唐雪，彭永佳，陳亞曦，龔靜山，朱進，羅燕，江長思

直腸癌(rectal cancer，RC)是最為常見惡性腫瘤之一，根據(jù)美國2017年癌癥報告，結(jié)直腸癌占男性和女性惡性腫瘤9%和8%，具有較高的病死率，為男性和女性癌癥相關(guān)死亡的第二位和第三位[1]。近年來，隨著對直腸癌發(fā)病機制和分子特征的深入研究，認(rèn)識到直腸癌患者KRAS基因狀態(tài)與抗表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)單抗療效具有相關(guān)性[2]。KRAS基因突變可導(dǎo)致EGFR信號通路持續(xù)激活，加速腫瘤細胞增殖，從而使抗EGFR藥物治療無效[3-5]，但是抗EGFR單抗治療對KRAS基因野生型的RC有效[6]，因此，RC的KRAS基因表型對臨床腫瘤患者的個性化治療有重要意義。目前臨床上對KRAS基因狀態(tài)的明確主要依賴組織標(biāo)本的免疫組化或基因分析，組織標(biāo)本獲得主要通過有創(chuàng)方法獲得，而且基因檢測費時、價格昂貴。近年來，伴隨計算機技術(shù)和人工智能算法的進步發(fā)展起來的影像組學(xué)在疾病的檢出、分類和定量評估取得一定的進展，成為研究熱點[7-8]。有研究表明，基于MRI或CT的影像組學(xué)對RC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和治療反應(yīng)能達到較高的診斷效能[9-11]。本研究旨在評估多參數(shù)MRI對于RC的KRAS基因突變的預(yù)測效能，從而建立無創(chuàng)、便捷、在體評價直腸癌KRAS基因突變的影像學(xué)生物學(xué)標(biāo)記，為臨床治療方案選擇和個性化治療提供一種在體無創(chuàng)可反復(fù)獲得的方便的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究經(jīng)過暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：LL-KT-201801118)，免除受試者知情同意。在醫(yī)院信息系統(tǒng)(hospital information system，HIS)中檢索 2019年 4月至2010年12月間160例經(jīng)手術(shù)病理證實RC且術(shù)前3個月內(nèi)行直腸MRI檢查患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前在我院行MRI檢查，且診斷為直腸癌；(2)在我院行手術(shù)治療，且術(shù)后診斷為直腸癌、有明確病理分期和KRAS基因表型檢測結(jié)果；(3)檢查前腸道準(zhǔn)備充分；(4)在術(shù)前MRI與手術(shù)間未接受放療、化療等任何治療手段。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)MRI檢查前接受放化療等治療后的患者；(2)腸道準(zhǔn)備不充分、MR圖像上病灶顯示不明顯。最后104例納入本研究，其中男63例，女41例，年齡(60.68±12.74)歲。

1.2 MRI檢查

檢查前一晚囑患者少吃產(chǎn)渣食物，檢查當(dāng)日禁食，檢查前2 h開始分次緩慢口服20%甘露醇2000 mL(250 mL加1750 mL水)，患者排便2～3次后開始檢查，檢查前10 min肌注654-2(10 mg)。全部患者在3.0 T MR系統(tǒng)(Magnetom Skyra，Siemens Healthcare，Erlangen，德國)采用包含直腸軸位和矢狀位高分辨T2WI和直腸軸位DWI和盆腔的動態(tài)增強的直腸MRI方案。高分辨率T2加權(quán)成像參數(shù)如下：重復(fù)時間(TR)3000～4200 ms；回波時間(TE)83～101 ms；層厚 3 mm；視野 (FOV)220～280 mm；矩陣，(381×448)～(435×512)。DWI采用rosolve技術(shù)獲得高空間分辨率擴散加權(quán)圖像，參數(shù)：TR 5800～7030 ms；TE 61 ms；層厚 3 mm；FOV 220 mm×230 mm；矩陣116×116；b值分別為0和1000 s/mm2。ADC圖采用單指數(shù)模型由MRI系統(tǒng)自動根據(jù)0和1000 s/mm2兩個b值生成。使用釓噴酸葡胺對比劑(Gadopentetate Dimeglumine Injection，生產(chǎn)廠家：北京北陸藥業(yè)股份有限公司)進行直腸軸位T1 vibe多期動態(tài)增強序列，參數(shù)：TR 4.2 ms；TE 2 ms；翻轉(zhuǎn)角12°；層厚2 mm。

1.3 組織病理學(xué)分型

腫瘤的手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)常規(guī)病理學(xué)檢查處理后，制作成石蠟包埋組織樣品，切片后取蠟塊中部含腫瘤細胞部分立即進行KRAS基因突變檢測。

1.4 腫瘤分割和影像組學(xué)特征提取

將DICOM格式圖像從PACS下載到PC。由1名有經(jīng)驗的放射科醫(yī)生采用開源的ITK-SNAP手工逐層勾畫RC病灶，獲得全腫瘤的感興趣區(qū)(region of interest，ROI)。勾畫過程中，以DWI為參照，根據(jù)病灶的邊界，分別在直腸軸位高分辨T2WI、動態(tài)增強動脈期T1WI(contrast-enhanced T1WI，CE-TIWI)和ADC圖上畫出腫瘤ROI。采用開源的Pyradiomics根據(jù)原始圖像和經(jīng)過ITK-SNAP處理后的圖像提取RC的107個影像組學(xué)特征，包括14個形態(tài)特征(shape-based)，14個灰度相關(guān)矩陣特征(gray level dependence matrix，GLDM)，24個灰度共生矩陣特征(gray level co-occurrence matrix，GLCM)，18 個一階統(tǒng)計特征(first order statistics)，16個灰度游程矩陣特征(gray level run length matrix，GLRLM)，16個灰度區(qū)域大小矩陣特征(gray level size zone matrix，GLSZM)，5個鄰域灰度差矩陣特征(neighborhood gray-tone difference matrix，NGTDM)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件和R語言4.2.2版本(http://www.Rproject.org)進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用t檢驗、χ2檢驗或Mann-Whitney秩和檢驗分析性別、年齡、CEA、CA125、CA199、EMVI、T分期等臨床病理特征和影像組學(xué)特征與KRAS基因突變的相關(guān)性。將104例患者按0.7∶0.3的比例隨機分為訓(xùn)練集和驗證集。為消除不同特征尺度的影響，在訓(xùn)練集和驗證集分別對特征進行歸一化(normalization)。在訓(xùn)練集中對單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的變量采用LASSO(least absolute shrinkage and selection operator)回歸算法和5折疊交叉驗證進一步特征選擇和構(gòu)建影像組學(xué)信號(radiomics signatue)預(yù)測直腸癌KRAS基因突變。影像組學(xué)信號在訓(xùn)練集和驗證集中對KRAS基因突變的預(yù)測效能采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線下面積(area under the curve，AUC)，并采用DeLong法進行比較。詳細過程見圖1。

圖1 直腸癌MRI特征提取及構(gòu)建KRAS基因突變預(yù)測模型Fig.1 MRI feature extraction of rectal cancer and construction of KRAS gene mutation prediction model.

2 結(jié)果

2.1 臨床病理特征

104例直腸癌患者中，檢測存在KRAS突變(突變型組)有62例(59.6%)，其中女22例、男40例；KRAS為野生型(野生型組)42例(40.4%)，其中女19例、男23例。KRAS突變型組和野生型組臨床病理特征見表1。兩組間臨床病理特征(年齡、性別、病理學(xué)T分期、EMVI、CEA、CA125、CA19-9)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 104例直腸癌患者臨床特征Tab.1 Clinicopathological chracteristics of the 104 patients with RC

2.2 影像組學(xué)信號的建立和預(yù)測模型的驗證

321個影像組學(xué)特征經(jīng)單因素分析發(fā)現(xiàn)有16個特征有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05；表2)；在訓(xùn)練集中LASSO回歸篩選出7個特征λ系數(shù)(壓縮系數(shù))非零特征(包含4個CE-T1WI和2個ADC圖的特征；表3)。構(gòu)建的影像組學(xué)信號KRAS突變型高于野生型(1.19±0.63與0.53±0.53，t=3.94，P＜0.001)(圖2)。在訓(xùn)練集和驗證集的ROC分析中，AUC分別為0.81(95%CI：0.70～0.92)、0.77(95%CI：0.63～0.91)，分別精確為 0.78、0.71，敏感度均為0.76，特異度分別為0.83、0.67，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.60)(圖3)；其中ADC特征中的一階偏度的λ系數(shù)最大為3.36。

圖2 不同KRAS突變狀態(tài)的直腸癌患者的MRI圖像。圖2A～D：男，51歲，KRAS突變型，A、C為CE-T1WI像，B、D為ADC圖像；E～H：男，60歲，KRAS野生型，E、G為CE-T1WI圖像，F(xiàn)、H為DWI圖像Fig.2 MRI images of rectal cancer patients with different KRAS mutation status.Figure A—D:Male,51 years old,KRAS mutant.Figure A,C are CE-T1WI images.Figure B,D are ADC images.Figure E—H:Male,60 years old,KRAS wild type.Figure E,G are CE-T1WI images.Figure F,H are DWI images.

圖3 影像組學(xué)信號在訓(xùn)練集與驗證集中預(yù)測KRAS基因突變的ROC曲線。訓(xùn)練集曲線下面積(AUC)為0.81，驗證集AUC為0.77Fig.3 ROC curve of radiomics signature for prediction of KRAS gene mutation in training and validation sets.ROC under training sets is 0.81,ROC under validation sets is 0.77.

表2 單因素分析篩選的16個有統(tǒng)計學(xué)意義影像組學(xué)特征Tab.2 Sixteen statistically significant imaging features selected by univariate analysis

表3 在訓(xùn)練集中LASSO回歸篩選的7個λ系數(shù)非零影像組學(xué)特征和其臨床意義Tab.3 Seven radiomic features with λ coefficiences other than zero selected by LASSO regression for prediction of KRAS gene mutation and their clinical meanings

3 討論

本研究中，檢測直腸癌患者KRAS突變約59.6%，經(jīng)過單因素分析結(jié)果顯示直腸癌KRAS突變狀態(tài)與部分直腸癌CE-T1WI及ADC特征相關(guān)，其中包括10個CE-T1WI特征、6個ADC特征。Xu等[12]和Yeo等[13]研究結(jié)果也表明，擴散加權(quán)磁共振成像和動態(tài)對比增強成像的MR影像特征與直腸癌的KRAS突變狀態(tài)相關(guān)。年齡、性別對于直腸癌KRAS突變的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與姜雪琴等[14]的研究結(jié)果一致；此外，病理學(xué)T分期、EMVI、CEA、CA125、CA19-9等臨床特征對于直腸癌KRAS突變的差異亦均無統(tǒng)計學(xué)意義。

經(jīng)過單因素分析篩選出來的16個有統(tǒng)計學(xué)意義的特征再經(jīng)過LASSO回歸降維，7個特征λ系數(shù)不為0，包含5個CE-T1WI紋理特征(灰度大區(qū)域分布、灰度尺寸區(qū)域不均勻標(biāo)準(zhǔn)化、灰度區(qū)域強度差異、相鄰灰度色調(diào)差異矩陣強度、形狀短軸長度)和2個ADC圖紋理特征(一階偏度、形狀伸長率)，其中突變型KRAS患者的CE-T1WI紋理特征灰度大區(qū)域分布、灰度區(qū)域強度差異、形狀短軸長度和ADC圖紋理特征形狀伸長率均高于野生型KRAS患者，而CE-T1WI紋理特征灰度尺寸區(qū)域不均勻標(biāo)準(zhǔn)化、相鄰灰度色調(diào)差異矩陣強度和ADC圖紋理特征一階偏度則低于野生型KRAS患者，國內(nèi)也有研究結(jié)果顯示部分形態(tài)特征在KRAS突變狀態(tài)方面表現(xiàn)出顯著差異[14-15]。本研究的結(jié)果與Cui等[16]的研究結(jié)果均顯示在KRAS突變與高階放射學(xué)特征形狀短軸長度、灰度區(qū)域強度差異和灰度大區(qū)域的值越高表示更多的腫瘤異質(zhì)性和更高的KRAS突變風(fēng)險。

進一步通過測試集和驗證集進行內(nèi)部驗證預(yù)測KRAS突變，獲得測試集和驗證集的ROC曲線，AUC值分別為0.81、0.77，且測試集和驗證集的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也表明了本研究所構(gòu)建的預(yù)測模型具有可靠性和可重復(fù)性。7個與KRAS突變相關(guān)紋理特征中的ADC紋理特征一階偏度的λ系數(shù)最高為3.36，對影像組學(xué)信號貢獻最大。突變型KRAS患者的ADC特征的一階偏度低于野生型，雖然KRAS突變型和野生型的RC的ADC值均為正偏態(tài)，而且突變型的偏態(tài)值低于野生型，但歸一化值突變型高于野生型，說明相對野生型，突變型偏度較高RC更多，即腫瘤細胞更趨向不均勻。作為可以在體觀察和定量評價水分子擴散狀態(tài)的MR重要成像技術(shù)，DWI在病變檢出、良惡性腫瘤鑒別及治療反應(yīng)評估起著重要作用。由于人體內(nèi)水分子擴散是非高斯分布，基于多指數(shù)模型DWI的參數(shù)(如DKI或IVIM)或ADC值組織直方圖特征在預(yù)測RC的KRAS突變有較高的診斷價值[12，17]。有研究表明KRAS突變的腫瘤組織的ADC值更低，這是可能是因為KRAS圖像與血管生成的速率及腫瘤血管化之間可能有關(guān)，高度血管化的腫瘤通常更具侵襲性，導(dǎo)致腫瘤生長更快，并具有更高的轉(zhuǎn)移潛力，導(dǎo)致腫瘤組織的ADC值降低[18-19]。本研究結(jié)果與Cui等[16]采用組織直方圖觀察ADC值分布特征表明KRAS突變型RC的ADC值的四分位數(shù)和中位數(shù)均低于野生型。另外一個λ系數(shù)較高的特征是灰度大區(qū)域分布，主要反映ROI的紋理粗糙程度，值越高，說明紋理越粗糙。本組資料觀察到，KRAS突變型的RC的CE-T1WI上灰度大區(qū)域分布高于野生型，說明KRAS突變型RC強化更不均勻。進一步采用LASSO回歸特征選擇，基于CE-T1WI的5個特征和ADC的2個特征的λ系數(shù)不為0，并以此構(gòu)建影像組學(xué)信號KRAS突變型高于野生型(1.19±0.63與0.53±0.53，t=3.94，P＜0.001)，預(yù)測KRAS基因的AUC在訓(xùn)練集和驗證集分別為0.81、0.77，顯示預(yù)測性能良好。

本研究仍存在以下幾點不足：首先，本研究是一項回顧性研究，入選患者為手術(shù)治療的患者，因此，存在一定的病例選擇偏倚；其次，本研究樣本量較小，而且為單中心的研究，沒有在外部驗證集中檢驗?zāi)Ｐ偷姆夯芰?；再次，由于采用手工勾畫腫瘤ROI，部分序列圖像上病灶較難顯示，從而導(dǎo)致病灶勾畫欠精準(zhǔn)；另外，目前的影像組學(xué)特征有一定的局限性，可能不包含與KRAS基因表型相關(guān)的重要的數(shù)字特征。近年來進行影像學(xué)研究的深度學(xué)習(xí)預(yù)測模型，通過神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法探索數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像與疾病的臨床表型的相關(guān)性有望克服這一缺陷[20-21]。

總之，本項研究初步通過影像組學(xué)深度挖掘多參數(shù)MRI特征，觀察到多個組學(xué)特征與RC的KRAS基因表型具有相關(guān)性，有助于為KRAS基因突變的預(yù)測提供無創(chuàng)的生物學(xué)標(biāo)記。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。