楊 鼎，伊風艷，曄薷罕，田如剛，吳江鴻，2

（1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2. 內(nèi)蒙古民族大學動物科技學院， 內(nèi)蒙古 通遼028000）

反芻家畜包括牛、羊、鹿等，不僅是人類重要的動物產(chǎn)品來源， 也是溫室氣體甲烷重要的排放源。棲息在瘤胃及腸道中的7 000 余種細菌、 原生動物、古細菌和噬菌體等微生物［1-2］，將不易被反芻動物消化吸收的植物木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、維生素、胡蘿卜素等［3-4］，以及將飼料中的毒性物質(zhì)代謝為無毒物質(zhì)［5］。

瘤胃中以纖維素分解菌為優(yōu)勢菌， 包括產(chǎn)琥珀酸擬桿菌、白色瘤胃球菌、黃化瘤胃球菌和溶纖維丁酸弧菌等［6-7］。 在門水平上以厚壁菌門和擬桿菌門細菌為優(yōu)勢菌， 在屬層面上則以普雷沃菌屬細菌為優(yōu)勢菌［8-9］。 了解反芻家畜瘤胃及腸道微生物多樣性，以及微生物與宿主動物、日糧結(jié)構(gòu)、環(huán)境因子營養(yǎng)代謝互作機制， 有助于建立科學有效的方法改善動物福利， 提高動物生產(chǎn)效率和動物產(chǎn)品質(zhì)量，減少溫室氣體排放。此外，隨著第二代、第三代測序技術(shù)的成熟和發(fā)展， 宏基因組學在瘤胃微生物組研究方面已經(jīng)得到了廣泛應用。 結(jié)合宏基因組學、 宏蛋白質(zhì)組學、RNA-Seq 等多組學研究，國內(nèi)外近年來產(chǎn)生了一些重要的研究成果。筆者結(jié)合當前研究熱點， 從反芻動物瘤胃和腸道微生物多樣性變化以及功能方面進行綜述， 以期為探索瘤胃和腸道微生物在反芻動物營養(yǎng)代謝中的作用及其機制提供參考。

1 多因素影響瘤胃及腸道微生物多樣性

反芻家畜瘤胃及腸道微生物處于一個復雜的微生態(tài)系統(tǒng)， 其多樣性與該系統(tǒng)中的各項因素存在緊密聯(lián)系。 影響反芻動物瘤胃及腸道微生物多樣性的因素主要包括生物因素和非生物因素。 生物因素指消化道微生物互相作用、 宿主動物狀態(tài)和日糧結(jié)構(gòu)等，非生物因素指地理、氣候、溫度、光照等。 瘤胃及腸道微生物作為影響反芻動物營養(yǎng)代謝的重要因子， 參與了該微生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)。 高原藏羚羊以及草原蒙古羊，都在冬季放牧時增加了瘤胃微生物維持氮平衡能量的需求，這是高原地區(qū)反芻家畜冬季補飼的重要原因［10-11］。

1.1 群體感應——瘤胃微生物相互作用

多項研究表明瘤胃微生物之間存在群體感應。群體感應是一種微生物細胞間的通信機制，微生物通過分泌信號分子感知細胞（群體）密度，并在信號分子達到一定濃度時， 通過調(diào)節(jié)特定基因的表達調(diào)控群體內(nèi)微生物眾多生理生化過程。 不同的瘤胃微生物在降解營養(yǎng)物質(zhì)時存在復雜的共生和競爭關(guān)系。在飼喂不同精粗比日糧過程中，使特定細菌分泌大量信號分子N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones, AHLs），發(fā)生群體感應，建立不同優(yōu)勢種群的微生物。飼喂高精粗比日糧時，分泌長鏈AHLs 的細菌是優(yōu)勢菌群，而飼喂低精粗比日糧時分泌短鏈AHLs 的細菌是優(yōu)勢菌群［12］。

以上研究證明瘤胃微生物的群體感應是一種微生物群體對周圍環(huán)境及營養(yǎng)結(jié)構(gòu)的適應機制，表現(xiàn)形式為瘤胃微生物多樣性變化，但導致瘤胃微生物多樣性變化的因素有很多。 相比之下，群體感應在眾多影響因素中的重要程度還有待研究。

1.2 日糧結(jié)構(gòu)對瘤胃及腸道微生物的影響

改善日糧結(jié)構(gòu)是保障動物健康、 提升動物產(chǎn)品數(shù)量和質(zhì)量的重要途徑， 同時又是減輕反芻家畜甲烷排放、提高飼料轉(zhuǎn)化效率的方法［13］。 莫放等［14］研究發(fā)現(xiàn)日糧對瘤胃細菌氮的生成具有決定性作用。 Henderson 等［15］對來自35 個國家、32 個種類反芻動物的742 個樣本進行瘤胃微生物多樣性分析， 發(fā)現(xiàn)日糧結(jié)構(gòu)對瘤胃微生物多樣性具有關(guān)鍵作用。

穩(wěn)定的瘤胃微生態(tài)是宿主動物正常營養(yǎng)代謝的重要保障， 高微生物多樣性是瘤胃微生態(tài)穩(wěn)定的重要前提。通過改善日糧結(jié)構(gòu)，提升瘤胃內(nèi)微生物多樣性是保障家畜健康的有效方法。 高纖維比日糧可提升瘤胃微生物多樣性， 有助于建立穩(wěn)定的瘤胃微生態(tài)。Bergmann［16］研究發(fā)現(xiàn)，飼喂飼草比飼喂谷物更能提升北美野牛消化道微生物多樣性以及擬桿菌門細菌的相對豐度， 飼喂谷物則會顯著提高厚壁菌門細菌和丙型變形菌的相對豐度。王柏輝等［17］研究發(fā)現(xiàn)，日糧纖維素含量更高的放牧組蘇尼特羊比舍飼組蘇尼特羊具有更高的瘤胃微生物多樣性， 瘤胃球菌屬和纖維桿菌屬細菌的豐度顯著增加。 筆者所在研究團隊［18］也發(fā)現(xiàn)高纖維駝絨藜日糧比高蛋白質(zhì)苜蓿日糧更能提高羊瘤胃微生物多樣性； 盡管苜蓿日糧在羊增重速率上顯著高于駝絨藜日糧，但其瘤胃微生物種類單一，優(yōu)勢菌主要為分解蛋白質(zhì)的普雷沃菌， 這與侯明杰等［19］的研究結(jié)果一致。 飼喂苜蓿日糧時羊瘤胃微生物多樣性明顯低于飼喂駝絨藜日糧， 這是放牧家畜由于攝入大量高纖維素飼草， 比舍飼家畜具有更高的瘤胃微生物多樣性的有力佐證。 瘤胃日糧底物與分解該底物的微生物數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系，高纖維日糧對纖維素酶需求的增加，促進了纖維素分解菌的增殖［20］。 董春曉等［21］研究發(fā)現(xiàn)高纖維粗飼料可提高瘤胃中乙酸的比例， 利于纖維素分解菌的增殖。 趙夢迪等［22］在湖羊日糧中添加纖維素酶，提高了纖維素分解能力，同時也提高了瘤胃中微生物的多樣性， 這一研究結(jié)果也與筆者所在研究團隊的預期一致。

與之相反的是，隨著精料比例的提高，粗蛋白質(zhì)和能量的采食量增加，為瘤胃微生物的生長提供了大量的碳源和氮源， 提高了瘤胃微生物氮的產(chǎn)量和蛋白質(zhì)的合成效率［23］，表現(xiàn)為尿嘌呤氮含量增加［24］和瘤胃代謝產(chǎn)物中氮濃度升高［25］，以及 微生物多樣性的相對降低。 李與琦等［26］在湖羊日糧中添加50%以上的微貯棉稈， 發(fā)現(xiàn)隨著日糧中蛋白質(zhì)比例的上升，瘤胃微生物多樣性降低，此時瘤胃微生物主要是擬桿菌門和厚壁菌門細菌， 普雷沃菌為優(yōu)勢菌。 郭凱等［27］也發(fā)現(xiàn)高蛋白質(zhì)飼料會引起犢牛瘤胃內(nèi)微生物豐度和操作分類單位（operational taxonomic unit，OTU）降低。

以上研究表明日糧結(jié)構(gòu)是影響反芻動物消化道微生物多樣性的關(guān)鍵因素， 高纖維日糧可提升微生物多樣性，有利于消化道微生態(tài)的穩(wěn)定；高蛋白質(zhì)日糧可加快反芻動物生長速度， 但降低了瘤胃微生物多樣性。因此，通過調(diào)整日糧結(jié)構(gòu)可以有效改變反芻動物消化道微生物的多樣性和功能，影響動物生產(chǎn)性狀，但其中的機制還不清楚，有待研究。

1.3 飼料添加劑和益生素對瘤胃及腸道微生物的影響

1.3.1 具有抗生素功能的飼料添加劑抗生素類或益生素飼料添加劑可抑制反芻家畜胃腸道病原微生物增殖，改善胃腸道微生態(tài)平衡，但同時引起人們對抗生素殘留和細菌耐藥性的擔憂［28］。Thomas等［29］研究發(fā)現(xiàn)，在北美洲地區(qū)牛場中莫能菌素和泰樂菌素不僅可以作為抗生素類飼料添加劑預防日糧中碳水化合物快速消化帶來的疾病風險，還可以提高飼料轉(zhuǎn)化率并降低肝膿腫發(fā)生率。 鑒于抗生素潛在的缺陷， 尋找綠色無公害植物性抗菌劑是替代傳統(tǒng)抗生素的重要途徑。 陳會良等［30-31］研究發(fā)現(xiàn)牛至油含有抗菌植物復合酚， 對豬源和雞源大腸桿菌和沙門菌引起的腸道疾病有很好的療效。柏妍等［32］也發(fā)現(xiàn)牛至油除了具有抗菌功能，還能提高荷斯坦犢牛瘤胃中白色瘤胃球菌的數(shù)量，起到調(diào)控瘤胃微生物區(qū)系的作用。張智安等［33］發(fā)現(xiàn)在湖羊日糧中添加蜜蜂肽具有替代抗生素的作用。 此外，蜜蜂肽還可以提高湖羊瘤胃中的乙酸/丙酸比，促進瘤胃乙酸型發(fā)酵［34］。

1.3.2 具有調(diào)節(jié)微生物功能的飼料添加劑除了抗菌功能， 飼料添加劑還有調(diào)節(jié)消化道功能的作用，通過調(diào)節(jié)瘤胃微生物區(qū)系及其代謝，增加有益菌數(shù)量，提高纖維素酶和木聚糖酶濃度。粗飼料代謝能利用效率低于精飼料， 重要的原因在于體內(nèi)葡萄糖供給不足，導致動用氨基酸生成葡萄糖，造成家畜氮營養(yǎng)狀況惡化。郭剛等［35］研究表明，添加丙酸鈣可補充反芻動物的重要糖源丙酸， 進而促進氮平衡，瘤胃微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量顯著提高。閆韓韓等［36］在山羊日糧中添加了不同濃度的葡萄糖、尿素、無機鹽等，發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物數(shù)量增加，但對多樣性沒有顯著影響。王婷［37］研究表明，在肉羊日糧中添加葡萄籽對瘤胃微生物多樣性沒有顯著影響，但增加了普雷沃菌的相對豐度。雙金［38］研究發(fā)現(xiàn)，在肉羊日糧中添加熟處理的富含α-亞麻酸油籽，可提高飼料表觀消化率并改善瘤胃發(fā)酵環(huán)境。烏日勒格［39］研究發(fā)現(xiàn)，在育肥羊日糧中添加枯草芽孢桿菌，可提高羊瘤胃中擬桿菌門細菌的數(shù)量，并增強分解纖維素的能力。 趙亞星等［40］在肉羊日糧中添加沙蔥， 顯著提高了瘤胃液中總細菌和總厭氧真菌含量以及木聚糖酶和脂肪酶活性， 顯著降低了瘤胃液中原蟲含量。 陳丹丹［41］發(fā)現(xiàn)在肉羊日糧中添加桑葉黃酮、白藜蘆醇、茶皂素和大蒜素后，瘤胃中原蟲和甲烷菌的數(shù)量有一定降低，纖維素分解菌的數(shù)量有一定升高。 劉文杰等［42-43］研究發(fā)現(xiàn)在小尾寒羊日糧中添加賴氨酸， 可使瘤胃球菌總數(shù)增加，同時提高粗蛋白質(zhì)的表觀消化率。此外， 功能驗證表明飼糧中添加賴氨酸沒有引起腸道內(nèi)微生物耐藥基因的表達［29］。 周瑞等［44］研究表明在綿羊日糧中添加牛至精油能促進瘤胃發(fā)育以及瘤胃纖維素分解菌的增殖，提高消化酶的活性。此外，也有研究表明，日糧中添加牛至油可提高奶牛瘤胃微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量，并降低氮排泄［45-46］。 日糧中添加牛至油配合肉桂醛， 對奶牛瘤胃微生物蛋白質(zhì)產(chǎn)量的提升效果更好［47］。 王淑潔［48］在犢牛日糧中添加刺五加， 發(fā)現(xiàn)不僅可以提高瘤胃中雙歧桿菌、乳酸桿菌等微生物的數(shù)量，還可以增加小腸絨毛的長度和密度。 董春曉等［49］研究表明，在湖羊日糧中添加蜜蜂肽， 瘤胃內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性都有顯著提升， 同時革蘭陰性菌的生長受到抑制。

2 宿主動物與瘤胃及腸道微生物的相互作用

宿主動物消化道為微生物提供了生存的場所、厭氧環(huán)境以及適宜的溫度。 此外，宿主消化道上皮細胞的代謝產(chǎn)物，分泌入消化道的消化液，以及宿主的生理、 病理狀態(tài)都能直接或間接影響瘤胃及腸道微生物的多樣性及功能。

2.1 宿主品種對瘤胃及腸道微生物營養(yǎng)代謝的作用

動物品種對瘤胃微生物的影響要大于日糧結(jié)構(gòu)和其他因素。 劉開朗等［50］研究發(fā)現(xiàn)，牛品種對瘤胃微生物組成的影響大于日糧結(jié)構(gòu)等其他因素，在相同的飼喂條件下，魯西肉牛和荷斯坦奶牛的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)具有顯著差異。Zhang 等［51］研究發(fā)現(xiàn)奶牛和水牛小腸中的薩特氏菌屬、 糞球菌屬和Dorea 菌屬細菌的相對數(shù)量具有顯著差異。

2.2 消化道不同位點對其中微生物營養(yǎng)代謝的作用

Bergmann［16］以相似微生物多樣性為依據(jù)，將反芻動物消化道分為3 個部分。首先是前腸，包括食管、瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃；其次是中腸，包括十二指腸、空腸和回腸；最后是后腸，包括盲腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸和直腸。 由于消化道不同位點具有不同的環(huán)境條件，如溫度、內(nèi)容物、pH 值和厭氧條件等， 導致其中的微生物多樣性不同。 瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃中主要是消化纖維素的菌種。 小腸是中和胃酸的主要器官，優(yōu)勢菌是厚壁菌門細菌，厚細胞壁結(jié)構(gòu)使其能在高酸性食糜環(huán)境中生存，而其他微生物受到高酸性的抑制［16］。 后腸的作用主要是調(diào)節(jié)水鹽平衡；盲腸、結(jié)腸和直腸的微生物生物量僅次于前腸， 微生物通過發(fā)酵殘留纖維素為宿主提供多種維生素。

Wang 等［52］在對小尾寒羊進行了全消化道微生物多樣性分析后發(fā)現(xiàn)，消化道中的優(yōu)勢菌為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門細菌；胃中的優(yōu)勢菌為普雷沃菌、毛螺菌和丁酸弧菌；小腸中的優(yōu)勢菌為大腸埃希菌、毛螺菌和瘤胃球菌；大腸中的優(yōu)勢菌為瘤胃球菌、疣微菌和普雷沃菌。 He 等［53］發(fā)現(xiàn)駱駝消化道中存在27 個細菌門類，優(yōu)勢菌為厚壁菌門、疣微菌門和擬桿菌門細菌，且糞便和大腸中的細菌區(qū)系沒有區(qū)別。Zhang 等［54］發(fā)現(xiàn)小尾寒羊的盲腸和直腸不僅含有較高豐度的厚壁菌門和擬桿菌門細菌， 而且微生物多樣性極為相似。Bergmann［16］研究發(fā)現(xiàn)，美洲野牛小腸中的微生物多樣性最低， 擬桿菌門細菌在小腸的相對豐度最低，而厚壁菌門和廣古菌門細菌相對豐度較高。筆者的前期研究比較了羊瘤胃與十二指腸的微生物結(jié)構(gòu)，其優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門和厚壁菌門，但發(fā)現(xiàn)兩者的菌群結(jié)構(gòu)差異非常大， 甚至發(fā)生了翻轉(zhuǎn)（未發(fā)表）。

以上研究表明消化道不同位點由于具備不同的營養(yǎng)條件，導致微生物多樣性存在差異，同時優(yōu)勢菌種和微生物功能不同，因此，要研究微生物多樣性，首先要確定目標消化道位點。單個位點的研究價值有限， 在試驗過程中從離體糞便中取樣是否可以代表宿主體內(nèi)的情況還值得商榷。 所以對全消化道微生物進行研究， 從整體上對消化道微生物與宿主的相互作用進行把握， 是未來研究的方向。在生產(chǎn)實踐中，不論調(diào)整日糧結(jié)構(gòu)還是添加益生素都要以消化道位點為最先考慮要素， 這樣才能目標明確地指導生產(chǎn)。

2.3 宿主動物不同生理和病理狀態(tài)對消化道微生物的影響

2.3.1 幼畜斷奶前后消化道微生物營養(yǎng)代謝變化反芻動物剛出生時，由于食管溝閉合，乳汁沿著食管溝直接流入皺胃和腸道。 其消化方式與單胃動物類似。隨著固體飼料采食量的增加，瘤胃逐漸發(fā)揮營養(yǎng)生理功能，其中，微生物區(qū)系在瘤胃中的建立是重要步驟。 Elie 等［55］研究發(fā)現(xiàn)一些促進瘤胃發(fā)育的細菌在犢牛出生后一天就可以被檢測到。快速建立瘤胃微生物區(qū)系是縮短犢牛斷奶時間的措施之一。 斷奶后幼畜的瘤胃微生物區(qū)系逐漸建立，影響因素主要包括分娩過程、初乳、固體飼料及斷奶過程等［56］。 李永洙等［57］對羔羊早期哺喂代乳粉后發(fā)現(xiàn)，瘤胃微生物區(qū)系變化明顯，擬桿菌門細菌成為優(yōu)勢菌，普雷沃菌的相對豐度增加，這與筆者所在研究團隊獲得的高蛋白質(zhì)飼草飼喂下羊瘤胃微生物區(qū)系的研究結(jié)果一致。Alipour 等［58］采集了剛出生和出生后一周犢牛的直腸內(nèi)容物， 對其進行微生物多樣性分析表明， 初生犢牛直腸胎糞和黏膜的微生物多樣性較低，僅由厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門細菌組成；一周后直腸微生物多樣性又被大腸埃希菌、 志賀桿菌和梭狀芽孢桿菌等另外幾種細菌入侵， 之前的多樣性被打破。 Fomenky 等［59］研究表明，在犢牛斷奶前期日糧中添加釀酒酵母菌和嗜酸乳桿菌， 可提高回腸中益生菌纖維桿菌屬細菌的豐度， 并且對常見致病菌鏈球菌屬細菌和Tyzzerella 屬細菌具有抑制作用。

張?zhí)穑?0］研究表明，補飼滅菌瘤胃液可促進犢牛生長，并影響瘤胃微生物多樣性。Li 等［61］對初生犢?？谇还嘧⒊赡昱Ａ鑫竷?nèi)容物后， 發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物四門八屬的細菌數(shù)量顯著增加，同時，肝細胞的磷酸化水平顯著提高。Ribeiro 等［62］研究表明，對犢牛灌注成年牛瘤胃內(nèi)容物， 改變了瘤胃內(nèi)微生物多樣性并提高了蛋白質(zhì)消化和氮貯存水平。 張?zhí)穑?0］研究表明，對犢牛飼喂成年牛滅活瘤胃液，沒有明顯提高生長性能， 原因可能是滅活過程中將成年牛瘤胃液中的活性成分破壞。 高蛋白質(zhì)飼草可作為開食料保障幼畜平穩(wěn)斷奶。 楊斌等［63］研究表明， 幼齡湖羊補飼苜蓿對斷奶前后瘤胃微生物變化無明顯影響，但與斷奶前相比，斷奶后湖羊瘤胃纖維素分解菌數(shù)量增加， 可加快羔羊適應高纖維飼糧的進程。李雙［64］研究發(fā)現(xiàn)，犢牛哺乳期飼喂復合營養(yǎng)還原奶（營養(yǎng)成分包括維生素、氨基酸、酶制劑、益生菌等），可有效改善瘤胃發(fā)酵環(huán)境，改變瘤胃發(fā)酵模式，降低犢牛腹瀉發(fā)生率。 此外，一些添加劑還有助于幼畜消化道的發(fā)育。 陳清華等［65］研究表明，牛膝多糖能促進幼畜腸道黏膜上皮細胞發(fā)育，降低腸絨毛隱窩深度，增加腸絨毛高度。 具有同樣功效的還有刺五加［48］。

以上研究表明幼畜由于消化道發(fā)育不完全和日糧結(jié)構(gòu)單一，消化道菌群結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，且極易被病原微生物入侵定植， 導致消化道疾病。 鑒于此，在幼畜出生后通過多種手段（成年牛瘤胃內(nèi)容物、益生元）迅速在其消化道內(nèi)建立穩(wěn)定的微生物區(qū)系，同時輔以高蛋白質(zhì)飼草（苜蓿），不僅有利于幼畜營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用， 也有利于抵抗外來病原菌的入侵，以平穩(wěn)度過斷奶期。

2.3.2 奶牛在不同生理期及患病狀態(tài)下消化道微生物的變化健康穩(wěn)定的腸道微生態(tài)對外來病原菌具有定植抗性。但在臨產(chǎn)前期，懷孕母牛對非傷寒沙門菌的易感性大大增加。 這是由于動物在特定的生理或病理狀態(tài)下， 穩(wěn)定的腸道微生態(tài)會被打破， 減弱了定植抗性， 從而有利于病原菌的定植。 Munoz-vargas 等［66］研究了臨產(chǎn)前懷孕母牛糞便沙門菌和腸道微生物區(qū)系的關(guān)系， 對臨產(chǎn)前3周、1 周， 產(chǎn)后1 周、3 周來自不同牧場的98 份牛糞便樣本進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣本中的優(yōu)勢微生物為擬桿菌門細菌、厚壁菌門細菌、螺旋原蟲和變形菌門細菌， 優(yōu)勢微生物在產(chǎn)前和產(chǎn)后有顯著的變化； 但沙門菌的定植與糞便微生物區(qū)系沒有緊密的聯(lián)系。奶牛在泌乳期對蛋白質(zhì)的需求加大，日糧中高蛋白質(zhì)飼草比例提高， 帶來的結(jié)果是瘤胃中分解蛋白質(zhì)能力強的細菌成為泌乳期的優(yōu)勢菌種。Sun 等［67］對334 頭泌乳期荷斯坦奶牛瘤胃細菌多樣性進行分析， 發(fā)現(xiàn)擬桿菌門細菌和普雷沃菌作為優(yōu)勢菌相對豐度最大， 占細菌豐度總量的60.65%。 同樣，Delgado 等［68］發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)奶牛瘤胃中含有高豐度的擬桿菌門細菌和普雷沃菌， 以及低豐度的厚壁菌門細菌和甲烷桿菌。 以上研究結(jié)果表明， 高蛋白質(zhì)飼草會促使分解蛋白質(zhì)能力強的普雷沃菌成為優(yōu)勢菌種。在生產(chǎn)實踐中，可將分解蛋白質(zhì)能力較強的菌種作為飼料添加劑， 理論上可有效提高瘤胃對高蛋白質(zhì)飼草的消化率。

動物在患病狀態(tài)下腸道微生態(tài)狀況也與正常狀態(tài)不同。趙潔等［69］研究表明，患乳房炎奶牛糞便中的乳桿菌和纖毛蟲多樣性明顯較低， 說明非健康狀態(tài)的奶牛腸道微生態(tài)發(fā)生了改變。 放牧家畜在草原上易采食有毒牧草，如小花棘豆。 王帥等［7］研究發(fā)現(xiàn)， 對和田羊飼喂小花棘豆可顯著降低瘤胃液總細菌數(shù)量以及纖毛蟲、 內(nèi)毛蟲和雙毛蟲數(shù)量。定期對牧場牧草種類多樣性進行調(diào)查，對有毒有害牧草進行早期預警和除草干預是減少放牧家畜中毒的有效措施。

高精日糧由于含有高能量可促使瘤胃丁酸菌大量增殖，以致產(chǎn)生大量丁酸，降低瘤胃液pH 值，使家畜發(fā)生酸中毒癥［70］。 為了降低由高精日糧引起的酸中毒發(fā)生率， 優(yōu)選日糧精粗比以及使用新型飼料添加劑一直以來是反芻動物營養(yǎng)研究的熱點。 Li 等［61］對發(fā)生瘤胃酸中毒的犢牛進行瘤胃上皮細胞轉(zhuǎn)錄組和瘤胃微生物宏轉(zhuǎn)錄組研究， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患牛與對照組相比除了增重速度減慢，瘤胃中革蘭陰性菌豐度也增加， 且瘤胃上皮細胞轉(zhuǎn)錄組有672 個基因呈現(xiàn)顯著的差異性表達， 導致細胞信號和形態(tài)學發(fā)生變化，進而引起病變。研究人員采用多種方法降低瘤胃酸中毒給家畜帶來的不利影響。高雨飛［70］研究表明在牛日糧中添加煙酸，可促進瘤胃中原蟲生長，避免淀粉發(fā)酵，抑制產(chǎn)丁酸細菌生長，從而有效降低瘤胃液pH 值。 孫劼［71］研究表明添加β-谷甾醇可以調(diào)節(jié)湖羊瘤胃菌群結(jié)構(gòu)，提高代謝乳酸的細菌相對豐度，從而緩解酸中毒癥狀。 Golder 等［72］研究發(fā)現(xiàn)瘤胃酸中毒患牛的基因組、微生物組和生理變化存在緊密的聯(lián)系，進一步研究可為選育酸中毒耐受型奶牛提供理論支撐。 硫胺素（VB1）以硫胺素焦磷酸輔酶的形式，參與α-酮酸的氧化脫羧反應，如果缺乏該維生素會積累大量中間代謝產(chǎn)物乳酸，從而誘導酸中毒。郝志敏等［73］在體外培養(yǎng)荷斯坦牛瘤胃液中添加硫胺素后發(fā)現(xiàn)，可提高培養(yǎng)液的pH 值，降低酸中毒發(fā)生風險并提高細菌蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

健康宿主動物的消化道是一個穩(wěn)定的、 微生物種類多樣的微生態(tài)環(huán)境， 當宿主處于某種生理或病理狀態(tài)時， 微生態(tài)穩(wěn)態(tài)也被打破并處于變化中。動物生長過程受疾病、應激和發(fā)情等多因素影響，目前關(guān)于反芻動物生理、病理狀態(tài)對消化道微生物影響機制的研究還很有限， 未來還需進一步研究。

2.3.3 反芻家畜消化道微生物代謝功能的研究消化道微生物的代謝產(chǎn)物是研究微生物功能的關(guān)鍵，盡管受到厭氧試驗條件難以獲得，以及大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)等因素的限制， 近年來該方面的研究還是取得了進展。在傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)方法上，傅帥等［74］應用缺陷培養(yǎng)基成功分離到1 株高效分泌賴氨酸的陰溝腸桿菌。 目前微生物厭氧培養(yǎng)技術(shù)和多組學技術(shù)已經(jīng)被直接應用于反芻家畜消化道微生物區(qū)系的多樣性、結(jié)構(gòu)和功能方面的研究［75］。但翻譯產(chǎn)物并不與基因表達直接對應， 基因的功能還需要考慮翻譯后修飾的影響， 并需要在蛋白質(zhì)水平上進行驗證［76］。Prajapati 等［77］研究發(fā)現(xiàn)高粗纖維日糧條件下，牛瘤胃微生物中與分解芳香族化合物相關(guān)的基因表達水平更高， 且擬桿菌門細菌在所有組中是優(yōu)勢菌。 Shen 等［78］研究發(fā)現(xiàn)精飼料會引起山羊瘤胃微生物數(shù)量激增， 并促進瘤胃上皮細胞8 個抗細胞因子基因的表達。研究表明，腸道微生物對藥物成分具有代謝作用， 某些中藥有效成分是在腸道微生物的作用下生成的。 姜洪帥等［79］研究發(fā)現(xiàn)牛蒡苷在經(jīng)過腸道微生物代謝作用后，有效成分變?yōu)榕］蜍赵兔摷谆a(chǎn)物，起關(guān)鍵作用的是組成酶和誘導酶。Hart 等［76］研究表明，奶牛瘤胃中豐度最大的細菌門為擬桿菌門、 厚壁菌門和變形菌門， 宏蛋白質(zhì)組研究結(jié)果與瘤胃中優(yōu)勢微生物生態(tài)位一致，此外，豐度最大的幾種微生物之間的代謝通路有顯著不同。Zhang 等［51］研究發(fā)現(xiàn)，水牛消化道微生物的氨基酸、脂多糖和維生素合成都比奶?；钴S， 奶牛的丙酮酸鹽代謝和碳固定反應則表現(xiàn)更好； 牛奶中的蛋白質(zhì)含量與微生物中氨基酸合成呈正相關(guān)關(guān)系。 白色瘤胃球菌是瘤胃中具有分解半纖維素和纖維素能力的細菌， 其功能的發(fā)揮主要依賴由內(nèi)切型纖維素水解酶、外切型纖維素水解酶和β-葡萄糖苷酶組成的酶系。 Iakiviak 等［80］對白色瘤胃球菌-8 株進行基因組分析， 發(fā)現(xiàn)17 個分解纖維素基因的突變體；將這些基因進行原核表達后， 表達產(chǎn)物中7 個為內(nèi)切型纖維素酶，釋放出纖維二糖和纖維三糖；除了2 種內(nèi)切型纖維素酶， 其余的表達產(chǎn)物都與微晶纖維素綁定， 證實了功能性碳水化合物結(jié)合模塊的存在。

綜上， 消化道微生物的多樣性和功能與家畜生產(chǎn)性能、飼料消化率、日采食量和疾病治療等具有對應關(guān)系， 可通過調(diào)整消化道微生物對家畜生產(chǎn)進行有限指導。 今后需要進一步了解消化道微生物與宿主的作用機制， 找到更有指向性和可操作性的指標， 達到通過調(diào)整微生物多樣性和功能指導生產(chǎn)的目的。

3 溫室氣體甲烷排放與瘤胃微生物代謝關(guān)系

瘤胃產(chǎn)甲烷菌能將H2、CO2、甲酸等化合物轉(zhuǎn)化成甲烷。甲烷不可被動物利用，以噯氣的方式排到體外，進入大氣環(huán)境。反芻動物產(chǎn)生的甲烷是大氣甲烷的一個重要來源。 產(chǎn)甲烷菌生成甲烷需要消耗飼料，浪費代謝能量，因此，科學降低甲烷產(chǎn)量是反芻家畜養(yǎng)殖節(jié)本增效的重要途徑。 硝酸鹽可作為瘤胃中的氫結(jié)合物降低用于甲烷合成的氫離子水平。 劉太峰［81］研究表明利用硝酸鈣包被豆粕不僅降低了山羊瘤胃甲烷產(chǎn)量， 而且對腸道微生物蛋白質(zhì)合成沒有影響。 產(chǎn)甲烷菌伴隨家畜的一生。Wang 等［82］研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)甲烷菌在黑山羊出生后1 d 就定植在瘤胃液態(tài)內(nèi)容物和瘤胃上皮細胞， 隨著宿主年齡的增加產(chǎn)甲烷菌菌群結(jié)構(gòu)和豐度呈動態(tài)變化。 Shabat 等［83］研究發(fā)現(xiàn)富集特殊細菌能夠強化動物能量和碳的代謝通路， 減少甲烷的排放。Xiang 等［84］通過研究奶牛瘤胃上皮細胞轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)， 日糧干物質(zhì)含量增加可引起與細胞周期和代謝相關(guān)的基因表達活躍， 導致瘤胃短鏈脂肪酸和甲烷的代謝顯著增加。 陳宇［85］在湖羊瘤胃液中添加木聚糖酶和纖維素酶， 發(fā)現(xiàn)可降低產(chǎn)甲烷菌濃度。

4 多組學加速消化道微生物營養(yǎng)代謝研究進程

得益于第二代、 第三代測序技術(shù)的成熟和推廣，基于宏基因組學、宏轉(zhuǎn)錄組學和宏蛋白質(zhì)組學等多組學分析， 在分子水平上闡釋腸道微生物營養(yǎng)代謝機理， 可為科學指導生產(chǎn)提供強大的理論支撐。

4.1 完善消化道微生物基因注釋，深入挖掘消化道微生物潛力

有研究表明人體腸道細菌菌群約有300 萬個基因，是人體基因數(shù)量約150 倍［86］。這些基因信息的深入挖掘， 對詮釋消化道微生物與宿主健康關(guān)系，研究消化道微生物在疾病中發(fā)揮的作用，及時監(jiān)控、預防、干預消化道微生物，進而開發(fā)新藥和新菌劑具有重要意義。

利用多種基因文庫構(gòu)建方法， 從中篩選出功能基因一直是研究人員努力的目標。 核酸分子雜交技術(shù)、變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、 溫度梯度凝膠電泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE）、 定量PCR 技術(shù)是早期研究瘤胃微生物的方法［87］。 獲取高質(zhì)量瘤胃樣本DNA 是建立基因文庫的保障［88］。以Fosmid 或Cosmid 等載體構(gòu)建宏基因組文庫是在第二代測序技術(shù)普及之前研究瘤胃微生物多樣性和功能的主要方法。 研究人員應用Fosmid 文庫從牛瘤胃微生物中篩選出纖維素酶基因和木聚糖酶基因［89-94］。 此外，還有以細菌人工染色體作為載體構(gòu)建瘤胃宏基因組文庫的報道［95］。 環(huán)境基因組標簽技術(shù)（environmental genomic tags，EGTs）不需要對宏基因組進行組裝， 僅取基因組小片段進行BLAST 比對即可。 周熊艷等［96］利用EGTs 技術(shù)分析了云南大額牛瘤胃微生物多樣性，結(jié)果表明，云南大額牛瘤胃微生物主要屬于10 個門，擬桿菌門和厚壁菌門細菌豐度最高， 主要的纖維素降解菌為黃化瘤胃球菌、溶纖維丁酸弧菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌。

隨著計算機技術(shù)的飛速發(fā)展， 第二代測序技術(shù)已經(jīng)顯著提高了宏基因組、16S rRNA 擴增子和宏轉(zhuǎn)錄組等多組學分析的研究效率。 筆者綜述的絕大多數(shù)研究成果是基于第二代測序技術(shù)得到的。對測序數(shù)據(jù)的分析基于對基因功能的注釋，因此， 注釋基因庫的構(gòu)建與完善是利用多組學研究消化道微生物多樣性和功能的基石。

來自新西蘭和美國多個機構(gòu)的科學家公布了迄今為止最大規(guī)模的靶向培養(yǎng)和測序項目之一Hungate1000 研究項目的最新成果。 目前這一項目總共包含501 個基因組，最新研究報道了410 個瘤胃微生物基因組序列，另外91 個基因組序列來自其他已經(jīng)公開發(fā)表的研究［97］。其他國家的研究人員也開展了研究。 Kang 等［98］從牛瘤胃中分離到1 株Sporanaerobacter acetigenes （F-12 株）并繪制了其基因組草圖， 該菌株基因組包括2 866 191 bp 堿基和2 889 個編碼序列。 此外，他們還對1 株從奶牛瘤胃中分離到的Oribacterium sp.（C9 株）細菌進行基因組分析和注釋， 得到含有3 720 024 bp 堿基的基因組草圖和3 130 個編碼序列［99］。

宏基因組學和宏轉(zhuǎn)錄組學在研究動物消化道微生物代謝和開發(fā)微生物資源上展示出強勁的優(yōu)勢。 但由于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫對微生物基因功能注釋不足，延緩了研究的進度，是該領域進一步深入研究的瓶頸，也是今后研究的重要方向。

4.2 應用多組學篩選功能基因，獲得有效微生態(tài)制劑

邵明旭［100］對小尾寒羊空腸、盲腸和直腸內(nèi)容物進行了微生物多樣性分析，進而從生長性能、耐酸、耐膽鹽和抑制有害菌生長方面進行篩選，分離獲得干酪乳桿菌、 植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌3株具有應用潛力的益生菌。 楊輝［101］以芒草馴養(yǎng)牛瘤胃微生物， 改變了牛瘤胃微生物組成及纖維素酶的豐度， 并篩選出一個與降解芒草特性相關(guān)的纖維素酶基因。 吳瓊等［102］應用宏基因組學預測發(fā)現(xiàn)西門塔爾牛瘤胃內(nèi)富含大量木質(zhì)素和纖維素降解酶基因。

4.3 厘清影響動物產(chǎn)品品質(zhì)的營養(yǎng)代謝通路，篩選功能性添加劑

膽堿在調(diào)控單胃動物肌內(nèi)脂肪沉積方面起到重要作用。 瘤胃中的原蟲是反芻動物重要的過瘤胃膽堿源，但影響肌內(nèi)脂肪沉積的因素眾多，瘤胃微生物對膽堿的作用相對有限。 李華偉［103］研究了膽堿對脂肪代謝和肌內(nèi)脂肪形成的影響， 發(fā)現(xiàn)過瘤胃膽堿具有降低肉羊內(nèi)臟脂肪沉積、 增加皮下脂肪厚度的作用， 不同育肥階段的肌內(nèi)脂肪沉積效果不同。 此外，Tang 等［104］研究了牛日糧中棉酚旋光異構(gòu)體被瘤胃微生物代謝進入牛血清后的變化， 發(fā)現(xiàn)瘤胃微生物對棉酚旋光異構(gòu)體沒有選擇性降解。

5 小結(jié)與展望

筆者以反芻動物瘤胃和腸道微生物為對象，探討了與其多樣性和營養(yǎng)代謝存在直接或間接聯(lián)系的微生物、日糧、添加劑、宿主、自然環(huán)境等因素的相互作用。 以上各種因子構(gòu)成了以反芻動物為主體，以消化道微生物為重要組成部分，以日糧、飼料添加劑、 自然因素等因子為補充的微型生態(tài)系統(tǒng)。該生態(tài)系統(tǒng)的平穩(wěn)、高效運轉(zhuǎn)是保證家畜健康、獲得優(yōu)質(zhì)動物產(chǎn)品、減少溫室氣體排放和降低生產(chǎn)成本的基礎。

首先， 對反芻動物消化道微生物具有決定作用的是動物種類， 不同種動物的消化道微生物有本質(zhì)不同。 其次，具有關(guān)鍵作用的是日糧組成，這是人為調(diào)控動物營養(yǎng)水平的有效手段。 日糧可直接影響消化道微生物的多樣性和代謝， 補充飼料添加劑是人為干預消化道微生物營養(yǎng)代謝的重要手段。 此外，宿主動物的生理、病理狀態(tài)都可影響消化道內(nèi)環(huán)境， 是人為調(diào)整消化道微生物必須考慮的因素。因此，消化道微生物與其所在微生態(tài)系統(tǒng)中其他因子的作用及機制， 是人為干預反芻家畜營養(yǎng)代謝的理論基礎，也是未來研究的方向。