龍麗，馮海興，王燦茂，楊琴，吳馥凌，侯連兵

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣東 廣州 510515)

菝葜(SmilaxchinaL.)又名金剛藤，是百合科植物菝葜的干燥根莖，主要分布于長(zhǎng)江以南的多個(gè)省份。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為菝葜性味甘、微苦、澀、平，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功效[1]。以菝葜藥材為原料藥的制劑在臨床上應(yīng)用廣泛且療效確切，如金剛藤軟膠囊(國藥準(zhǔn)字Z20070006)[2]，主治慢性盆腔炎、附件炎、子宮內(nèi)膜炎等炎癥性疾病[3]。目前，菝葜藥材仍缺乏有效的質(zhì)量控制方法，2015年版《中國藥典》未收載其制劑。而在指紋圖譜方面，周艷林等[4]分別對(duì)菝葜藥材脂溶性成分和黃酮類成分運(yùn)用 HPLC 指紋圖譜進(jìn)行了分析。楊立勇等[5]對(duì)貴州產(chǎn)菝葜及其混淆品光葉菝葜的指紋圖譜進(jìn)行了綜合分析比較。徐貝等[6]則以湘產(chǎn)菝葜為研究對(duì)象進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析。但金剛藤膠囊的原料藥的質(zhì)量控制還是很難推進(jìn)。結(jié)合本課題組前期研究[7-8]和菝葜與抗盆腔炎大鼠譜效學(xué)研究[9]表明：菝葜藥材的總黃酮成分是潛在的藥效成分。為此，本研究采用HPLC法建立了菝葜藥材指紋圖譜，并對(duì)菝葜藥材進(jìn)行聚類分析，以期發(fā)現(xiàn)菝葜藥材中總黃酮成分含量較高的產(chǎn)地，為其制劑原料藥的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀(美國Dionex公司，LPG-3400SD四元泵、TCC3000-RS柱溫箱、WPS-3000SL自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器、Chromeleon7.2數(shù)據(jù)處理軟件)；Agilent 1260 高效液相色譜儀(G1311B四元泵、G1316A柱溫箱、G1315DDAD檢測(cè)器、G1329B進(jìn)樣器)；UFLC-Triple TOF-MS/MS超快速高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(LC-20AD-XR二元泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20AD-XR自動(dòng)進(jìn)樣器，SPD-M20A PDA 檢測(cè)器，日本島津公司；Triple TOF 5600 plus，美國 AB SCIEX公司)；中藥粉碎機(jī)(DMF-8A，浙江溫嶺市銘大藥材機(jī)械設(shè)備有限公司)；超純水器(Simplicity，美國Millipore公司)；萬分之一電子分析天平(ME204，瑞士Mettlertoledo公司)；數(shù)控超聲波清洗器(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

甲醇(分析純，廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：2019010128)；乙腈(色譜純，Honeywell，批號(hào)：UN1648)；磷酸(色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：P112025)；水為超純水。

黃杞苷對(duì)照品(批號(hào)：11906-201102，純度：93.7%)、槲皮苷對(duì)照品(批號(hào)：111538-201606，純度：90.6%)(中國食品藥品檢定研究院)；落新婦苷對(duì)照品(批號(hào)：A102725，純度：98%)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；異黃杞苷對(duì)照品(批號(hào)：B24735，純度：95%)(上海源葉生物科技有限公司)。

實(shí)驗(yàn)用20批菝葜藥材均購買于廣州市清平中藥材專業(yè)市場(chǎng)，并經(jīng)中山大學(xué)生命科學(xué)院廖文波教授鑒定為百合科植物菝葜(SmilaxchinaL.)的干燥根莖。藥材來源見表1。

表1 20批菝葜藥材來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品的制備

精密稱取菝葜藥材粉末(過2號(hào)篩)0.5 g，置于錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲(100 W，100 Hz)處理30 min，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。取上清液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取落新婦苷、槲皮苷、黃杞苷和異黃杞苷對(duì)照品適量，加甲醇制成對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度依次為122.6、55.0、502.4和85.0 μg/mL。

2.3 色譜條件

色譜柱：Hitachi High-Tech C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(0 min～18 min，10% A；18 min～120 min，10%～30% A)，檢測(cè)波長(zhǎng)：303 nm，進(jìn)樣量：10 μL，體積流量：1.0 mL/min，柱溫：30 ℃。理論板數(shù)按落新婦苷計(jì)算不得低于5000。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012版)》評(píng)價(jià)其相似度。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下菝葜藥材供試品溶液(樣品編號(hào)：S3)、空白溶劑(甲醇)、對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣，用相同的色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明專屬性良好，見圖1。

注：A：空白對(duì)照；B：混合對(duì)照品；C：菝葜供試品；8：落新婦苷；12：槲皮苷；13：黃杞苷；15：異黃杞苷。圖1 空白對(duì)照、混合對(duì)照品和菝葜藥材供試品的HPLC圖譜

2.4.2 精密度試驗(yàn)

取同一批菝葜藥材(樣品編號(hào)：S3)，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄 HPLC 色譜圖。根據(jù)對(duì)照品確認(rèn)8、12、13、15號(hào)峰依次為落新婦苷、槲皮苷、黃杞苷和異黃杞苷。其中13號(hào)峰面積大，且穩(wěn)定，設(shè)為參照峰，計(jì)算其他3個(gè)峰的相對(duì)保留時(shí)間與相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示：相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.02%～0.08%之間，相對(duì)峰面積RSD在0.14%～2.05%之間，相似度均等于1.00。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取同一批菝葜藥材(樣品編號(hào)：S3)，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24、48、72、120 h 進(jìn)樣，記錄 HPLC 色譜圖。結(jié)果顯示：相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.02%～0.09%之間，相對(duì)峰面積RSD在0.25%～1.09%之間，相似度均等于1.00。結(jié)果表明供試品溶液放置120 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批菝葜藥材(樣品編號(hào)：S3)，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法分別制備6份供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄 HPLC 色圖譜。結(jié)果顯示：相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.01%～0.04%之間，相對(duì)峰面積RSD在1.90%～3.54%之間，相似度均等于1.00。結(jié)果表明方法重復(fù)性好。

2.4.5 耐用性試驗(yàn)

取同一批菝葜藥材(樣品編號(hào)：S3)，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別使用Hitachi High-Tech C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，No.28H5I-019)、Thermo C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，No.01705069)、SEPAX Amethyst C18(4.6 mm×250 mm，5 μm，S.N.11041698382)3種型號(hào)色譜柱，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示：相對(duì)保留時(shí)間RSD在0.23%～0.64%之間，相對(duì)峰面積RSD在1.93%～3.54%之間，相似度均等于1.00，表明方法重復(fù)性好。

2.5 菝葜藥材指紋圖譜的構(gòu)建

2.5.1 指紋圖譜的獲得

取表1中的菝葜藥材按“2.1”項(xiàng)下方法處理，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄各色譜圖。各批次樣品疊加圖結(jié)果見圖2。

圖2 20批菝葜藥材HPLC指紋圖譜

2.5.2 共有峰和參照峰的確認(rèn)

分析20批菝葜樣品的測(cè)定結(jié)果，獲得19個(gè)共有峰(若某一圖譜在某一保留時(shí)間處無峰，相應(yīng)的峰面積為零，仍給相應(yīng)的編號(hào)，以保證各圖譜都有相同的色譜峰數(shù))，見圖3和表3。因8號(hào)和13號(hào)峰穩(wěn)定性好、分離度好且具有良好的抗炎活性[7,9]，故選擇該峰為參照峰。

圖3 不同批次菝葜藥材指紋圖譜共有模式

2.6 共有峰的確證

2.6.1 測(cè)定法

通過超快速高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)技術(shù)對(duì)“2.1”及“2.2”項(xiàng)下菝葜供試品溶液(樣品編號(hào)：S3)、對(duì)照品溶液、空白溶劑進(jìn)行檢測(cè)，色譜條件同“2.3”項(xiàng)下，分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，離子源噴霧電壓：5 500 V，離子源氣體壓力：255 psi，離子源氣體：155 psi，離子源溫度：550 ℃，碰撞氣壓力：10 psi，氣簾氣壓力：35 psi，掃描范圍：m/z 50～2 000，采用正、負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)。

2.6.2 共有峰的確證

檢測(cè)結(jié)果通過與碎片離子分析、保留時(shí)間、對(duì)照品對(duì)照及文獻(xiàn)查閱[10-19]，指認(rèn)并確證菝葜藥材指紋圖譜中共有峰所對(duì)應(yīng)的化合物。結(jié)果見表3。

表2 菝葜藥材19個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積

表3 菝葜藥材的化學(xué)成分質(zhì)譜歸屬

續(xù)表3

2.7 菝葜藥材的聚類分析

采用IBM SPSS Statistics 24.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件，將20批菝葜樣品的19個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積導(dǎo)入，使用瓦爾德聚類方法，用歐式平方距離計(jì)算樣品相似度，聚類結(jié)果見圖4。由聚類分析圖可見：當(dāng)歐式平方距離為8時(shí)，可將20批菝葜樣品聚為3類。S12、S15、S16、S17、S19聚為第一類；S2、S5、S8、S10、S18、S20聚為第二類；S1、S3、S4、S6、S7、S9、S11、S13、S14聚為第三類。結(jié)合表2和表3可知，第一類的產(chǎn)地均為云南，且成分以8號(hào)峰落新婦苷為主，平均相對(duì)峰面積在48%左右；第二類的6批菝葜藥材中1、2號(hào)峰(有機(jī)酸類)相對(duì)峰面積較高；第三類的9批菝葜藥材中14、18、19號(hào)峰(芪類和皂苷類)相對(duì)峰面積較高。

圖4 20批菝葜樣品的聚類分析圖譜

3 討論

中藥指紋圖譜是從中藥成分群角度出發(fā)的一種客觀、整體和多指標(biāo)的質(zhì)量評(píng)價(jià)方式，已被廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)[20-21]。本研究考察了柱溫對(duì)指紋圖譜的影響，發(fā)現(xiàn)30 ℃時(shí)各色譜峰形較好；采用DAD檢測(cè)器考察了各色譜峰的紫外光譜對(duì)指紋圖譜的影響，發(fā)現(xiàn)大部分化合物在290～320 nm處有較大吸收，故確定指紋圖譜的檢測(cè)波長(zhǎng)為303 nm。

本研究構(gòu)建了全國12個(gè)不同產(chǎn)地共20批次菝葜藥材的HPLC指紋圖譜，通過UFLC-Triple TOF-MS/MS技術(shù)指認(rèn)了19個(gè)共有峰，并確證了其中17個(gè)成分(見表3)，以有機(jī)酸類、黃酮類和皂苷類成分為主。因?yàn)樗幉漠a(chǎn)地來源的不同，在研究中發(fā)現(xiàn)各共有峰的相似度較小(<0.9)，說明菝葜藥材化合物成分含量受地理環(huán)境、氣候影響較大。根據(jù)各產(chǎn)地菝葜藥材聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：云南產(chǎn)地的菝葜藥材總黃酮化合物含量較高(落新婦苷、槲皮苷、黃杞苷和異黃杞苷總峰面積占比約為64.90%)，且黃酮類化合物中以落新婦苷含量最高(平均峰面積約占48.53%)。而貴州產(chǎn)地的有機(jī)酸含量較高(平均相對(duì)峰面積約占44.93%)。這為菝葜制劑原生藥材產(chǎn)地的篩選提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上所述，此研究建立了菝葜藥材HPLC指紋圖譜分析方法。該方法準(zhǔn)確度和精密度高，易于操作，適用性強(qiáng)?？蔀檩幂炙幉牡馁|(zhì)量控制評(píng)價(jià)提供新方法，也為菝葜藥材的物質(zhì)研究究奠定基礎(chǔ)。