路，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(STAT3)是其重要組成部分，阻斷STAT3可增加腫瘤組織中細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，激活先天性免疫激活的樹突細(xì)胞，引起腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)[27-28]，從而介導(dǎo)機體免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，STAT3可調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)[29]。Dhupkar等[30]在人體原發(fā)和轉(zhuǎn)移的骨肉瘤中均觀察到PD-L1的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)抗PD-L1抗體能阻滯p-STAT-3/p-ERK1/2信號傳導(dǎo)，激活M1巨噬細(xì)胞，減少M2巨噬細(xì)胞的數(shù)量，導(dǎo)致骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量顯著減少。作為抗腫瘤靶向藥物，舒尼替尼(sunitinib)和阿帕替尼(apatinib)可通過特異性阻斷相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，表明舒尼替尼和阿帕替尼可使STAT3失活，從而降低骨肉瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，減弱體內(nèi)骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移潛力[22,31]。有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白脫乙?；?(HDAC6)能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，其調(diào)節(jié)PD-L1的機制主要由STAT3介導(dǎo)，而選擇性HDAC6抑制劑能明顯抑制骨肉瘤的生長[32]。由此可見，PD-L1經(jīng)STAT3轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在致骨肉瘤免疫逃逸中扮演著重要角色，選擇性阻斷該信號通路可能在骨肉瘤治療中發(fā)揮更有效的作用。

磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在維持細(xì)胞的生長、代謝中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑參與了骨肉瘤的發(fā)展，可調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡、遷移、侵襲和化療耐藥性[33]。既往有研究報道，PD-L1由PI3K/AKT信號途徑傳導(dǎo)[34]，使用p110γ特異性抑制劑能抑制髓樣細(xì)胞腫瘤浸潤，使腫瘤對PD-1阻斷治療更敏感[35]， 因此PD-1/PD-L1經(jīng)PI3K信號通路可能參與了骨肉瘤的發(fā)展。磷酸酶和張力同系物(PTEN)基因位于人類10號染色體，編碼含有403個氨基酸的蛋白質(zhì)，作為PI3K/AKT信號通路負(fù)調(diào)節(jié)劑，PTEN蛋白能抑制PD-L1在細(xì)胞中的表達(dá)[36]，與骨肉瘤的侵襲性密切相關(guān)[37]。最近Wu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)YVE、RhoGEF和含PH結(jié)構(gòu)域的蛋白1(FGD1)可結(jié)合PTEN的N端區(qū)域，從而抑制PTEN的功能，進(jìn)而促進(jìn)PI3K/AKT活化、PD-L1上調(diào)以及骨肉瘤的進(jìn)展。此外，骨肉瘤中髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)高表達(dá)，可重塑腫瘤微環(huán)境以促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，而PI3Kδ/γ在MDSCs中高表達(dá)，應(yīng)用PI3Kδ/γ抑制劑能誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞CD8+T細(xì)胞浸潤，上調(diào)PD-L1的表達(dá)[39-40]。

1.4 M i c r o R N A 可經(jīng)P D-L 1 致骨肉瘤進(jìn)展 MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控，且與PD-L1的表達(dá)密切相關(guān)[41]。Ji等[42]發(fā)現(xiàn)，miR-140在骨肉瘤中低表達(dá)，可與下游靶基因mRNA的3'UTR結(jié)合，直接下調(diào)PD-L1的表達(dá)，增加細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞浸潤，降低Tregs的表達(dá)，進(jìn)而抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長，而這種作用可能是通過抑制mTOR/S6Ks信號通路實現(xiàn)的。最近Liu等[43]發(fā)現(xiàn)，microRNA-200a參與了骨肉瘤的進(jìn)展，其在骨肉瘤中高表達(dá)，與骨肉瘤預(yù)后不良明顯相關(guān)，且在體內(nèi)、體外均可通過PTEN上調(diào)PD-L1蛋白水平，減少CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞數(shù)量，增加Foxp3+Tregs比例，抑制細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)分泌IFN-γ，從而促進(jìn)骨肉瘤的生長。據(jù)報道，miR-106a與長鏈非編碼RNA(LINC00657)相互作用，可上調(diào)PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致骨肉瘤的侵襲[44]。由此可見，miRNA可經(jīng)PD-L1調(diào)節(jié)骨肉瘤的發(fā)展，因此基于敲除相關(guān)miRNA及阻斷PD-L1或許能加強干預(yù)骨肉瘤的效果，但仍需進(jìn)一步研究加以證實。圖1為PD-1/PD-L1軸介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞免疫逃逸的機制。

圖1 PD-1/PD-L1軸介導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞免疫逃逸的機制Fig.1 Mechanism of immune escape mediated by PD-1/PD-L1 axis in osteosarcoma

2 骨肉瘤治療研究

2.1 動物實驗 手術(shù)切除后再進(jìn)行局部放療和全身化療是目前腫瘤治療的標(biāo)準(zhǔn)方法，但仍存在全身性進(jìn)展或遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移以及對化療耐藥等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤預(yù)后不良，因此尋找新的治療措施尤為重要。兩項Meta分析顯示，PD-1/PD-L1在骨肉瘤中高表達(dá)，與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，常提示預(yù)后較差[45-46]，因此阻斷PD-1/PD-L1可能為抑制骨肉瘤進(jìn)展的有效措施。研究發(fā)現(xiàn)，將抗PD-1抗體用于LM8系骨肉瘤大鼠，骨肉瘤生長不僅得到了較好的控制，且明顯延長了大鼠的生存時間[(35.2±3.7) d vs. (25.4±1.6) d，P=0.047][21]。Zheng等[47]研究發(fā)現(xiàn)，PD-1、PD-L1在骨肉瘤組織中陽性表達(dá)率為27.4%、35.5%；骨肉瘤大鼠腹腔注射10 mg/(kg.5 d)基于抗PD-1抗體的納武單抗(nivolumab)，可明顯抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能。Shimizu等[48]將200 μg抗PD-1/PD-L1抗體注射于實驗大鼠腹腔中，發(fā)現(xiàn)其可明顯延長了大鼠的生存時間(P=0.002)，50%的大鼠在腫瘤移植后存活超過16周，并無肺部轉(zhuǎn)移。由此可見，抗PD-1/PD-L1抗體能有效治療骨肉瘤并抑制其 進(jìn)展。

基于當(dāng)前對腫瘤的早期手術(shù)以及放化療治療方式，腫瘤治療效果仍然不理想，研究人員嘗試常規(guī)治療手段結(jié)合PD-1/PD-L1靶向治療，并取得了一定成果。Shimizu等[49]將早期減瘤手術(shù)與抗PD-L1抗體聯(lián)合應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，該治療方式能明顯延長實驗大鼠的生存期，且約50%的實驗大鼠存活超過16周(P=0.001)。也有研究證實，放療(輻射劑量5 Gy和8 Gy)盡管在早期能抑制骨肉瘤的生長，但后期卻出現(xiàn)腫瘤逆生長，分析原因為放療反應(yīng)性增加了骨肉瘤PD-L1的表達(dá)，而放療聯(lián)合抗PD-1抗體可明顯改善實驗大鼠外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例，減少MDSCs，增強抗腫瘤效應(yīng)，降低腦轉(zhuǎn)移風(fēng)險[50-51]。順鉑、阿霉素為惡性腫瘤一線用藥，研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素聯(lián)合抗PD-L1抗體治療實驗大鼠，能逆轉(zhuǎn)骨肉瘤免疫抑制微環(huán)境狀態(tài)，使CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞比例增加，并降低Tregs細(xì)胞比例，進(jìn)而產(chǎn)生更好的抗腫瘤效果[52]。此外，聯(lián)合應(yīng)用抗PD-L1抗體亦可增強順鉑的抗腫瘤效果(表1)[53]。因此，在手術(shù)、放化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用PD-1/PD-L1靶向藥為延緩骨肉瘤進(jìn)展提供了新策略。

2.2 臨床試驗 目前基于PD-1/PD-L1軸的臨床試驗逐漸開展，納入臨床研究的藥物有基于抗PD-1/PD-L1抗體的哌姆單抗(pembrolizumab)和納武單抗。一項兩隊列、單臂、開放性2期臨床研究共納入86例晚期肉瘤患者，其中40例為骨肉瘤患者，每3周靜脈輸注200 mg哌姆單抗(輸注時間30 min)進(jìn)行治療，中位隨訪時間17.8個月，發(fā)現(xiàn)2例(5%)部分緩解(partial response，PR)，9例(23%)疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)，29例(73%)疾病進(jìn)展(progressive disease，PD)，中位總生存期(median survival time，MST)為52周[54]，由此可見，骨肉瘤患者對治療的不良反應(yīng)很少。Le Cesne等[55]的一項開放性、多中心、2期臨床研究中，晚期骨肉瘤患者采用口服環(huán)磷酰胺(50 mg/次，2次/d)和靜脈注射200 mg哌姆單抗(每3周1次)方式治療，中位隨訪時間18.9個月，發(fā)現(xiàn)2例6個月內(nèi)無進(jìn)展(progressionfree survival，F(xiàn)PS)，無進(jìn)展率為13.3%(95%CI 1.7～40.5)，1例部分緩解(PR)，且骨肉瘤PD-L1表達(dá)呈陰性，4例腫瘤體積縮小，表明哌姆單抗聯(lián)合低劑量環(huán)磷酰胺無不良反應(yīng)，對晚期骨肉瘤的治療顯示出中等活性，因此有必要進(jìn)一步研究PD-1抑制劑與藥物聯(lián)合使用對骨肉瘤的影響。另一項多中心、開放標(biāo)簽、單臂1-2期針對兒童實體腫瘤的臨床試驗中，兒童每14 d服用3 mg/kg納武單抗治療，中位隨訪時間30 d，發(fā)現(xiàn)患兒對納武單抗治療耐受性良好，但在擴大的2期隊列中并未觀察到骨肉瘤對單藥納武單抗治療的客觀反應(yīng)(表1)[56]。

表1 基于PD-1/PD-L1軸治療骨肉瘤的研究Tab.1 Researches on the treatment of osteosarcoma based on PD-1/PD-L1 axis

3 總結(jié)與展望

PD-1/PD-L1軸已經(jīng)在多數(shù)研究中被證實可介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸，與骨肉瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，基于PD-1/PD-L1軸治療骨肉瘤的動物實驗也取得了良好的效果，為研究和治療骨肉瘤提供了新的思路與策略?；赑D-1/PD-L1軸開發(fā)的藥物可作為治療骨肉瘤的新興藥物，然而目前的臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)，雖然PD-1/PD-L1軸阻斷藥治療骨肉瘤效果較好，但由于骨肉瘤存在腫瘤異質(zhì)性，加之該類藥物昂貴，限制了納入臨床研究的樣本量，因此擴大招募研究對象，延展基礎(chǔ)研究與臨床試驗對深入認(rèn)識PD-1/PD-L1靶向藥治療骨肉瘤尤其重要。另外，聯(lián)合應(yīng)用放化療與PD-1/PD-L1軸阻斷藥可能是應(yīng)對骨肉瘤惡化的有效手段，但仍需進(jìn)一步的試驗驗證。