梁其旭，張麗莉，王國棟，黃世玉，鐘幼平

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院,福建 廈門 361021;2.農(nóng)村農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021)

0 引言

紫海膽(Heliocidariscrassispina)隸屬棘皮動物門(Echinodermata)海膽綱(Echinoidea)拱齒目(Camarodonta)長海膽科(Echinometridae)，是我國南方海域最重要的經(jīng)濟海膽[1]。海膽性腺味道鮮美，口感極佳，富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，并含有多糖、β-胡蘿卜素和葉黃素等生理活性物質(zhì)，食用、保健和藥用價值較高，是一種高檔的海產(chǎn)品[2-3]。近年來，隨著市場的需求量增加，紫海膽的價格不斷上升，而自然資源因過度捕撈而逐漸下降，因此發(fā)展紫海膽?zhàn)B殖受到重視。我國北方早已開展海膽?zhàn)B殖，中間球海膽(Strongylocentrotusintermedius)的生產(chǎn)性育苗和人工養(yǎng)殖已產(chǎn)業(yè)化，成為北方沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的新興產(chǎn)業(yè)。中間球海膽繁殖盛期在9—11月[4]，而紫海膽繁殖季節(jié)在5—8月。選擇紫海膽作為南方的海水養(yǎng)殖品種，既可以彌補海膽市場的空檔期，又有利于養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的均衡健康發(fā)展。

從20世紀(jì)90年代末開始，我國有關(guān)科研單位相繼成功進行了紫海膽人工育苗[5-9]，但還存在著受精卵質(zhì)量差、育苗成活率低、變態(tài)困難和苗種生產(chǎn)不穩(wěn)定等問題[10]。本文擬改進紫海膽的人工育苗技術(shù)，旨在完善紫海膽育苗技術(shù)工藝，提高育苗存活率。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 紫海膽親本

紫海膽親本取自福建省漳州市東山海域，由潛水員采捕獲得。挑選外表完整，殼徑5～6 cm，體重90～110 g的個體作為備選親本。

1.1.2 海水處理

育苗試驗在集美大學(xué)海水試驗場進行。育苗用水處理方法有3種：天然海水經(jīng)沙濾和200目(74 μm)篩絹網(wǎng)袋過濾，稱為常規(guī)海水；40 W紫外燈對8 m3海水消毒12 h，稱為紫外線消毒海水；用0.01 μm孔徑的濾膜過濾，稱為超濾海水。育苗過程中海水水溫為28.5～31.0 ℃，鹽度為29.8～31.1，pH為7.8～8.2，溶解氧為5.9～6.4 mg/L。

1.1.3 育苗設(shè)施

以容積800 L、桶高1 m的藍(lán)色圓形塑料桶為孵化桶。浮游幼體培育、底棲硅藻培育和親本促熟均在3.0 m×4.0 m×1.5 m的水泥池進行。底棲硅藻培育和稚海膽采苗使用的是40 cm×33 cm的無毒透明PVC波紋板(以下統(tǒng)稱采苗板)，用塑料框架組裝，每框10片。

1.1.4 餌料

1.1.4.1 微藻培養(yǎng)

育苗使用牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)和球等鞭金藻(Isochtysisigalbana)。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)液f/2，鹽度(26.5±0.5)，溫度(25±1)℃，光周期(Light∶Dark)16L∶8D，光照強度1500 Lx。定期接種指數(shù)生長期的藻液以保持藻種的新鮮及活力，投喂以指數(shù)生長期末期的藻類細(xì)胞。

1.1.4.2 采苗板的準(zhǔn)備

育苗前1周開始培養(yǎng)底棲硅藻。將采苗板經(jīng)充分消毒洗刷后，平面朝上置于水泥池中，加入海水沒過采苗板后再接種，接種半小時后將采苗板翻面，確保兩個面都能附著藻種。培養(yǎng)期間微充氣，3 d 換1次水，換水后施肥(加入尿素(15 g/m3)、磷酸二氫鉀(2 g/m3)、檸檬酸鐵(0.2 g/m3)和硅酸鈉(2 g/m3))，使用遮陽網(wǎng)將光照控制在2000～3000 Lx。

1.2 試驗方法

1.2.1 親本培育及蓄養(yǎng)

親本暫養(yǎng)于水泥池網(wǎng)箱中，連續(xù)充氣，足量投喂海帶和牡蠣，每日投餌1次，次日清理殘餌，日投喂量為親本體重的5%，培養(yǎng)水溫控制在28 ℃。

促熟后的親本若短期內(nèi)不進行催產(chǎn)，可以將其培養(yǎng)溫度降低至20～22 ℃，并在該溫度下進行恒溫培育，足量投喂海帶。

1.2.2 催產(chǎn)與孵化

向親本圍口膜處注射濃度為0.5 mol/L的KCl(將3.7275 g KCl溶于100 mL雙蒸水中)進行催產(chǎn)。依據(jù)海膽大小每只注射2～3 mL，注射后將親本反口面朝下單獨浸沒在裝有海水的燒杯中待其排放。性腺成熟個體在注射后5 min內(nèi)即可排放精卵，收集1 h內(nèi)產(chǎn)的卵子進行人工授精。利用沉性卵的特點，進行卵子質(zhì)量篩選。即，在20 L的水桶中攪動卵子后再靜置10～15 min，將上層海水慢慢傾倒出，反復(fù)2～3次后獲得質(zhì)量上乘的卵子。收集少許卵子放入100 mL燒杯中，逐滴加入精子，直至顯微觀察到每個卵子周圍有5個左右精子，達(dá)到合適精子密度為止。再按此比例向所有卵子周圍加入所需精子。人工授精時卵子密度為10～50個/mL，精卵接觸后5 min即轉(zhuǎn)移到孵化桶進行孵化。孵化溫度為29.5 ℃，受精卵密度為10個/mL，孵化期間微充氣。

1.2.3 浮游幼體培育

浮游幼體培育先后嘗試了8次。

前5次使用常規(guī)海水在水泥池中育苗，稱為常規(guī)海水育苗。用200目篩絹對孵化的幼體進行選優(yōu)后，將上層幼體轉(zhuǎn)移至培育水體中，并將密度控制在1個/mL內(nèi)。自二腕幼體期開始投喂角毛藻，投餌量控制為1×104cell/mL。根據(jù)幼體發(fā)育情況逐步提高投餌量，四腕幼體期為2×104cell/mL，六腕幼體期為3×104cell/mL，八腕幼體期為4×104～5×104cell/mL。分早晚2次投喂。

第1次育苗不換水。之后4次育苗每日使用200目網(wǎng)箱換水1/2，并在每次投餌前鏡檢以確保餌料未被原生動物污染，以及投餌后2 h鏡檢觀察幼體發(fā)育、攝食狀況，再據(jù)以調(diào)節(jié)(增減)投喂的餌料密度。

第6次育苗使用紫外線消毒海水在孵化桶中進行，稱為紫外線消毒海水育苗。幼體選優(yōu)和投餌同前5次育苗。換水使用200目濾鼓，每日兩次，每次1/2，桶底有死苗或碎屑堆積時用虹吸管進行吸污處理，并在六腕幼體期進行倒池。幼體密度在六腕幼體前控制在1個/mL，之后控制在0.5個/mL，幼體密度過大時采用200目手抄網(wǎng)進行分桶培育。

第7次育苗使用超濾海水在孵化桶中進行，稱為小規(guī)模超濾海水育苗。幼體選優(yōu)和調(diào)密度時使用經(jīng)消毒的塑料桶帶水移苗，每日換水1/3，并在八腕幼體期加投金藻，數(shù)量為角毛藻的1/2，總投餌量不變，分早中晚3次投喂。其余操作同第6次育苗。

第8次育苗使用超濾海水在水泥池中進行，稱為大規(guī)模超濾海水育苗。幼體選優(yōu)和投餌同第7次育苗。整個育苗過程不換水，幼體入池時水位60 cm，通過添加新水稀釋幼體密度。入池7 d后，水位加至最高(130 cm)，此時幼體密度調(diào)整采用虹吸法將底部幼體虹吸至新水泥池或直接拋棄，依據(jù)幼體密度在原池中加入適量新水。在幼體發(fā)育至Ⅳ期八腕幼體時將水位降至50 cm，排水過程中往200目網(wǎng)箱中放入氣石充氣，防止幼體黏附在網(wǎng)箱上。

1.2.4 采苗與稚海膽培育

當(dāng)Ⅳ期八腕幼體占30%時投放采苗板。投放前采苗板用1.0×10-6的敵百蟲浸泡6 h以上，用干凈海水浸泡3次，每次30 min，再用海水沖洗后使用。在幼體未全部完成變態(tài)前，每日仍然需要投喂4×104～5×104cell/mL的單胞藻。幼體全部完成變態(tài)后采用流水培養(yǎng)，每天流水量為200%，有污物堆積時要進行局部吸污。每周按1.1.4.2方法對底棲硅藻進行施肥，維持底棲硅藻的繁殖與稚海膽生長同步。

1.2.5 中間培育

當(dāng)30%稚海膽發(fā)育至3 mm時，將采苗板連苗一起移至網(wǎng)箱中進行培育，投喂以江蘺、紫菜和石莼等大型海藻。網(wǎng)箱放置在20 m3的水泥池中，每周換水一次，每次1/3。

2 結(jié)果

2.1 親本的促熟及蓄養(yǎng)

種膽暫養(yǎng)兩周后，解剖觀察發(fā)現(xiàn)，大部分親本性腺飽滿，占比達(dá)到14%～16%。注射0.5 mol/L KCl后，親本排放率達(dá)到90%。通過鏡檢可觀察到：卵子外形飽滿呈圓形，精子活動能力強，受精率達(dá)到95%，孵化率達(dá)到85%。

6月份將促熟后的親本放置在溫度為20～22 ℃水體中培養(yǎng)，于8月和11月分別進行催產(chǎn)，50%的親本能成功排放卵子、精子。

2.2 浮游幼體的生長發(fā)育

在水溫28～29 ℃下，從受精卵發(fā)育至稚海膽最快只需13 d(見表1)。受精后，7 h孵化為棱柱幼體(見圖1a)，體長平均為135 μm，具有浮游能力；12 h發(fā)育至二腕幼體(見圖1b)，體長平均為206 μm，前側(cè)腕突出，此時可明顯看見胃，消化系統(tǒng)基本完善，可以進行攝食；1 d即將發(fā)育至四腕幼體(見圖1c)，體長平均為300 μm，前側(cè)腕伸長，可見口后腕突起；2 d時前側(cè)腕和口后腕伸長，四腕幼體形態(tài)發(fā)育成型(見圖1d)，體長平均為476 μm；4 d時左右兩側(cè)出現(xiàn)后背腕，代表發(fā)育至六腕幼體(見圖1e)，體長平均為779 μm；5 d時步入八腕幼體階段，體長平均為876 μm，根據(jù)形態(tài)可將八腕幼體細(xì)分為4個期，此時口前腕的出現(xiàn)代表發(fā)育至 Ⅰ 期八腕幼體(見圖1f)；6 d時出現(xiàn)前、后肩片，運動能力增強，此時是 Ⅱ 期八腕幼體(見圖1g)；7 d時，胃左側(cè)出現(xiàn)前庭復(fù)合體，代表著發(fā)育至Ⅲ期八腕幼體(見圖1h)；10 d時，前庭復(fù)合體增大擠壓了幼體原來的胃，幼體進入Ⅳ期八腕幼體(見圖1i)。

表1 紫海膽幼體發(fā)育過程Tab.1 Development of Heliocidaris crassispina

2.3 浮游幼體的變態(tài)

在12 d時，幼體管足伸出(見圖2a)，可附著在采苗板上進行變態(tài)(發(fā)育較好的幼體在1 d內(nèi)可完成變態(tài))；八個腕的表皮組織向基部收縮(見圖2b)；全部腕脫落，體呈半球形(見圖2c)；幼棘組織長出(見圖2d)；伸出5個管足，幼棘組織伸長(見圖2e)；多處棘伸出，大部分幼棘(棘末端分叉)長大成棘，完全變態(tài)成稚海膽，大小為500 μm左右，其后2～3 d出現(xiàn)亞里士多德提燈，俗稱口器(見圖2f、g、h)。

2.4 育苗效果

2019年5月25日—2019年9月15日共進行了6次育苗試驗。其中使用常規(guī)海水的都不能育成苗。前4次由于在六腕幼體期水質(zhì)較差，水體中原生動物大量滋生，幼體全部爛腕沉底死亡。第5次有幼體能發(fā)育至八腕幼體期，但維持1 d后也全部死亡(見表2)。第6次催產(chǎn)獲得1.08×106個受精卵，經(jīng)10 d培育后發(fā)育至Ⅳ期八腕幼體(見圖3)，其中大部分Ⅳ期八腕幼體經(jīng)3～4 d浮游后變態(tài)成稚海膽，稚海膽再經(jīng)50～60 d培育，共獲得2.5～8.48 mm的稚海膽2.51×104個，受精卵成苗率為2.30%(見表2)。

2020年6月17日—2020年8月15日又進行2次育苗試驗。第7次育苗催產(chǎn)獲得4.40×105個受精卵，由于在Ⅳ期八腕幼體時密度過大(未及時進行分苗)，加上投放采苗器時間過晚，最終獲得稚海膽約3 000個，受精卵成苗率為0.68%(見表2)。第8次育苗催產(chǎn)獲得1.34×107個受精卵，經(jīng)10 d 培育后發(fā)育至Ⅳ期八腕幼體(見圖4)，大部分Ⅳ期八腕幼體經(jīng)3～4 d浮游后變態(tài)成稚海膽，受精后68 d稚海膽總數(shù)為3.32×105個，受精卵成苗率為2.48%(見表2)。

表2 紫海膽育苗結(jié)果Tab.2 Results of breeding Heliocidaris crassispina

3 討論

目前我國可食用的海膽主要有中間球海膽、馬糞海膽(Hemiceutrotuspulcherrimu)、光棘球海膽(Strongylocentrotusnudus)、紫海膽和白棘三列海膽(Tripneustesgratilla)。前三者為冷水性海膽，后兩者為暖水性海膽。從20世紀(jì)80年代起，我國學(xué)者先后對這幾種海膽進行了人工繁育技術(shù)的研究并取得成功[11-15]。相較之下紫海膽幼體浮游期最短，可減少苗種培育工作強度，提高生產(chǎn)效率，具有較好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.1 親本促熟及蓄養(yǎng)

水溫與餌料是影響海膽性腺發(fā)育的主要環(huán)境因素[15]。李正良[16]的研究表明紫海膽在28 ℃下生長較好，丁玉龍等[17]的研究表明投喂海帶和貽貝能促進中間球海膽的性腺發(fā)育。本研究將親本培育水溫控制在28 ℃，并足量投喂以海帶和牡蠣，兩周后進行催產(chǎn)，其排放率較高(該結(jié)果與梁永成等[8]的相一致)，且經(jīng)促熟的親本的配子受精率和孵化率都較好，能夠解決野捕海膽中性腺發(fā)育不同步、受精率低和畸形卵多等問題，且催產(chǎn)后的親本經(jīng)蓄養(yǎng)還能繼續(xù)使用[6]。

紫海膽產(chǎn)卵量可達(dá)400萬～600萬個，少量親本即可滿足育苗生產(chǎn)的需求[18]。促熟的親本會在短期內(nèi)自然排放，造成浪費。本研究將促熟后的親本放置于20～22 ℃的水體中進行培養(yǎng)，育苗時注射KCl即可催產(chǎn)，能保證在8—11月獲得配子，不僅提高了育苗生產(chǎn)的效率，還能在反季節(jié)獲得配子。

3.2 幼體培育

紫海膽在高溫季節(jié)繁殖，育苗水體和微藻培養(yǎng)極易被原生動物污染。使用常規(guī)處理海水不能成功育苗，可能是因為海水中含有少量原生動物孢子，加上餌料質(zhì)控不嚴(yán)格會攜帶原生動物，導(dǎo)致在六腕幼體階段原生動物大量滋生。原生動物過多時發(fā)現(xiàn)幼體下沉進而大量死亡，究其原因可能是：1)原生動物會分泌有害物質(zhì)[19]，從而影響幼體的運動并毒害幼體；2)幼體誤食原生動物引起消化不良導(dǎo)致營養(yǎng)供給不足。即使第2～5次育苗中采取換水并嚴(yán)格控制微藻質(zhì)量，效果也不佳。使用紫外線消毒海水育苗，嚴(yán)格控制微藻質(zhì)量和密度，棄用被污染的藻液，幼體存活率有所改善，能完成整個育苗過程。使用超濾海水進行幼體培育獲得較好的效果，兩次幼體發(fā)育至八腕幼體的存活率都高于70%，相較于前人育苗結(jié)果[5-9]，存活率得到顯著提升。說明使用超濾海水能夠保證育苗水體的水質(zhì)，降低原生動物的污染，這是解決當(dāng)前我國近海海域水質(zhì)富營養(yǎng)化極易滋生原生動物的關(guān)鍵。

在前期育苗試驗中發(fā)現(xiàn)使用篩絹網(wǎng)選優(yōu)和大量換水極易造成幼體腕的損傷，從而導(dǎo)致幼體大量死亡。而在小規(guī)模超濾海水育苗中改用塑料桶帶水移苗和減少換水量能保證幼體較高的存活率。在實驗室進行的小水體幼體培育試驗表明，在使用超濾海水且不換水、無增氧條件下，紫海膽四腕幼體可在1000 mL的燒杯中發(fā)育至稚海膽，而使用常規(guī)海水的四腕幼體在3 d后死亡。因此在大規(guī)模超濾海水育苗試驗中，本研究沒有進行換水。不更換海水可以減少工作量，減少餌料流失，繼而降低生產(chǎn)成本；同時也避免了對幼體的損傷，有助于提高存活率。但是隨著幼體增長，需要添加新水來調(diào)節(jié)密度。種群密度過大會抑制幼體生長發(fā)育，浮游能力也會受到影響，個體間腕容易交叉糾纏導(dǎo)致死亡[20]。少量多次投喂餌料有助于餌料密度保持平穩(wěn)，減少有害物質(zhì)的產(chǎn)生[21]。

3.3 幼體的附著和變態(tài)

本研究發(fā)現(xiàn)紫海膽幼體變態(tài)速度快慢不一，相當(dāng)一部分幼體在采苗板投放1周后還浮游在水中。這部分浮游的幼蟲胃面積較小，營養(yǎng)積累尚不充分，尚不具備變態(tài)的能力。這表明浮游期的管理尚需改進，要著重加強幼體營養(yǎng)供給。席世改[22]的報道表明，以金藻和角毛藻混合(1∶1)投喂的幼體的發(fā)育速度略優(yōu)于只投喂角毛藻的。但本研究在八腕幼體階段加入金藻的投喂，發(fā)現(xiàn)幼體發(fā)育速度差異不大。Castilla等[23]的研究表明擬球海膽(Paracentrotuslividus)幼體攝食含高碳水化合物的紅胞藻(Rhodomonassp.)可提高自身脂肪含量，有助于變態(tài)順利進行[24]。在將來紫海膽育苗中可嘗試投喂含高碳水化合物的餌料。

雖然采苗時本研究將水位降至50 cm，但是最上層波紋板與水面還有15 cm的水層，上層幼體接觸采苗板機會較少，這可能也影響了幼體的變態(tài)。育苗車間光線分布不均勻也可能是幼體聚集在水面上層遲遲不變態(tài)的原因之一。鮑育苗池深度適中便于遮光，適宜進行海膽采苗。

3.4 稚海膽培育期間應(yīng)注意的問題

紫海膽幼體變態(tài)過程不能攝食，能量供給完全依賴浮游期的營養(yǎng)積累。變態(tài)后第2～3 d出現(xiàn)口器并開始攝食。這時口器咀嚼力弱且消化能力和運動能力較差，因此采苗板上的底棲硅藻為稚海膽的最適開口餌料。如果稚海膽不能獲得充足的餌料供給會發(fā)生死亡，因此稚海膽培育過程中要注意觀察稚海膽的攝食情況和波紋板上底棲硅藻的覆蓋程度。通過施肥來維持底棲硅藻生長，且后期可以補充新的采苗板增加底棲硅藻的供給，并輔助投喂以螺旋藻粉或磨碎的江蘺。稚海膽殼徑發(fā)育至3 mm后，口器咀嚼力增強，可以附著在大型海藻上進行攝食。此時的底棲硅藻營養(yǎng)難以滿足稚海膽的發(fā)育，可連同板一起移入網(wǎng)箱中養(yǎng)殖，投喂以江蘺、紫菜和海帶等大型藻類。

在后3次稚海膽中間培育過程中都出現(xiàn)個體差異較大的現(xiàn)象，同一批稚海膽大個體殼徑可達(dá)2 cm，小個體殼徑才3 mm左右。這可能是由變態(tài)快慢造成的，也可能是稚海膽營養(yǎng)積累差異造成的。將來可將變態(tài)速度較快和生長速度快的個體收集培養(yǎng)，作為下一代的親本使用，進行速長優(yōu)良品質(zhì)的培育。