孟童瑤,李素艷,鄒榮松,余克非,付冰妍,揭 陽
(1. 北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,北京 100083;2. 國家林業(yè)和草原局 鹽堿地研究中心,北京 100091;3. 中國林業(yè)科學(xué)研究院 天津林業(yè)科學(xué)研究所,天津 300270)
城市園林綠化事業(yè)的快速發(fā)展導(dǎo)致園林廢棄物的數(shù)量日益增多[1]。堆肥已成為園林廢棄物資源化利用的主要方式之一[2?5]。園林廢棄物中的木本植物殘?bào)w存在大量難降解的木質(zhì)素。這些木質(zhì)素溶解性差,沒有任何易被水解的鍵,分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜且不規(guī)則,含有各種穩(wěn)定的復(fù)雜鍵型,微生物及其分泌的酶不易與之結(jié)合[6]。這些木質(zhì)素還包裹著纖維素,即使微生物可分解單獨(dú)存在的纖維素,但細(xì)胞壁中木質(zhì)素對纖維素起到保護(hù)作用,纖維素的降解仍受到限制[7?8],嚴(yán)重影響堆肥進(jìn)程,因此促進(jìn)木質(zhì)素降解是加快堆肥進(jìn)程和提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)[9]。自然界中的真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落可通過產(chǎn)生分解木質(zhì)素的酶系統(tǒng)(漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶)將木質(zhì)素完全降解,且大多數(shù)真菌降解效果強(qiáng)于細(xì)菌[6,10]。堆肥中添加微生物菌劑可顯著提高木質(zhì)素降解率,加快堆肥進(jìn)程[8,11]。YU等[12]通過二次回歸正交設(shè)計(jì)研制出了一種園林廢棄物專用復(fù)合菌劑,其木質(zhì)素降解能力強(qiáng)于有效微生物復(fù)合菌(EM菌)。何慧中等[13]開發(fā)出一種復(fù)合功能菌劑,添加到桉樹Eucalyptus皮堆肥中,木質(zhì)素降解效果顯著,與對照相比木質(zhì)素含量下降了78.78%。目前,有關(guān)木質(zhì)素降解的菌劑研究多集中在液體菌劑,但液體菌劑存在生產(chǎn)工序復(fù)雜,易污染,易失活,不便于保存等缺點(diǎn)。因此,有必要將木質(zhì)素降解菌制成固體菌劑,彌補(bǔ)液體菌劑的不足。微生物固定化技術(shù)是指通過物理或化學(xué)的手段將游離的微生物限定在一定的空間區(qū)域,保持其生物活性并能反復(fù)利用的方法[14]。將菌株運(yùn)用固定化方式制成的固體菌劑,具有生產(chǎn)成本低,耐儲(chǔ)存,不易失活,便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn),有利于菌劑在更大范圍內(nèi)推廣和應(yīng)用[15]。然而,固體菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量受多種因素影響,如接菌量、保護(hù)劑濃度和含水率可直接影響菌劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性和應(yīng)用效果,而且國內(nèi)外關(guān)于木質(zhì)素降解菌固定化的研究尚不充分,有關(guān)園林廢棄物堆肥的報(bào)道更為鮮見。鑒于此,本研究將1株木質(zhì)素降解菌通過固定化的方式制成固體菌劑,以有效活菌數(shù)為評價(jià)指標(biāo),對菌劑制作過程中的主要影響因素進(jìn)行優(yōu)化,再通過正交試驗(yàn)獲得最佳固體菌劑的制備條件,將其應(yīng)用到園林廢棄物堆肥中進(jìn)行效果檢驗(yàn),以期為該類菌劑的研制與應(yīng)用提供理論依據(jù)。
菌種為曲霉屬Aspergillussp.真菌No.11[1],目前保存于北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院土壤生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室。堆肥原料來源于北京植物園,主要為花草樹木的人工修剪物和自然生長產(chǎn)生的枯枝落葉,粉碎成1~2 cm粒徑。培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。載體與保護(hù)劑:通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定生物質(zhì)炭和米糠為固定化載體,海藻糖為保護(hù)劑,載體混合質(zhì)量比為1∶1。
1.2.1 種子液的制備 將4 ℃保存的菌株No.11接種到PDA培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)3 d完成活化。將活化后的菌株No.11挑取至裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的搖瓶中,置于28 ℃、200 r·min?1的搖床中培養(yǎng)48 h(對數(shù)生長期末)獲得種子液備用。
1.2.2 單因素優(yōu)化試驗(yàn) 接菌量試驗(yàn):按照載體質(zhì)量的5%、10%、15%、20%和25%接種種子液,調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8,攪拌均勻,28 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干,在室溫下干燥密封保存30 d后,測定有效活菌數(shù)。
保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)試驗(yàn):種子液中分別添加體積分?jǐn)?shù)為0、4%、8%、12%、16%和20%的保護(hù)劑,按載體質(zhì)量的10%接種到載體中,調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8,混勻后,28 ℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后放在40 ℃烘箱中完全烘干,在室溫下干燥密封保存30 d后,測定有效活菌數(shù)。
含水率試驗(yàn):向載體中接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的種子液,調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8,混合均勻,28 ℃培養(yǎng)48 h之后,放在40 ℃烘箱中烘至含水率為5%、10%、15%、20%和25%,在室溫下干燥密封保存30 d后,測定有效活菌數(shù)。
1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)1.2.2節(jié)試驗(yàn)結(jié)果確定優(yōu)化范圍,其中接菌量為5%、10%、15%,保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)為0、4%、8%,含水率為10%、15%、20%,進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。具體方案見表1。根據(jù)表1,向載體中接種相應(yīng)水平的種子液和保護(hù)劑,調(diào)節(jié)料水質(zhì)量比為1.0∶0.8,混合均勻,28 ℃培養(yǎng)48 h,之后放在40 ℃烘箱中烘至該處理對應(yīng)的含水率。將制備好的固體菌劑在室溫環(huán)境下干燥密封保存30 d,測定有效活菌數(shù),確定最佳菌劑的制備條件。
1.2.4 固體菌劑堆肥效果驗(yàn)證 堆肥模擬試驗(yàn)。將粉碎后的園林廢棄物分別裝入500 mL錐形瓶,裝80 g·瓶?1,調(diào)節(jié)含水率達(dá)60%,共4組處理,分別為不添加菌劑(ck)、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%市售EM菌劑(T1)、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%自制固體菌劑(T2)、添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%自制固體菌劑(T3)。各組處理3次重復(fù)。攪拌均勻后用8層紗布封好瓶口,置于恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。為模擬堆肥過程中的升溫、高溫和降溫階段,彌補(bǔ)堆肥模擬試驗(yàn)中因堆體較小,無法自主升溫的缺陷,人工進(jìn)行培養(yǎng)箱溫度的調(diào)節(jié):溫度從25 ℃逐漸上升至50 ℃,再逐漸降至30 ℃。各階段經(jīng)歷時(shí)間分別為5、30、5 d。
樣品采集。采集第1、8、16、24、32、40 天的堆肥樣品鮮樣1 g,測定木質(zhì)素降解相關(guān)酶的酶活力;采集第1 天和第40 天堆肥樣品測定pH、電導(dǎo)率(EC)、D(465)/D(665)[樣品濾液在465 nm處吸光度D(465)和665 nm處吸光度D(665)的比值]、種子發(fā)芽指數(shù)(IG)、木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)等指標(biāo)。
木質(zhì)素降解相關(guān)酶活力測定。漆酶、錳過氧化物酶和木素過氧化物酶活力測定參照田林雙[16]的木質(zhì)素降解相關(guān)酶類測定標(biāo)準(zhǔn)方法。
堆肥腐熟指標(biāo)測定。pH和EC測定:稱取待測樣品5 g,置于100 mL塑料瓶中,加入50 mL蒸餾水,200 r·min?1振蕩1 h,過濾其上清液,用pH 400防水型筆式pH計(jì)和EC 400防水型筆式電導(dǎo)率/TDS/鹽度計(jì)分別測定各樣品的pH和EC;樣品濾液在465 nm處吸光度D(465)和665 nm處吸光度D(665)測定:用UV-6 100紫外可見分光光度計(jì) (上海元析儀器有限公司)測定樣品濾液在465 nm處吸光度D(465)和665 nm處吸光度D(665);IG測定:取5 g鮮樣置于100 mL塑料瓶中,加入50 mL蒸餾水,振蕩1 h后獲取上清液,將2張濾紙平鋪到直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中,濾紙上加入5 mL上清液,以蒸餾水為空白對照,播撒白菜Brassica chinensis種子20?!っ?1,置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后記錄發(fā)芽率和根長。計(jì)算IG,IG=(上清液處理的發(fā)芽率×根長)/(空白組的發(fā)芽率×根長)×100%。木質(zhì)素、纖維素降解率測定:木質(zhì)素、纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別用硝酸-乙醇法和72%硫酸法進(jìn)行測定[17]。
1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用Excel 2010 和SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
接菌量可直接影響固體菌劑的質(zhì)量。接菌量過少會(huì)延長菌株的生長停滯期,過大會(huì)增加生產(chǎn)成本,也會(huì)增強(qiáng)微生物之間的競爭作用[18]。由圖1A可知:固體菌劑中的有效活菌數(shù)隨接菌量的增加呈先增加后減少的趨勢,接菌量為10%時(shí)有效活菌數(shù)最高,達(dá)3.73×1010CFU·g?1;其次是接菌量為5%和15%時(shí),有效活菌數(shù)達(dá)2.50×1010CFU·g?1以上;當(dāng)接菌量超過15%時(shí),菌劑中的有效活菌數(shù)逐漸降低,低于2.50×1010CFU·g?1。因此,選用接菌量5%、10%和15%作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。
微生物菌劑中添加一定量的保護(hù)劑可以增強(qiáng)其耐儲(chǔ)藏性和穩(wěn)定性,能直接影響菌劑的產(chǎn)品質(zhì)量與應(yīng)用效果[19]。由圖1B可看出:當(dāng)保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)為8%時(shí),活菌數(shù)最高達(dá)7.10×1010CFU·g?1,保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)<8%時(shí),有效活菌數(shù)隨保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)升高而增多;當(dāng)保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)>8%后,隨著保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)的升高,有效活菌數(shù)顯著(P<0.05)降低,低于4.00×1010CFU·g?1。因此,選用0、4%和8%作為正交試驗(yàn)的3個(gè)水平。
含水率對固體菌劑的儲(chǔ)存有很大影響。含水率過高容易滋生雜菌,使固體菌劑受到污染影響應(yīng)用效果,含水率過低不利于菌株的生存,一段時(shí)間后有效活菌數(shù)會(huì)大幅度降低[20]。由圖1C可知:隨著含水率的提高,固體菌劑中有效活菌數(shù)呈先升高后降低的趨勢,含水率為15%時(shí)有效活菌數(shù)最高,可達(dá)5.17×1010CFU·g?1;含水率為10%和20%時(shí),固體菌劑中有效活菌數(shù)可達(dá)4.00×1010CFU·g?1以上;含水率為5%和25%時(shí),固體菌劑的儲(chǔ)存效果最差,有效活菌數(shù)僅為2.00×1010CFU·g?1左右。綜上可知,當(dāng)固體菌劑含水率為10%~20%時(shí),有效活菌數(shù)較高,因此,選用10%、15%、20%作為正交試驗(yàn)中的3個(gè)水平。
圖1 接菌量、保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)和含水率對有效活菌數(shù)的影響Figure 1 Effect of inoculation amount, protective agent concentration and water content on living bacteria count
由表2可知:在接菌量、保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)和含水率等3種因素中,影響程度最大的是接菌量,其次是含水率,影響程度最小的是保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)。固體菌劑制備的最佳配方為A2B3C2,即:接菌量10%、保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)8%、含水率15%。該條件下,菌劑中有效活菌數(shù)達(dá) 1.26×1011CFU·g?1,符合GB 20287?2006《農(nóng)用微生物菌劑》的標(biāo)準(zhǔn)(>0.50×108CFU·g?1)。
表2 正交試驗(yàn)的極差分析Table 2 Range analysis of orthogonal test
2.3.1 堆肥腐熟指標(biāo) pH是評價(jià)堆肥腐熟程度的指標(biāo)之一。堆肥腐熟后,pH一般為7.0~8.5[21]。由表3可知:堆肥結(jié)束時(shí)各處理pH均在8.0左右,符合NY 525?2002《有機(jī)肥料》標(biāo)準(zhǔn)。
EC可以表示堆肥中可溶性總鹽的含量,其大小能影響植物的生長,EC過高的堆肥產(chǎn)品可以影響土壤理化性質(zhì),使植物生長受到毒害。EC小于4.00 mS·cm?1,表明堆肥已達(dá)到腐熟,對植物生長無毒害[22]。由表3可知:ck處理EC為0.35 mS·cm?1,各處理的EC相近,均小于4.00 mS· cm?1,在腐熟標(biāo)準(zhǔn)之內(nèi)。
表3 堆肥腐熟指標(biāo)測定結(jié)果Table 3 Determination results of composting maturity index
D(465)/D(665)能反映出胡敏酸分子的穩(wěn)定程度,D(465)/D(665)較大說明胡敏酸相對穩(wěn)定,較小說明胡敏酸結(jié)構(gòu)簡單,因此可用來分析評價(jià)堆肥的腐殖化作用大小[9]。由表3可知:堆肥結(jié)束時(shí),各處理的D(465)/D(665)均為6.0左右。
IG是判斷堆肥產(chǎn)品是否腐熟的生物學(xué)指標(biāo)。堆肥產(chǎn)品未腐熟時(shí)會(huì)產(chǎn)生對植物生長有毒有害的物質(zhì),抑制植物的生長。一般情況下,當(dāng)IG大于80%就可認(rèn)為產(chǎn)品已達(dá)到腐熟[23]。由表3可知:各處理的IG均超過80%,堆肥產(chǎn)品對植物無毒。
綜上可知,堆肥進(jìn)行40 d后,各處理的pH和EC均達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)且無顯著差異,但添加菌劑后可以縮短堆肥腐熟的時(shí)間[24]。各處理的D(465)/D(665)均為6.0左右,說明其縮合度和芳構(gòu)化仍很低,這也從另一方面表明腐殖質(zhì)活性較強(qiáng)[9]。各處理的IG均超過80%,這與ZHANG等[25]測定的園林廢棄物堆肥產(chǎn)品IG一致。
2.3.2 木質(zhì)素酶活力測定結(jié)果 堆肥過程中微生物會(huì)分泌各種酶,從而將木質(zhì)素類大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化成腐殖質(zhì)等促進(jìn)植物生長的物質(zhì)[26]。與木質(zhì)素降解相關(guān)的生物酶主要包括漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶[27]。
在堆肥過程中,漆酶對木質(zhì)素的降解起著非常重要的作用,研究漆酶活力的變化對評價(jià)堆肥進(jìn)程及微生物活動(dòng)強(qiáng)度至關(guān)重要[28]。由圖2A可看出:除T3外,其余處理漆酶活力在初始階段相差不大,呈現(xiàn)先降后升趨勢,與陳建軍等[29]研究結(jié)果一致??赡苁嵌逊什牧现心承┬》肿游镔|(zhì)先降解,之后微生物再降解木質(zhì)素類難降解的大分子物質(zhì)。T3酶活力先升后降,可能與其開始微生物數(shù)量較多,分解速率較高有關(guān)。堆肥進(jìn)行到24 d時(shí),T1、T2和T3漆酶活力遠(yuǎn)超過ck,說明添加自制菌劑與市售菌劑都可大大增強(qiáng)堆肥中微生物的活動(dòng)強(qiáng)度,隨著微生物菌落增多,產(chǎn)酶能力也增加。第24 天之后,T3酶活力下降,ck酶活力上升,T1與T2酶活力變化不大,且大小相當(dāng),均達(dá)80 U·L?1(1 U=16.67 nkat)左右。菌株No.11的研究結(jié)果也顯示:與可高效降解木質(zhì)素的黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium相比,此菌株有更強(qiáng)的產(chǎn)酶能力,也進(jìn)一步說明自制固體菌劑有更大的應(yīng)用潛力。
錳過氧化物酶是一種酚氧化物酶,可與其他酶共同作用提高對木質(zhì)素的降解作用[10]。由圖2B可看出:添加菌劑的處理組錳過氧化物酶活力均高于ck,說明添加菌劑可以提高堆肥中錳過氧化物酶的酶活力。堆肥初始階段,所有處理組的錳過氧化物酶活力均出現(xiàn)先降后升趨勢,可能與堆肥中的氮素含量有關(guān),氮素含量會(huì)影響微生物分泌錳過氧化物酶[27]。第8 天后所有處理組酶活力又出現(xiàn)了上升趨勢,說明微生物代謝活動(dòng)增強(qiáng),開始分泌錳過氧化物酶,T2與T3在第16天時(shí)達(dá)到峰值,T1的峰值出現(xiàn)在第24天左右。這表明添加自制固體菌劑后菌株可較快適應(yīng)環(huán)境分泌錳過氧化物酶。有研究表明:錳過氧化物酶在限氮高錳培養(yǎng)基中產(chǎn)量較高[10],因此制備此類菌劑時(shí),可通過優(yōu)化含氮量提高產(chǎn)錳過氧化物酶的能力。
木質(zhì)素過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的過氧化物酶,可直接與芳香底物發(fā)生反應(yīng),也可通過氧化低分子量的中介體而間接地發(fā)揮作用[30]。由圖2C可看出:所有處理組木質(zhì)素過氧化物酶活力均呈現(xiàn)先升后降趨勢,添加菌劑的處理組酶活力的峰值出現(xiàn)時(shí)間均早于ck,且峰值高于ck,表明加入菌劑后可明顯提高微生物分泌木質(zhì)素過氧化酶的速率[31]。堆肥的后期,木質(zhì)素過氧化酶顯著降低,分析原因可能與此時(shí)碳氮比的變化有關(guān)。
圖2 堆肥過程中漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶酶活力變化Figure 2 Changes of laccase, manganese peroxidase and lignin peroxidase activity during composting
2.3.3 木質(zhì)素和纖維素降解率測定結(jié)果 木質(zhì)素是一種在自然界中廣泛存在的有機(jī)高分子化合物,多存在于植物的細(xì)胞壁中[32]。木質(zhì)素的完全降解由細(xì)菌、放線菌和真菌共同參與,其中真菌起重要作用[33]。由圖3可看出:添加菌劑的處理木質(zhì)素與纖維素降解率均高于ck,T3木質(zhì)素降解率達(dá)46.65%,其次是T2,木質(zhì)素降解率為30.43%,而T1的木質(zhì)素降解率僅為21.74%。
圖3 不同處理的木質(zhì)素和纖維素降解率Figure 3 Degradation rate of lignin and cellulose in different treatments
纖維素是植物細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)成分,通常與半纖維素和木質(zhì)素結(jié)合在一起[34]。自然界中有許多微生物可以通過酶的作用分解植物殘?bào)w中的纖維素,但細(xì)胞壁中木質(zhì)素對纖維素起到保護(hù)作用,所以木質(zhì)素和纖維素的分解都受到限制[6]。由圖3可知:添加菌劑后可提高園林廢棄物堆肥中纖維素降解率,其中T1降解率為18.33%,T2降解率為16.67%,T3纖維素降解率最高,達(dá)30.00%。
綜上可知,T2木質(zhì)素降解率高于T1,說明自制固體菌劑對園林廢棄物中木質(zhì)素的降解效果較好。纖維素降解率結(jié)果顯示:T1略強(qiáng)于T2,這可能是因?yàn)槭惺劬鷦┲械木陮w維素降解能力較好,而自制固體菌劑中的菌株主要產(chǎn)生木質(zhì)素降解相關(guān)酶,對木質(zhì)素的降解效果較好。T3的木質(zhì)素降解率與纖維素降解率均高于T2,說明在考慮成本的前提下,需進(jìn)一步研究自制固體菌劑的添加量,以獲得最大經(jīng)濟(jì)效益。與王順利等[35]制備出堆肥菌劑CC-1相比,接菌量相當(dāng)?shù)那闆r下添加自制固體菌劑可使纖維素降解率提高11.68%,木質(zhì)素降解率提高46.65%。這可能與菌株No.11的特殊菌絲結(jié)構(gòu)有關(guān),同時(shí)說明自制固體菌劑可高效降解木質(zhì)素和纖維素。與尹爽等[36]研制的復(fù)合菌劑相比,添加自制固體菌劑木質(zhì)素降解率較高,可能是因?yàn)樽灾乒腆w菌劑更易于微生物在堆肥中均勻生長,能極大程度地發(fā)揮降解作用。自制固體菌劑可以較好地分解園林廢棄物中的木質(zhì)素,并能提高纖維素降解率。
木質(zhì)素降解菌No.11的最佳固定化條件為:接菌量10%、保護(hù)劑體積分?jǐn)?shù)8%、含水率15%。在此條件下,獲得的固體菌劑成品保存30 d后,其有效活菌數(shù)達(dá)1.26×1011CFU·g?1,符合GB 20287?2006《農(nóng)用微生物菌劑》的要求。
添加自制固體菌劑的堆肥產(chǎn)品pH為8.01,達(dá)到NY 525?2002《有機(jī)肥料》標(biāo)準(zhǔn),EC為0.34 mS·cm?1,D(465)/D(665)為6.26,IG達(dá)118%,對植物無毒。
堆肥中添加自制木質(zhì)素降解固體菌劑有利于木質(zhì)素降解酶系的產(chǎn)生,漆酶、錳過氧化物酶和木質(zhì)素過氧化物酶的酶活力均得到提升。與不添加菌劑相比,木質(zhì)素降解率提高23.91%,纖維素降解率提高8.34%;0.5%接種比例下,與EM菌相比,纖維素降解率未提高,木質(zhì)素降解率提高8.69%。